egcg對小鼠骨髓細(xì)胞的保護(hù)作用

egcg對小鼠骨髓細(xì)胞的保護(hù)作用

茶多酚（tp）是一種復(fù)雜、相對分子質(zhì)量不同、性質(zhì)和結(jié)構(gòu)不同的多酚類衍生物的混合體。這是茶葉的主要化學(xué)成分，占茶葉干重的18%36%。茶多酚賦予了茶葉風(fēng)味與保健功能,對茶葉品質(zhì)的影響最顯著,在茶葉生物化學(xué)中研究最廣泛、最深入。同時(shí)茶多酚在醫(yī)藥、食品、日用化學(xué)品等新興應(yīng)用領(lǐng)域也受到了科學(xué)工作者越來越多的關(guān)注。自20世紀(jì)90年代后,隨著“綠色化學(xué)”口號在化學(xué)界的提出,國內(nèi)外更多的研究人員致力于利用多學(xué)科知識及各種先進(jìn)手段,對茶多酚的生產(chǎn)過程更加追求精細(xì)化,這對于將茶多酚這一天然資源更好地發(fā)揮功效,更好地服務(wù)于人類有深遠(yuǎn)意義。在這一趨勢中,科學(xué)工作者已經(jīng)越來越多將注意力集中于茶多酚的主體部分——兒茶素(占茶多酚的70%~80%),尤其是兒茶素中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯[(-)-epigollatecatechingallate,(-)-EGCG)]最引人注目。EGCG是茶葉特有的兒茶素,其量最高,占茶多酚制品的40%~50%。它是2-連苯酚基苯并吡喃與沒食子酸形成的酯,具有酚類抗氧化劑的通用性,同時(shí)因其結(jié)構(gòu)中有6個(gè)鄰位酚羥基而有優(yōu)于其他兒茶素的許多性質(zhì)。本文針對各國學(xué)者以EGCG藥理作用研究,尤其是對它優(yōu)于其他兒茶素單體的比較研究,及EGCG提純制備方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。1egcg的藥理研究1.1潛在的肺癌藥物EGCG的抗腫瘤作用已經(jīng)得到了各國相關(guān)研究人員的認(rèn)可,而且已經(jīng)被列為一種潛在的抗癌新藥在中美等許多國家進(jìn)行研究。研究人員主要從以下方面入手,研究了EGCG對各種腫瘤的作用機(jī)制。1.1.1ecgg作用給SENCAR小鼠外用TP,發(fā)現(xiàn)它對佛波酯和其他皮膚促癌劑有強(qiáng)的抑制作用,且各兒茶素單體中以EGCG作用最強(qiáng)。梁剛等以昆明純種小鼠的骨髓細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料,以環(huán)磷酰胺(CP)誘發(fā)的微核(MN)率和姐妹染色單體互換(SCE)頻率為指標(biāo),研究EGCG對CP誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞MN和SCE的影響,發(fā)現(xiàn)EGCG對MN和SCE均具明顯抑制作用。1.1.2ecgg對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響EGCG可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435的增殖活性,且EGCG處理細(xì)胞株24h后可檢測到p21mRNA和蛋白表達(dá)提高,說明EGCG可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖,推測機(jī)制可能與誘導(dǎo)p21表達(dá)從而抑制細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換有關(guān)。用MTT法測定EGCG對甲狀腺癌FRO細(xì)胞生長的影響,發(fā)現(xiàn)EGCG顯著抑制FRO細(xì)胞的增殖,且隨著EGCG濃度的增加,FRO細(xì)胞的端粒酶活性逐漸降低,為EGCG應(yīng)用于甲狀腺癌的臨床治療提供了理論依據(jù)。1.1.3細(xì)胞拓?fù)鋵?dǎo)構(gòu)酶及體外放射線突變Suzuki等研究了EGCG對取自人結(jié)腸癌COLO201、子宮頸癌HeLa、肺癌A549細(xì)胞和非洲綠猴腎Vero細(xì)胞的拓?fù)鋵?dǎo)構(gòu)酶Ⅰ及取自人胎盤的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的抑制作用。結(jié)果表明EGCG對25種酶均有強(qiáng)的抑制作用。1.1.4ecgg對腸道細(xì)胞凋亡表達(dá)的影響研究EGCG誘導(dǎo)大腸癌LoVo細(xì)胞、胃癌MGC-803細(xì)胞和肝癌BEL-7402細(xì)胞凋亡的作用及其凋亡相關(guān)基因bc1-2表達(dá)的影響。結(jié)果EGCG對這3種消化道細(xì)胞生長均具有抑制作用。張星海等發(fā)現(xiàn)兒茶素單體對前列腺癌細(xì)胞具有明顯的抑制和誘導(dǎo)凋亡作用,且作用效果順序?yàn)镋GCG>表兒茶素沒食子酸酯(ECG)>表沒食子兒茶素(EGC)。1.1.5mdr1-mrna的聯(lián)合應(yīng)用梁鋼等研究兒茶素成分ECG、EGCG對人耐藥肝癌細(xì)胞BEL-7404/A和耐藥口腔細(xì)胞KBV200的細(xì)胞毒增敏作用,發(fā)現(xiàn)這2種兒茶素成分與抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用可使P糖蛋白(p-gp)表達(dá)下降,能提高細(xì)胞內(nèi)羅丹明-123(Rh-123)的量,證明EGCG、ECG與阿霉素(ADM)或長春新堿(VCR)聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)藥物對腫瘤細(xì)胞BEL-7404/A和耐藥口腔細(xì)胞KBV200的細(xì)胞毒作用,并推測機(jī)制可能與降低腫瘤多藥耐藥基因MDR1-mRNA表達(dá)、下調(diào)P-gp表達(dá)及抑制P-gp的功能有關(guān)。為發(fā)現(xiàn)新的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑和可能的作用靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1.1.6gcg對k-b/b蛋白凝膠的封閉作用所謂封閉作用是指抑制促癌物與其受體之間的反應(yīng)。觀察EGCG對蛋白激活酶C(PKC)及蛋白磷酸酶2A(PP2A)的封閉作用,發(fā)現(xiàn)EGCG可通過抑制各種配合體與蛋白質(zhì)的反應(yīng)從而對PKC、PP2A有良好的封閉效果。1.1.7mda-mb-33基因型的變化魯藜等觀察了EGCG對人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231黏附和侵襲運(yùn)動能力的影響,EGCG處理后,MDA-MB-231對細(xì)胞外基質(zhì)成分的黏附能力降低,同時(shí)侵襲能力降低。1.1.8ecgg的干預(yù)作用為了研究EGCG對鼻咽癌細(xì)胞激活蛋白1(AP-1)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的干預(yù)作用,用MTT、間接免疫熒光等多種方法觀察EGCG對AP-1、G-JanN-末端激酶(JNK)、c-Jun基因、細(xì)胞周期素D1(cyclinD1)等多個(gè)靶點(diǎn)分子的作用情況,發(fā)現(xiàn)EGCG對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的這些靶點(diǎn)均具有干預(yù)作用。1.1.9抗突變作用Kuroda用中國大倉鼠V79細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn),EGCG對V79細(xì)胞中由4-硝基喹啉-1的氧化物誘導(dǎo)產(chǎn)生的p-硫鳥嘌呤具有抗突變效果。1.1.1不同組分間的cyp1a轉(zhuǎn)錄作用的比較有人對兒茶素單體抑制芳烴受體對人類基因CYP1A1和CYP1A2轉(zhuǎn)錄作用的影響進(jìn)行了比較研究,發(fā)現(xiàn)在對對位-(2,3,7,8-四氯聯(lián)苯)二雜芑誘導(dǎo)的芳烴與DNA鍵合及一系列的CYP1A轉(zhuǎn)錄的抑制作用中,兒茶素各單體只有EGCG在發(fā)揮作用。1.2其他抗氧化化合物許多研究已經(jīng)揭示了TP的抗腫瘤、抗衰老等多種生物活性均與其抗氧化性有關(guān),而且在各種TP抗癌的機(jī)制中,TP的抗氧化作用占有非常重要的地位。TP通過清除自由基、抑制過氧化、增強(qiáng)其他抗氧化劑作用等起到抗氧化作用。但在這些作用中,還是EGCG在發(fā)揮著主要功效。Guo等用ESR和化學(xué)發(fā)光技術(shù),研究了兒茶素4種單體對超氧自由基的清除作用,結(jié)果表明以(-)-EGCG的清除能力最強(qiáng)。Osada等對兒茶素抑制膽固醇及低濃度脂肪蛋白氧化的作用進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)兒茶素抗銅促氧化能力順序?yàn)镋GCG=ECG>表兒茶素(EC)>C>EGC。祁祿等通過體外培養(yǎng)的HipG2肝腫瘤細(xì)胞中NAD(P)H-醌還原酶(QR)的活性,對茶葉中的單體誘導(dǎo)代謝解毒酶活性的能力進(jìn)行了比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGCG作用有顯著性。1.3茶飲露用天然藥劑茶多酚的除臭、防齲功能已經(jīng)被許多專家認(rèn)可,并且已經(jīng)應(yīng)用于日用化工產(chǎn)品中。如中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所研制的花露水—茗香露,保潔公司生產(chǎn)的佳潔士茶爽牙膏等。用氣相色譜法研究兒茶素消除三甲胺、硫化氫、吲哚氣味的機(jī)制,實(shí)驗(yàn)顯示,兒茶素各單體的消臭能力:EGCG>EGC>ECG>EC。1.4g抗氧化酶系統(tǒng)宋秀祖等研究了EGCG對紫外線輻射氧化損傷的保護(hù)機(jī)制,結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGCG能減少中波紫外線(UVB)輻射引起的丙二醛沉積,增加抗氧化酶的活性;并且可能抑制由UVB誘導(dǎo)的MMP1mRNA表達(dá),減少膠原蛋白的降解。從而說明EGCG可以對UVB輻射損傷的體外培養(yǎng)的纖維細(xì)胞起到保護(hù)作用。1.5種茶多酚的抑菌效果TP的抑菌作用已經(jīng)有許多報(bào)道,但一般認(rèn)為,具有沒食子基的EGCG、ECG比EC及ECG強(qiáng)。潘素君選用了大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌、枯草桿菌、沙門氏菌及多種霉菌和酵母菌為供試菌株,觀察幾種茶多酚的抑菌情況,發(fā)現(xiàn)多金農(nóng)脫咖啡因兒茶素比金農(nóng)大葉兒茶素和金農(nóng)小葉和兒茶素的抑菌效果強(qiáng),而前者中EGCG的量恰恰比后兩者高。在對口腔細(xì)菌Porphyromonalgingivalis生長的抑制作用中,兒茶素各單體作用能力:EGCG>ECG>>EC、ECG。2制備ecgg的工藝隨著人們對EGCG研究的深入,以及EGCG許多藥理作用被進(jìn)一步證實(shí),分離制備EGCG單體純品已經(jīng)成為深入研究與應(yīng)用的需要。近年來,國內(nèi)外有許多關(guān)于提純制備EGCG的研究,利用了許多新興分離、制備方法,但主要還是以色譜分離為主。原理是利用兒茶素各單體之間的性質(zhì)差異,選擇不同的吸/脫附劑,使之得到分離。2.1純品的制備以綠茶萃取物為原料,直接上填料柱,選用合適的洗脫劑進(jìn)行等度或梯度洗脫,并定性收集無交叉的流份,從而得到EGCG純品。將茶多酚上硅膠柱后,用醋酸乙酯-甲苯進(jìn)行梯度洗脫,對洗脫成分每隔2h取樣一次,進(jìn)行薄層色譜分離,FeCl3顯色,定性收集無交叉成分的洗脫樣品,進(jìn)行準(zhǔn)確減壓蒸餾,干燥,分離可得到EGCG、ECG、EC3種兒茶素單體,質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為98.7%、99.2%、98.6%,且其中EGCG占茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為51.6%。2.2洗脫溶劑和提取以綠茶提取物為原料,經(jīng)柱色譜除去雜質(zhì),并將兒茶素中幾種單體預(yù)分離為幾個(gè)組分后,再用制備型HPLC分離其中含EGCG的組分,可得到EGCG純品。戚向陽等以綠茶為原料,經(jīng)乙醇浸提、濃縮、脫色和萃取,得到茶多酚粗品,上葡聚糖凝膠LH-20色譜柱,用40%丙酮水溶液作為洗脫劑洗脫,使茶多酚粗品預(yù)分離為3個(gè)組分。其中一個(gè)為單一組分,經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定為EGCG。還有一個(gè)組分為酯型兒茶素混合物,將其用制備型HPLC分離純化,結(jié)果該組分得到很好的分離,經(jīng)鑒定,分別為EGCG和ECG。王洪新等,以茶提取物為原料,先經(jīng)SephadexLH-20柱色譜,用丙酮-水梯度洗脫,收集4個(gè)流份,其中流份Ⅲ包含:EGCG、ECG、GCG。再用半制備型HPLC分離純化,得到7種兒茶素單體化合物,且質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在99%以上,總產(chǎn)率為66.7%,總收率為82.1%。2.3柱色譜法分離egg單體以綠茶提取物或茶多酚為原料,經(jīng)有機(jī)溶劑多次萃取,除去雜質(zhì),提高兒茶素總純度后,再用柱色譜法分離可得EGCG單體。張星海等以綠茶提取物或茶多酚為原料,先經(jīng)醋酸乙酯、氯仿2種試劑多次富集和脫除咖啡因和色素,得到兒茶素不低于95%的茶多酚,再經(jīng)SephadexLH-20柱色譜,以40%乙醇水溶液洗脫,收集第2個(gè)餾份,得到EGCG單體。2.4兒茶素單體分離以兒茶素粗品為原料,選擇、優(yōu)化出合適的柱操作條件,直接用HPLC分離出兒茶素單體。鐘世安等以粗兒茶素粉末為原料,采用反相高效液相色譜技術(shù),收集相應(yīng)的餾份,再經(jīng)P-1大孔樹脂,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮洗脫液,冷凍干燥后,得到EGCG、GCG、ECG3種酯型兒茶素單體。2.5分離克級數(shù)樣品是一種較新型的液-液分配技術(shù),于1982年由Ito首創(chuàng),并在1994年將其改進(jìn)后,進(jìn)樣量增大,能夠分離克量級的樣品。張瑩等用自制的制備型逆流色譜分離純化,采用了另一組是正丁醇-酯酸乙酯-水(0.2∶1∶2)系統(tǒng),石油醚-乙酸乙酯-水(0.2∶1∶2)溶劑系統(tǒng),結(jié)果使EGCG、GCG、ECG、EC得到了很好的分離,且每一種單體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到了98%,其中EGCG達(dá)到了99%。2.6纖維素的單體利用兒茶素能與某些金屬形成金屬鹽沉淀,再用酸將其沉淀溶解,最后用柱色譜法除雜質(zhì),可得到酯型兒茶素的單體。唐課文等選用ZnCl2作沉淀劑,在pH值為5.6~6.5的條件下,使兒茶素以金屬鹽的形式沉淀,沉淀物經(jīng)洗滌后,用40%的硫酸溶解,將溶解液直接上聚酰胺樹脂柱,蒸餾水洗去無機(jī)離子后再用乙醇洗脫,洗脫液濃縮、干燥,得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于99%的高純酯型兒茶素,其中含EGCG64%。2.7柱色譜法和hplc法分離超臨界流體萃取技術(shù)是近20年才發(fā)展起來的新型分離技術(shù)。宓曉黎等以茶葉為原料,以甲醇為改性劑在CO2的超臨界壓力和溫度條件下進(jìn)行萃取,對改性劑、超臨界流體性質(zhì)、靜態(tài)萃取時(shí)間和動態(tài)萃取流體CO2的量對萃取率的影響分別作了考察,確定了最佳萃取條件。對將超臨界流體萃取法應(yīng)用于制備EGCG的工業(yè)化作了有益的探索。目前EGCG的提純制備,主要是采用色譜法或色譜聯(lián)用的方法。其中HPLC法,操作簡便易行,分離效果好,而且,如果選擇合適的柱操作條件,兒茶素粗品可以不經(jīng)過預(yù)處理就能得到較好的分離。但該法成本較高,且分離最小,難以大量制備EGCG純品。高效逆流色譜法盡管較HPLC法增大了制備量,但仍難滿足大量制備EGCG及工業(yè)化生產(chǎn)的要求。柱色譜法分離制備EGCG盡管操作比較煩瑣,但處理樣品量大,尤其以大孔樹脂作吸附劑,可以反復(fù)再生,重復(fù)利用,大大降低成本,將是工業(yè)化生產(chǎn)EGCG的良好選擇。但是,如何選用合適的柱填料,優(yōu)化柱操作條件,提高柱分離的效率,仍將是一個(gè)需要繼續(xù)試驗(yàn)與探索的問題。另外,也有人將超