高效液相色譜法測定藤茶組織培養(yǎng)后不同組織中二氫楊梅素的含量

高效液相色譜法測定藤茶組織培養(yǎng)后不同組織中二氫楊梅素的含量

藤茶俗稱茅巖草莓茶、端午節(jié)茶和藤班茶。它的學(xué)名是a.g洛斯代特。這是葡萄科，蛇葡萄屬于木質(zhì)藤本植物。它是粵蛇葡萄(A.cantoniesi)的變種,主要分布于廣東、廣西、云南、貴州、湖南、湖北、江西、福建等省。藤茶中主要活性成分二氫楊梅素在該植物幼嫩芽頭部位含量最高。二氫楊梅素(3,5,7,3′4′5′-六羥基-2,3雙氫黃酮醇dihydromyricetin,DMY)是一種多酚羥基雙氫黃酮醇,又稱蛇葡萄素,屬黃酮類化合物。二氫楊梅素除具有黃酮化合物的清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗腫瘤、消炎抑菌等普通特性外,其在解除醇中毒、降低血脂和血糖水平,提高SOD活性以及保肝護(hù)肝等方面具有特殊功效,具有明顯拮抗Na和高K所致的兔胸主動脈條收縮反應(yīng)及鈣拮抗作用,且毒性低,可作為抗心律失常、心肌缺血、高血壓的新型藥物。試驗采用高效液相色譜法(HPLC)測定藤茶嫩葉、葉片、老葉、果實、愈傷組織、懸浮培養(yǎng)液中二氫楊梅素的含量,重點探討了愈傷組織培養(yǎng)法生產(chǎn)二氫楊梅素的可行性。1材料和方法1.1試驗材料1.1.1紫外可見光檢測儀器Agilent1100Series高效液相色譜儀,L27420紫外可見光檢測器,BF22002色譜工作站,AL204萬分電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。1.1.2試劑二氫楊梅素對照品(色譜級,純度>98%);甲醇(色譜純);超純水;其它試劑均為分析純。1.1.3愈傷組織的制備供試材料藤條,春天采自湖南省張家界,移栽到湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗基地。9月中旬采集3種葉片,10月底采集果實,均于48℃烘干,粉碎過60目篩備用。愈傷組織培養(yǎng)選擇植株生長健狀,無病蟲害的藤茶葉片、葉柄、莖段、莖尖等作為外植體。取長勢良好、無染菌、黑斑較少的愈傷組織,48℃烘干粉碎,過60目篩備用。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)選擇愈傷培養(yǎng)繼代3次后,狀態(tài)疏松、生長速度快的愈傷組織轉(zhuǎn)入到液體培養(yǎng)基中。選擇鏡檢有一定活細(xì)胞數(shù)量的同批懸浮液過濾,液體混合備用。1.1.4g/l+蔗糖2%+連續(xù)工段愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.15mg/L+蔗糖2%+瓊脂0.7%;繼代培養(yǎng)基:MS+2,4-D2mg/L+蔗糖2%+瓊脂0.7%;懸浮培養(yǎng)基:MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖2%。1.2測試方法1.2.1超聲脫氣、超聲脫氣參照周雪仙等方法,C18柱,流動相為甲醇∶水(36∶64),應(yīng)用前經(jīng)過0.45μm微孔濾膜抽濾,超聲脫氣,流速為1.0mL/min;進(jìn)樣時為20μL,柱溫30℃;檢測波長291nm。1.2.2定量定量測定取二氫楊梅素對照品5mg,加水溶解并定容至50mL,搖勻,即得(0.1mg/1mL),0.45μm微孔濾膜過濾,取20μL進(jìn)樣,面積外標(biāo)法定量。計算方法:X=[A樣×C標(biāo)×B樣/(A標(biāo)×M)]×100%式中:X——樣品中二氫楊梅素含量(%);A樣——樣品圖譜中二氫楊梅素對應(yīng)的峰面積;A標(biāo)——對照品圖譜中二氫楊梅素對應(yīng)的峰面積;C標(biāo)——二氫楊梅素對照品的濃度(mg/mL)為0.1;B樣——溶液稀釋倍數(shù);M——樣品量(mg或mL)1.2.3樣品溶液的制備嫩葉、葉片、老葉、果實、愈傷組織各稱取樣品粉末1g,置250mL三角燒瓶中,加20倍水于97℃水浴30min,10000r/min離心5min,取上清液備用,沉淀重復(fù)上述操作兩次,合并3次離心后的上清液,10倍95%乙醇沉淀,10000r/min離心5min,留上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至50mL,精密量取濃縮液1mL,根據(jù)預(yù)作試驗分別定容到適當(dāng)體積。超聲30min,取適量用0.45μm微孔濾膜過濾即得樣品溶液,取20μL進(jìn)樣分析。細(xì)胞懸浮液量取200mL,10倍95%乙醇沉淀,10000r/min離心5min,留上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮50mL,精密量取濃縮液1mL,定容到5mL。超聲30min,取適量用0.45μm微孔濾膜濾過即得樣品溶液。取20μL進(jìn)樣分析。2結(jié)果與分析2.1出峰時和出峰時由圖1可知,二氫楊梅素對照品大約在7.5min開始出現(xiàn)峰,大約在8.5min時出峰,響應(yīng)時間7.828min,峰面積為3849165,高度為268796。即A標(biāo)為3849165,C標(biāo)為0.1mg/mL。2.2葉氫楊樹葉片二氫楊樹葉片的光反應(yīng)將1.2.3中量取的1mL溶液定溶到10mL,然后過膜上樣。由圖2可知,嫩葉二氫楊梅素響應(yīng)時間7.902min,峰面積A樣為19652356,高度為1102075。稀釋倍數(shù)B樣為50×10=500,求得X,即嫩葉中二氫楊梅素含量為25.528%。2.3葉氫楊樹葉片二氫楊樹葉片二氫楊樹葉片二氫蝦素合成的日變化將1.2.3中量取的1mL溶液定溶到5mL,然后過膜上樣。由圖3可知,葉子二氫楊梅素響應(yīng)時間7.944min,峰面積A樣為21106641,高度為11589752。稀釋倍數(shù)B樣為50×5=250,求得X,即葉片中二氫楊梅素含量為13.709%。2.4老葉二氫楊方面積的響應(yīng)將1.2.3中量取的1mL溶液定溶到50mL,然后過膜上樣。由圖4可知,老葉二氫楊梅素響應(yīng)時間7.980min,峰面積A樣為2053457,高度為144301。稀釋倍數(shù)B樣為50×50=2500,求得X,即老葉中的二氫楊梅素含量為13.337%。2.5果實二氫楊樹葉片抗氧化能力的測定將2.1.4中量取的1mL溶液定溶到5mL,然后過膜上樣。由圖5可知,果實二氫楊梅素響應(yīng)時間7.936min,峰面積A樣為9630913,高度為649830。稀釋倍數(shù)B樣為50×5=250,求得X,即果實中二氫楊梅素含量為6.255%。2.6愈傷二氫楊樹葉片愈傷二氫楊樹葉片的響應(yīng)時間將1.2.3中量取的1mL溶液定溶到10mL,然后過膜上樣。由圖6可知,愈傷二氫楊梅素響應(yīng)時間7.999min,峰面積A樣為8942537,高度為592680。稀釋倍數(shù)B樣為50×10=500,求得X,即愈傷中二氫楊梅素含量為11.616%。2.7峰面積及高度由圖7可知,懸浮液二氫楊梅素響應(yīng)時間8.027min,峰面積A樣為255303,高度為11440。稀釋倍數(shù)B樣為50×5=250,因為懸浮液是取的200mL,所以M是200,求得X,即懸浮液中二氫楊梅素含量為0.829%。3誘導(dǎo)分化能力試驗結(jié)果表明,愈傷組織中二氫楊梅素含量與葉子中二氫楊梅素含量接近,可能是生長力旺盛的組織合成二氫楊梅素能力強,而