微生物檢驗(yàn)規(guī)范

微生物檢查規(guī)范1.目的明確微生物檢查辦法和監(jiān)控原則，規(guī)范微生物檢查的各項(xiàng)操作，通過(guò)對(duì)原料、產(chǎn)品及生產(chǎn)線各規(guī)定環(huán)節(jié)進(jìn)行微生物測(cè)試，從檢測(cè)成果來(lái)鑒定原料、產(chǎn)品及生產(chǎn)線微檢監(jiān)控點(diǎn)的微生物狀況與否符合公司和國(guó)家規(guī)定的原則，確保產(chǎn)品品質(zhì)。2.合用范疇公司全部需要作微生物檢查的原料、每批產(chǎn)品及微檢監(jiān)控點(diǎn)。3.職責(zé)品保微生物檢查員負(fù)責(zé)微生物檢查實(shí)驗(yàn)器材和無(wú)菌室的準(zhǔn)備工作。品保微生物檢查員負(fù)責(zé)原料和生產(chǎn)線微檢監(jiān)控點(diǎn)的微檢樣品抽樣、保存、登記和微生物檢測(cè)工作。成品制程人員負(fù)責(zé)成品微檢樣品的抽樣工作，品保微生物檢查員負(fù)責(zé)成品微檢樣品的保存、登記和微生物檢測(cè)工作。品保微生物檢查員負(fù)責(zé)出具檢測(cè)報(bào)告并作出符合性鑒定。品保科長(zhǎng)負(fù)責(zé)微生物檢測(cè)報(bào)告的審核。4.作業(yè)程序?qū)嶒?yàn)器材4.1.11．超凈工作臺(tái)2．恒溫培養(yǎng)箱36±1℃3．低溫培養(yǎng)箱25-28℃4．恒溫水浴鍋46±1℃5．電子/托盤天平（精確到0.1g）6．高壓蒸汽殺菌鍋7．烘箱8．酒精燈9．記號(hào)筆10．打火機(jī)11．鑷子12．藥匙13.生物濾膜14．培養(yǎng)皿9cm/6cm15.錐形瓶300ml/500ml+硅橡膠塞16．試管17．小發(fā)酵管18．試管架19．接種環(huán)20．顯微鏡21．塑料籃子22．移液管1ml、5ml、10ml23.膜過(guò)濾設(shè)備24.醫(yī)用不銹鋼剪刀培養(yǎng)基和試劑1．總菌數(shù)培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基2．大腸菌群培養(yǎng)基結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）3.霉菌、酵母菌培養(yǎng)基虎紅培養(yǎng)基4．氯化鈉6．乙醇7．二氧化氯粉劑8.過(guò)氧乙酸檢查所需器具的滅菌4.2.1.1培養(yǎng)皿及干凈干燥的培養(yǎng)皿，倒放于專用培養(yǎng)皿鐵筒內(nèi)，干凈干燥的移液管，尖端朝下，置于移液管專用的鐵筒內(nèi)，把鐵筒放在烘箱中，于120℃干熱滅菌120分鐘后，調(diào)至160-180℃干熱滅菌120分鐘后，關(guān)掉烘箱，自然冷卻至60錐形瓶及移液管的濕熱滅菌干凈的錐形瓶，塞上硅橡膠塞并用牛皮紙包扎好瓶口，干凈的移液管，用牛皮紙包扎完善后，置于蒸汽滅菌鍋中，于121℃濕熱滅菌20分鐘即可。鑷子、接種環(huán)等的火焰滅菌接種環(huán)、鑷子要在酒精燈上須灼燒過(guò)方可使用；稀釋操作時(shí)試管口應(yīng)在火焰上方；培養(yǎng)基容器口邊在火焰上方。化學(xué)滅菌（75%酒精、100×10-6ClO2）無(wú)菌超凈臺(tái)，手部及不能加熱滅菌的PE或塑膠制品，桌子等需用化學(xué)滅菌法；操作臺(tái)、桌子、凳子、地面在使用完后均用100×10-6ClO2擦洗滅菌。培養(yǎng)基及其緩沖稀釋液的配制和濕熱滅菌%生理鹽水的配制稱取2.25g氯化鈉，溶于250ml4.2.2.275%酒精的配制取375ml無(wú)水酒精，則需加水375/=125ml4.2.2.3培養(yǎng)基的配制和滅菌條件測(cè)定項(xiàng)目培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)基量/1000ml蒸餾水殺菌條件菌落總數(shù)平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基121℃×15分鐘大腸菌群結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂煮沸滅菌2分鐘大腸菌群煌綠乳糖膽鹽40g121℃×15分鐘霉菌酵母虎紅培養(yǎng)基35g121℃×20分鐘滅菌完全后的培養(yǎng)基置于46±1℃的水浴鍋中,待培養(yǎng)基的溫度降至46±1℃方可用.濕熱滅菌的環(huán)節(jié)：（1）檢查蒸壓釜中有否足夠的水。（2）檢查全部載有液體瓶子的螺旋蓋（或塞）與否有松動(dòng)。（3）檢查各待滅菌物品與否已用牛皮紙包裹完善。（4）小心地關(guān)好殺菌釜的蓋/門。除非每個(gè)鎖都已徹底鎖緊，否則不得加壓。（5）檢查排氣道或排氣閥與否打開(kāi)。（6）加熱，使全部空氣從排氣道中隨著蒸汽自動(dòng)排出。蒸汽要激烈排放2-3min，以確保蒸壓釜內(nèi)冷空氣全部排出。關(guān)閉通風(fēng)閥或排氣閥。（7）繼續(xù)加熱，至達(dá)成預(yù)定壓力及溫度。設(shè)備和培養(yǎng)基將在121℃下維持20min，以進(jìn)行滅菌。所需壓力要持續(xù)維持一定時(shí)間。（8）所需加熱時(shí)間一過(guò)，停止加熱。在排氣閥不打開(kāi)的狀況下讓壓力自動(dòng)下降到零。否則不要打開(kāi)蒸壓釜。當(dāng)壓力為零時(shí)，小心打開(kāi)排氣閥，待蒸氣排盡后，打開(kāi)蒸壓釜蓋，讓它敞開(kāi)幾分鐘以泄去多出的熱蒸汽，并將釜內(nèi)原載有的物品充足冷卻。（9）取出釜內(nèi)原載有培養(yǎng)基或生理鹽水的瓶子，將這些瓶子寄存在無(wú)菌室的傳遞箱中待之冷卻備用。滅菌完畢后的培養(yǎng)基，溫度降至46±1℃方可使用。全部滅菌完畢后的物品，在使用前都必須保持包裹完善無(wú)破損的狀態(tài)。4.2.3無(wú)菌室及超凈臺(tái)的滅菌4.2.3.1每天實(shí)驗(yàn)前、后把無(wú)菌室地面及超凈臺(tái)清掃干凈，每天用100×10-6ClO2消毒桌面、地面。每月用2%過(guò)氧乙酸熏蒸。4.2.3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)束后打開(kāi)紫外燈對(duì)無(wú)菌室空間和表面進(jìn)行殺菌1小時(shí)。4.2.3.3實(shí)驗(yàn)前，提前1小時(shí)打開(kāi)超凈臺(tái)紫外燈及無(wú)菌室紫外燈。關(guān)掉紫外燈后，打開(kāi)無(wú)菌室和超凈臺(tái)通風(fēng)裝置，30分鐘后，即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。.樣品的抽樣和鑒定原則4.3.1實(shí)驗(yàn)前應(yīng)登記樣品，給樣品編號(hào)，統(tǒng)計(jì)檢查時(shí)間、品項(xiàng)、規(guī)格、生產(chǎn)日期、批號(hào)、檢測(cè)項(xiàng)目等，并根據(jù)樣品數(shù)來(lái)配制培養(yǎng)基。樣品的抽樣和鑒定原則天然水的產(chǎn)品名，抽樣量、檢測(cè)項(xiàng)目、頻率、辦法、原則產(chǎn)品品項(xiàng)抽樣頻率檢查項(xiàng)目檢查辦法檢查原則檢查時(shí)間550ml/1.2正常：1瓶/2小時(shí)/線開(kāi)（關(guān)）機(jī)：2瓶/線細(xì)菌總數(shù)濾膜法≤50個(gè)/100ml恒溫室放置2天后檢查大腸菌群濾膜法不得檢出霉菌酵母濾膜法≤20個(gè)/100ml細(xì)菌總數(shù)GB-4789≤20個(gè)/ml霉菌酵母GB-4789≤5個(gè)/ml備注：按抽樣頻率，檢查辦法二分之一采用GB-4789，二分之一采用濾膜法。生產(chǎn)線微檢監(jiān)控點(diǎn)的樣品的抽樣和鑒定原則各監(jiān)控點(diǎn)名，抽樣量、檢測(cè)項(xiàng)目、頻率、辦法、原則線別監(jiān)控點(diǎn)檢查項(xiàng)目檢查辦法原則規(guī)定檢查頻率水解決源水菌落總數(shù)取適宜的稀釋倍數(shù)做濾膜法監(jiān)控項(xiàng)目1次/周大腸菌群霉菌酵母砂濾出水，碳罐出水菌落總數(shù)取適宜的稀釋倍數(shù)做濾膜法監(jiān)控項(xiàng)目1次/維護(hù)后大腸菌群霉菌酵母精濾出水菌落總數(shù)取適宜的稀釋倍數(shù)做濾膜法監(jiān)控項(xiàng)目1次/天大腸菌群霉菌酵母RO膜系統(tǒng)出水菌落總數(shù)濾膜法≤10cfu/100ml1次/維護(hù)后大腸菌群0cfu/100ml霉菌酵母≤5cfu/100ml精濾UV后出水菌落總數(shù)濾膜法≤50cfu/100ml1次/天大腸菌群0cfu/100ml霉菌酵母≤50cfu/100ml膜出水、膜產(chǎn)水儲(chǔ)罐、兌制水儲(chǔ)罐、兌制水UV后、菌落總數(shù)濾膜法≤10cfu/100ml1次/天大腸菌群0cfu/100ml霉菌酵母≤5cfu/100ml氧化塔出水、洗瓶水菌落總數(shù)濾膜法≤3cfu/100ml1次/天大腸菌群0cfu/100ml霉菌酵母0cfu/100ml水線灌裝頭（開(kāi)機(jī)前）菌落總數(shù)霉菌酵母擦拭法≤2個(gè)/每灌裝頭1次/周灌裝頭≤5個(gè)/每灌裝頭洗瓶頭（開(kāi)機(jī)前）≤2個(gè)/每洗瓶頭洗瓶頭≤5個(gè)/每灌裝頭封蓋頭≤5個(gè)/10cm2蓋滑槽≤5個(gè)/10cm2撥蓋星輪≤5個(gè)/10cm2蓋貯存槽≤5個(gè)/10cm2蓋斗≤5個(gè)/10cm2蓋輸送帶≤5個(gè)/10cm2洗瓶夾≤5個(gè)/10cm2門內(nèi)壁≤20個(gè)/10cm2充填槽外壁或頂部≤20個(gè)/10cm2風(fēng)送軌道≤20個(gè)/10cm2輸送帶（靠近灌裝機(jī)）≤20個(gè)/10cm2沖洗后空瓶平均≤2個(gè)/瓶蓋下滑道中蓋平均≤2個(gè)/蓋操作人員手部≤50個(gè)/雙手操作人員衣服≤50個(gè)/10cm2微生物檢測(cè)辦法4.4.1濾膜法:合用于進(jìn)行濾膜法檢測(cè)的多個(gè)微檢樣品。4.4.1.1儀器：冰箱：0～4℃；恒溫培養(yǎng)箱：36±1℃/25-28℃；恒溫水浴鍋：46±1℃滅菌平皿:直徑60mm或90mm；膜過(guò)濾設(shè)備；濾杯；μm濾膜；超凈工作臺(tái)；真空泵；高壓滅菌鍋；滅菌的剪子、鑷子、玻璃瓶及其它物品。4.4.1.2試劑與培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基、虎紅培養(yǎng)基、煌綠乳糖膽鹽培養(yǎng)基，%生理鹽水，121℃滅菌20min；結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂煮沸滅菌2min；75%乙醇；100ppm二氧化氯。4.4.1.3操作環(huán)節(jié):（1）將樣品搖勻，取100ml倒入膜過(guò)濾裝置中，打開(kāi)抽濾泵，開(kāi)始抽濾，抽干濾液后關(guān)上抽濾泵。（2）將鑷子在火焰上滅菌，膜用滅菌過(guò)的鑷子取下，在火焰旁正面貼于預(yù)先制備的培養(yǎng)基平皿中，平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基用于培養(yǎng)菌落總數(shù)，虎紅瓊脂培養(yǎng)基用于培養(yǎng)霉菌和酵母菌，VRBA培養(yǎng)基用于培養(yǎng)大腸菌群，膜下避免出現(xiàn)氣泡。（3）培養(yǎng)a.菌落總數(shù)：倒置于36±1℃的恒溫箱中，培養(yǎng)48h±2h。菌落總數(shù)以實(shí)際菌數(shù)報(bào)告之，單位為cfu/100ml或cfu/ml。b.霉菌和酵母菌：倒置于25-28℃恒溫箱中，3d后開(kāi)始觀察，共培養(yǎng)觀察5d。菌落總數(shù)以實(shí)際菌數(shù)報(bào)告之，單位為cfu/100ml或cfu/ml。c.大腸菌群①倒置于36±1℃的恒溫箱中，培養(yǎng)18h-24h。取出平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周邊有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為或更大。②從VRBA平板上挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36±1℃培養(yǎng)24h~48h，觀察產(chǎn)氣狀況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。③大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告：經(jīng)最后證明為大腸菌群陽(yáng)性的試管比例乘以①中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每100ml樣品中大腸菌群數(shù)。例：在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證明有6個(gè)陽(yáng)性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×6/10/100ml=60cfu/100ml。4.4.2國(guó)標(biāo)法：合用于不能用濾膜法檢測(cè)的多個(gè)微檢樣品以及規(guī)定用國(guó)標(biāo)法檢測(cè)的樣品。4.4.2.1菌落總數(shù)4.4.2.設(shè)備與材料：冰箱：0～4℃；恒溫培養(yǎng)箱：36±1℃；恒溫水浴鍋：46±1℃；電子天平：精確至；滅菌吸管；滅菌平皿：直徑90mm或60mm；超凈工作臺(tái)；高壓滅菌鍋及其它物品。4.4.2.培養(yǎng)基與試劑：平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，%生理鹽水，121℃滅菌20min；75%乙醇；100×10-6ClO2溶液。4.4.2.操作環(huán)節(jié)：（1）樣品稀釋及培養(yǎng)a.以無(wú)菌操作取樣品。b.取樣品25（g）ml加入到225ml滅菌生理鹽水中，經(jīng)充足混勻制成1：10的樣品勻液。c.用1ml滅菌吸管吸取1:10稀釋液1ml，沿管壁漸漸注入盛有9ml滅菌生理鹽水的試管內(nèi)（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液液面），振搖試管，混合均勻，做成1:100的稀釋液。d.另取1ml滅菌吸管，按上述操作辦法，制備10倍系列遞增稀釋樣品勻液，如此每遞增稀釋一次，即換用1支1ml滅菌吸管。e.根據(jù)食品衛(wèi)生原則規(guī)定或?qū)υ嚇游廴緺顩r預(yù)計(jì)，選擇2個(gè)-3個(gè)適宜稀釋度（液體樣品可涉及原液），對(duì)于菌數(shù)較少的樣品，采用原倍。在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1ml樣品勻液加入兩個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)，同時(shí)分別取1ml稀釋液加入無(wú)菌平皿中作空白對(duì)照。及時(shí)將6-7ml或15-20ml冷卻至46℃的培養(yǎng)基傾注入平皿。采用原倍培養(yǎng)的，直接將培養(yǎng)基注入培養(yǎng)皿中作為空白。f.待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36℃±1℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h。(2)菌落計(jì)數(shù)可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器。統(tǒng)計(jì)稀釋倍數(shù)和對(duì)應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（CFU）表達(dá)。a.選用菌落數(shù)在30-300CFU之間、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板統(tǒng)計(jì)具體菌落數(shù)，不不大于300的可統(tǒng)計(jì)為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。b.其中一種平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不適宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的二分之一，而其它二分之一中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2，代表一種平板菌落數(shù)。c.當(dāng)平板上出現(xiàn)菌藻間無(wú)明顯界限的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，則將每條單鏈作為一種菌落計(jì)數(shù)。(3)菌落總數(shù)的計(jì)算辦法a.若只有一種稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范疇內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克（或毫升）中菌落總數(shù)成果。b.若有兩個(gè)持續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范疇內(nèi)時(shí)，按下式計(jì)算：N=∑C/（n1+）d式中：N——樣品中菌落數(shù)；∑C——平板（含適宜范疇菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；n1——第一種適宜稀釋度平板上的菌落數(shù)；n2——第二個(gè)適宜稀釋度平板上的菌落數(shù)；d——稀釋因子（第一稀釋度）。c.若全部稀釋度的平板上菌落數(shù)均不不大于300，則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其它平板可統(tǒng)計(jì)為多不可計(jì)，成果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。d.若全部稀釋度的平板菌落數(shù)均不大于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。e.若全部稀釋度（涉及液體樣品原液）平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以不大于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。f.若全部稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30-300之間，其中一部分不大于30或不不大于300時(shí)，則以最靠近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。（4）菌落總數(shù)的報(bào)告a.菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字報(bào)告。b.不不大于或等于100時(shí)，第三位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約，取前兩位數(shù)字，背面用0替代位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來(lái)表達(dá)，按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字。c.若全部平板上為蔓延菌落而無(wú)法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延。d.若空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng)，則本次檢測(cè)成果無(wú)效。e.稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/mL為單位報(bào)告。酵母和霉菌設(shè)備與材料：冰箱：0-4℃；恒溫培養(yǎng)箱：25-28℃；恒溫水浴箱：46±1℃；電子天平：精確至0.1g；滅菌具塞錐形瓶：500ml；滅菌平皿:直徑90mm或60mm；滅菌試管及其它滅菌設(shè)備；4.4.2.培養(yǎng)基與試劑：虎紅培養(yǎng)基，%生理鹽水，121℃滅菌20min，75%乙醇，100×10-6ClO2溶液。4.4.2.操作環(huán)節(jié)（1）樣品稀釋及培養(yǎng)a.以無(wú)菌操作取樣品。b.取樣品25（g）ml加入到225ml滅菌生理鹽水中，經(jīng)充足混勻制成1：10的樣品勻液。c.用1ml滅菌吸管吸取1:10稀釋液1ml，沿管壁漸漸注入盛有9ml滅菌生理鹽水的試管內(nèi)（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液液面），振搖試管，混合均勻，做成1:100的稀釋液。d.另取1ml滅菌吸管，按上述操作辦法，制備10倍系列遞增稀釋樣品勻液，如此每遞增稀釋一次，即換用1支1ml滅菌吸管。e.根據(jù)食品衛(wèi)生原則規(guī)定或?qū)υ嚇游廴緺顩r預(yù)計(jì)，選擇2個(gè)-3個(gè)適宜稀釋度（液體樣品可涉及原液），對(duì)于菌數(shù)較少的樣品，采用原倍。在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1ml樣品勻液加入兩個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)，同時(shí)分別取1ml稀釋液加入無(wú)菌平皿中作空白對(duì)照。及時(shí)將6-7ml或15-20ml冷卻至46℃的培養(yǎng)基傾注入平皿。采用原倍培養(yǎng)的，直接將培養(yǎng)基注入培養(yǎng)皿中作為空白。f.待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置于25-28℃霉酵培養(yǎng)箱中。3d后開(kāi)始觀察，共培養(yǎng)觀察5d。(2)計(jì)算辦法：普通選擇菌落數(shù)在10-150之間的平皿進(jìn)行計(jì)數(shù)，同稀釋度的兩個(gè)平皿的菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（或毫升）檢樣中含霉菌和酵母數(shù)，稀釋度選擇及菌落報(bào)告方式可參考菌落總數(shù)的計(jì)數(shù)辦法。(3)報(bào)告：每克（或毫升）樣品中所含的霉菌和酵母菌數(shù)以cfu/g(ml)表達(dá)。4.4.2.3大腸菌群4.4.2.設(shè)備與材料：冰箱：0～4℃；恒溫培養(yǎng)箱：36±1℃；恒溫水浴鍋：46±1℃；電子天平：精確至；滅菌吸管；滅菌平皿：直徑90mm或60mm；超凈工作臺(tái)；高壓滅菌鍋及其它物品。4.4.2.培養(yǎng)基與試劑：煌綠乳糖膽鹽（BGLB），%生理鹽水，121℃滅菌20min；結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA），煮沸滅菌2分鐘；75%乙醇；100×10-6ClO2溶液。4.4.2.操作環(huán)節(jié)(1)樣品稀釋a.以無(wú)菌操作取樣品。b.取樣品25（g）ml加入到225ml滅菌生理鹽水中，經(jīng)充足混勻制成1：10的樣品勻液。c.用1ml滅菌吸管吸取1:10稀釋液1ml，沿管壁漸漸注入盛有9ml滅菌生理鹽水的試管內(nèi)（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液液面），振搖試管，混合均勻，做成1:100的稀釋液。d.另取1ml滅菌吸管，按上述操作辦法，制備10倍系列遞增稀釋樣品勻液，如此每遞增稀釋一次，即換用1支1ml滅菌吸管。e.根據(jù)食品衛(wèi)生原則規(guī)定或?qū)υ嚇游廴緺顩r預(yù)計(jì)，選擇2個(gè)-3個(gè)適宜稀釋度（液體樣品可涉及原液），對(duì)于菌數(shù)較少的樣品，采用原倍。在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1ml樣品勻液加入兩個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)，同時(shí)分別取1ml稀釋液加入無(wú)菌平皿中作空白對(duì)照。及時(shí)將6-7ml或15-20ml冷卻至46℃的培養(yǎng)基傾注入平皿。采用原倍培養(yǎng)的，直接將培養(yǎng)基注入培養(yǎng)皿中作為空白。(2)平板計(jì)數(shù)a.選用2個(gè)—3個(gè)適宜的持續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種兩個(gè)無(wú)菌平皿，每皿1mL。同時(shí)分別取1mL生理鹽水加入兩個(gè)無(wú)菌平皿作空白對(duì)照。b.及時(shí)將6-7ml或15-20ml冷至46℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）傾注于每個(gè)平皿中，小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充足混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL~4mLVRBA覆蓋平板表層，翻轉(zhuǎn)平板，置于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。（3）平板菌落的選擇選用菌落數(shù)在30—150之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周邊有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為或更大。（4）證明實(shí)驗(yàn)從VRBA平板上挑去10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，分別移種與BGLB肉湯管內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h，觀察產(chǎn)氣狀況，凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。（5）大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告經(jīng)最后證明為大腸菌群陽(yáng)性的試管比例乘以（3）中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（每毫升）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10—4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證明有6個(gè)陽(yáng)性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×6/10×10—4/g(mL)=×105(CFU/g)CFU/mL。附：大腸菌群檢查程序檢樣檢樣25g（25mL）樣品+225mL稀釋液，均質(zhì)稀釋稀釋選擇2個(gè)~3個(gè)適宜稀釋度的樣品均液，接種VRBA平板選擇2個(gè)~3個(gè)適宜稀釋度的樣品均液，接種VRBA平板36℃±1℃18h~24h計(jì)數(shù)典型和可疑菌落計(jì)數(shù)典型和可疑菌落BGLB肉湯或復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)BGLB肉湯或復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)36℃±1℃18h~24h報(bào)告報(bào)告4.4.3空氣落菌檢查4.4.3恒溫培養(yǎng)箱：36±1℃；霉酵培養(yǎng)箱：25℃~28℃；電子天平：精確至0.1g；滅菌平皿:直徑90mm；高壓滅菌鍋及其它物品。4.4.3虎紅培養(yǎng)基，平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，121℃滅菌20min。4.4.3.（1）在已通過(guò)滅菌的培養(yǎng)皿中分別傾注已通過(guò)滅菌后的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基和虎紅培養(yǎng)基，靜置使其自然凝固。（2）將已凝固的培養(yǎng)基正向放置于需檢測(cè)空氣落菌的地點(diǎn)，將培養(yǎng)皿的蓋取下,蓋口朝下,輕輕搭放在培養(yǎng)皿的邊沿。（3）將培養(yǎng)皿放置30分鐘后，蓋好培養(yǎng)皿蓋取回，菌落總數(shù)平板倒放于36±1℃恒溫箱中培養(yǎng)48h±2h，霉酵平板倒放于25-28℃低溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。（4）計(jì)數(shù)：可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。4.4.4空氣浮游菌檢查4.4.4浮游空氣塵菌采樣器；恒溫培養(yǎng)箱：36±1℃；霉酵培養(yǎng)箱：25-28℃，電子天平：精確至0.1g；滅菌平皿:直徑90mm；高壓滅菌鍋及其它物品。4.4.4虎紅培養(yǎng)基，平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，121℃滅菌20min。操作環(huán)節(jié)（1）在已通過(guò)滅菌的培養(yǎng)皿中分別傾注已通過(guò)滅菌后的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基或虎紅培養(yǎng)基，靜置使其自然凝固。（2）將浮游空氣塵菌采樣器置于被測(cè)區(qū)域，打開(kāi)采樣蓋，對(duì)采樣蓋進(jìn)行擦拭消毒，將預(yù)先制備的平皿開(kāi)口置于采樣器上，蓋上采樣蓋。設(shè)立采樣的流量為50L。（3）采樣結(jié)束后，打開(kāi)采樣蓋取出平皿蓋好。菌落總數(shù)平板倒放于36±1℃恒溫箱中培養(yǎng)48h±2h，霉酵平板倒放于25-28℃低溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。（4）計(jì)數(shù)：可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。4.4.5棉簽4.4.5擦拭用棉簽，%生理鹽水，121℃滅菌20min；酒精燈；75%酒精；記號(hào)筆；其它同菌落總數(shù)的檢測(cè)辦法。4.4.5平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、虎紅培養(yǎng)基4.4.5（1）將棉簽和生理鹽水121℃滅菌20min.（2）手經(jīng)75%酒精消毒后,或戴用酒精浸泡過(guò)的手套持棉簽的后端部擦拭；（3）擦拭：a.設(shè)備及其它平整的表面：用無(wú)菌棉簽擦拭10cm2面積的設(shè)備或其它平整的表面,來(lái)回涂擦兩遍，每擦拭一遍，將棉簽轉(zhuǎn)動(dòng)一次。如檢測(cè)表面狹長(zhǎng)，可使其總面積達(dá)成10cmb.灌裝頭或其它不規(guī)則表面：用無(wú)菌棉簽擦拭灌裝頭表面，盡量擦拭整個(gè)灌裝頭,來(lái)回涂擦兩遍，每擦拭一遍，將棉簽轉(zhuǎn)動(dòng)一次。c.手部:讓受試者張