外定向自我剪接機制的結果分析和驗證一種DNA片斷體外定向自我剪接機制的結果分析和驗證

第一部分文獻綜述1.1限制性內切酶的發(fā)現(xiàn)與分類限制性核酸內切酶是識別生物體中特定DNA堿基序列并在該區(qū)域切割雙鏈DNA序列的核酸內切酶[1-3]。目前發(fā)現(xiàn)的大多數限制性核酸內切酶都來源于細菌。它們在細菌中的生物學功能主要是通過切割入侵的外源DNA序列，防止異源DNA無法有效轉錄(例如噬菌體)，從而使外源DNA序列(生命體)失去生命力，但不會破壞細菌本身DNA的原始遺傳信息，形成細菌體內一種天然的免疫防御機制。1.1.1限制性內切酶的發(fā)現(xiàn)Arber[4](1962)在研究大腸桿菌時，提出細胞內限制和修飾作用的模型假說：一是可以識別DNA堿基序列的限制酶,另一個則是可以識別與相應的限制酶相同的堿基序列的修飾酶，Yuan和Meselson(1968)證實了這一假設。Arber等(1968)首次從大腸桿菌B株細胞中發(fā)現(xiàn)了第一個限制性核酸內切酶。Smith等(1970)發(fā)現(xiàn)流感嗜血桿菌(H-aemo-philusinfluenzaed)可以在不降解自身DNA情況下降解侵入細菌體內的噬菌體DNA；通過純化DNA水解酶，確定了其高度特異性識別序列和切割位點，并將其命名為HindⅡ，這是第一個被發(fā)現(xiàn)的Ⅱ型限制性內切酶。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，HindⅡ酶切后的DNA片段可以重組，這種限制性內切酶逐漸成為研究基因組成、表達及功能的重要工具。限制性內切酶廣泛存在于原核生物中。通過對原核生物基因組進行測序和分析，發(fā)現(xiàn)許多可編碼限制性內切酶的基因，因而發(fā)現(xiàn)更多種類的限制性內切酶。在1980年代初期，通過克隆技術將限制性核酸內切酶基因進行異位表達，避免其原始細胞中其他核酸內切酶的污染，并提高了限制性內切酶的純度和產量，其純化過程也不斷優(yōu)化。1.1.2限制性內切酶的分類根據切割位點識別序列之間的距離差異、激活因子的差異以及它們是否同時具有甲基化酶活性，可將限制性內切酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三大類(圖1A、B)[5]?；谙拗菩詢惹忻傅那懈钐卣骺煞譃閮煞N類型：非特異性切割位點和特異性識別的核苷酸序列(僅特定序列可被切割)?？梢蕴禺愋宰R別的切割位點應具有回文序列，即在切割位點，沿一條鏈的正向讀取的堿基序列與另一條鏈的反向讀取的序列相同。又根據限制性內切酶在特定切割部位的不同切割方法，可分為位錯切割和平面切割。位錯切割是指切割兩條DNA鏈的不同部分，中間被幾個核苷酸隔開，切割末端形成類似回文結構的單鏈末端，該末端與具有互補堿基的靶基因片段相連，因此稱為粘性末端，如BamHI等。平面切割指切割兩條鏈特定序列的相同部分，切割后形成具有非粘性末端的平口，且切割部位位于回文序列的中間以形成平整末端，如SamI。圖1三種限制性內切酶的特性及切割雙鏈DNA示意圖(A)三種限制性內切酶的特性；(B)三種限制性內切酶切割雙鏈DNA示意圖。Fig.1Characteristicsofthreekindsofrestrictionendonucleasesandschematicdemonstrationofdigestingdouble-strandDNAbythem(A)Characteristicsofthreerestrictionendonucleases;(B)Schematicdemonstrationof3kindsofrestrictionendonucleasesdigestingdouble-strandDNA.1.2限制性內切酶的應用由于限制性內切酶對DNA分子有特定的切割能力，因而自發(fā)現(xiàn)Ⅱ型限制性內切酶以來，成為人們在分子水平上切割目的DNA片斷和分析遺傳信息的重要工具。1.2.1限制性內切酶在染色體DNA分析中的應用用限制酶將DNA切割成一系列片段，通過瓊脂糖凝膠電泳將上訴一系列片段分離開，通過遷移速度或在電子顯微鏡下觀察各種片斷的大小。這些片段在整個基因組中的順序主要由幾種不同的限制性酶決定，這些酶部分水解DNA，然后通過電泳分析產物。DNA中每個脫氧核苷酸的順序分析也可用相同的方式進行。1.2.2限制性內切酶在基因工程中的應用限制性內切酶可特異性地識別雙鏈DNA中的特定堿基序列，并通過切割雙鏈DNA中每條鏈上的磷酸二酯鍵來斷裂DNA。在實際應用中，可根據需要切割DNA。但是，在自然情況下，生物體內限制酶通常不切割自身DNA分子，僅切割外源DNA。目前已經從原核生物中分離出多種限制性內切酶，且已商業(yè)化并廣泛用于基因工程中，已成為重要的切割工具，是基礎克隆中最重要的工具酶之一，是重組技術和基因診斷中的一類重要酶。其應用范圍包括構建DNA基因物理圖譜、DNA堿基序列分析、基因定位和分離、相關的DNA分子比較等。限制性內切酶的廣泛使用使得基因工程技術得到飛速發(fā)展。1.3基因編輯技術基因編輯技術主要利用一種人工設計和修飾的核酸酶，在基因組水平上對靶基因進行定向切割，以實現(xiàn)基因敲入、敲除和定向置換的最終效果[6-8]。其作用機理是修飾的序列特異性核酸酶可以錨定到基因組的靶序列位點，從而切割靶DNA序列產生雙鏈斷裂(Double-strandbreak,DSB)，并進一步誘導非同源末端連接(Non-homologousendjoining,NHEJ)，這就導致基因組中堿基的插入和缺失。除了NHEJ修復外，如果在基因編輯過程中同時引入外源性目標基因的同源序列，以及同源重組(Homologousrecombination,HR)啟動導入序列與目標序列之間的修復，可以實現(xiàn)目標基因的突變修復或產生定點插入和替換、基因疊加突變[9,7-8]。基因編輯技術發(fā)展過程中先后出現(xiàn)三代系統(tǒng)，即鋅指蛋白核酸酶(Zincfingernucleases,ZFNs)[10-11]、類轉錄激活因子效應物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALENs)[12-13]和規(guī)律成簇的間隔短回文重復(Clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeat,CRISPR)[14-15]。ZFN和TALEN都是人工融合蛋白，包含一個融合到限制性內切酶FokI的非特異性核酸酶功能域的DNA結合域。ZFN和TALEN已經成功地應用于許多生物，包括植物[16-17]。2013年以來，基因編輯主要利用CRISPR/Cas9及其改良技術手段，最近又出現(xiàn)CRISPR/Cas變體Cas12a(Cpf1)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)基于RNA引導的Cas9核酸酶，可靶向基因組中大部分靶位點。它高效、精確地定向編輯基因組，即雙鏈DNA分子特異性切割，導致雙鏈DNA斷裂，然后激活同源重組的修復機制或易錯的非同源末端修復機制以實現(xiàn)基因編輯[18]。與Cas9一樣，Cpf1也是由RNA引導的核酸酶，但其識別的PAM是T富集區(qū)。另外，Cpf1可能會在PAM的遠端導致交錯的雙鏈斷裂，從而產生粘性缺口。該蛋白的發(fā)現(xiàn)豐富了CRISPR系統(tǒng)并擴大了其在基因編輯中的應用。1.3.1鋅指核酸酶技術(ZFNs)ZFNs是一種人工重組的核酸內切酶，由鋅指蛋白DNA結合酶和非特異性核酸內切酶FokI構成[19-21]，它是21世紀初開發(fā)的第一代基因編輯技術[22]。ZFNs的第一個成分是鋅指蛋白，在真核細胞中很常見，參與轉錄調控和蛋白質相互作用[23]。ZFNs的第二個組成部分是FokInuclease。FokI是在黃桿菌中發(fā)現(xiàn)的一種限制性酶，由DNA識別和切割結構域組成[24]。FokI僅在形成二聚體時才能切割DNA[25]，因此ZFNs進行基因編輯需要結合至DNA頂部和底部鏈的兩個單體才能誘導DSB。Wright等(2005)取得重要突破，他們率先使用ZFN進行植物細胞基因編輯，證明ZFN可以用于植物基因打靶；通過利用煙草原生質體中有缺陷的選擇標記基因的恢復，他們證明與隨機整合相比，基因打靶頻率最多可提高10-1[26]。同時，Lloyd等人(2005)證明了ZFNs可以通過NHEJ來突變擬南芥基因組中人工引入的限制性位點[27]。2009年，Wright等和陶氏化學公司獨立證明，DSB誘導的HR可以利用ZFNs修飾煙草和玉米的內源基因[28-29]。在玉米中，ZFN介導玉米IPK1基因的基因打靶是以重組IPK1的表達產生抗除草劑表型的方式獲得。結果表明基因打靶的頻率非常高，在大多數實驗中均達到10%以上[29]。1.3.2轉錄激活因子核酸酶基因編輯技術(TALEN)TALEN系統(tǒng)中關鍵因子是轉錄激活因子樣效應蛋白(TALEs)，是在革蘭氏陰性植物病原體(如Xanthomonas)中發(fā)現(xiàn)的一類新型的DNA結合蛋白[30-31]。Bonas等發(fā)現(xiàn)細菌病原體Xanthomonas將TALEs傳遞到給宿主[32]。且該蛋白質帶有與各種植物啟動子結合的DNA結合域[13,33-34]。DNA結合域由一系列不同數量的重復單元組成，每個重復單元由33-35個高度保守的氨基酸殘基組成，僅第12、13位的氨基酸具有不同的重復序列，且單體存在差異，該位點稱為重復可變雙氨基酸殘基(Repeatvariablediresidues,RVD)，它們負責DNA特異性識別。由于每個RVD識別不同的DNA堿基，例如，NI識別A、HD識別C、NG識別T和NN識別G，因此，RVD的差異也就決定了TALE對DNA識別的特異性[12,35-36]。TALEN系統(tǒng)由包含核定位信號的N末端結構域，識別特定DNA序列的中央結構域和具有FokI核酸內切酶功能的C末端結構域組成。與ZFN相似，TALEN通過TALE元件與DNA序列特異性結合，F(xiàn)okI切割形成DSB，特定序列的轉化由NHEJ或HR完成。研究表明，TALENs在植物基因工程中具有很好的潛在用途[37-38]。Li等通過TALEN介導將突變基因導入水稻OsSWEET14基因的啟動子已證明基于病原體的轉錄因子的結合基序被破壞，這導致水稻抗病性的增強[39]。Wright等利用TALENs在多達30%的轉化煙草原生質體中引入ALS基因的靶向突變[26]。同時，Wright等[26]還利用供體模板在煙草中進行了TALEN介導的基因打靶實驗，該供體模板在ALS和YFP標記基因之間產生了基因融合。這使得利用流式細胞術測定YFP熒光定量的基因打靶效率成為可能。且基因打靶的頻率高達14%。最近，TALENs也已被用于短孢子蟲[40]和大麥[41]中進行定向編輯。1.3.3規(guī)律成簇的間隔短回文重復/效應蛋白(CRISPR系統(tǒng))CRISPR技術最早于1987年在大腸桿菌K12iap基因側翼序列中被發(fā)現(xiàn)[42]，2002年被命名為串聯(lián)間隔短回文重復序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR)[43]。Cas9蛋白與單向導RNA(Single-guideRNA,sgRNA)結合不僅具有識別功能，而且還具有切割功能。由于Cas9獨特的RNA-DNA識別機制，靶向特定位點變得簡單，尤其是在同時編輯多個靶標時，CRISPR-Cas9基因編輯技術與ZFNs和TALENs前兩代技術相比，操作步驟大大簡化，編輯效率顯著提高[44]。此外，在CRISPR-Cas9基礎上還開發(fā)出多種基因編輯技術，將切割活性缺失型的Cas9與其他效應蛋白結合在一起進行基因定位、激活、抑制甚至定點誘變[45-48]。ZetscheB等(2015)發(fā)現(xiàn)CRISPR家族Type2V成員Cpf1不僅具有良好的DNA靶向切割活性[49]，而且還具有與CRISPR-Cas9顯著不同的編輯特性[49-55]。Cpf1識別的PAM(protospacer-adjacentmotif)序列富含T，與Cas9識別的NGGPAM互補，大大擴展了第三代基因編輯技術的應用范圍。就突變類型而言，與傾向于形成單個堿基插入缺失(Indel)的CRISPR-Cas9系統(tǒng)不同，CRISPR-Cpf1編輯系統(tǒng)傾向于產生幾個堿基甚至大片段的缺失。以上兩種CRISPR編輯系統(tǒng)已迅速應用于多個物種。1.4CRISPR/Cas9系統(tǒng)1.4.1CRISPR/Cas9的發(fā)現(xiàn)及分類CRISPR/Cas是細菌和古細菌進化出的一種適應性免疫系統(tǒng)，用于失活入侵的外來病毒和DNA中的基因功能。CRISPR/Cas主要由CRISPR序列元件和Cas基因家族蛋白組成。其中，CRISPR是“簇規(guī)則間隔短回文序列”的縮寫形式，由29bp的重復序列和32-33bp的非重復序列組成，其結構穩(wěn)定，由短而高度保守的前導序列，重復序列和間隔子組成[56]；而Cas則代表的是CRISPRRNA(crRNA)結合蛋白，具有切割DNA序列的能力[43]。CRISPR/Cas系統(tǒng)包含I-VI等6種類型[57]。I型系統(tǒng)的特征蛋白Cas3含有用于降解靶標的DNase和解旋酶結構域，III型CRISPR/Cas系統(tǒng)的特征蛋白Cas10則具有RNase的活性[58]。II型CRISPR/Cas系統(tǒng)包含Cas1、Cas2、Cas9和第4個成員Csn2或Cas4。其中，Cas9是II型CRISPR/Cas系統(tǒng)的標志性基因，其編碼的蛋白質除了在crRNA生物合成中起作用，同時在切割外源DNA方面也起著至關重要的作用。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由crRNA，反式激活crRNA(tracrRNA)和Cas9蛋白等3部分組成[59]。1.4.2CRISPR/Cas9的機制CRISPR/Cas9由于其簡單性、多功能性和專一性，已成為研究基因功能和改善農作物的重要生物技術工具[60]。Cas9具有RuvC和His-Asn-His(HNH)兩個DNA切割結構域，其斷裂的雙鏈DNA(double-strandedDNA,dsDNA)位點主要位于PAM序列上游3bp處[61]。HNH結構域切割crRNA的互補鏈，而RuvC樣結構域切割dsDNA的相反鏈[62]。因此，CRISPR/Cas9使用易錯的NHEJ或HR機制在體內修復DNA。NHEJ通常會導致DNA在切割位置隨機插入缺失，而HR通過在預測的DSB位點添加具有序列同源性的供體DNA模板來實現(xiàn)供體序列(donorfragment)插入或基因替換[61]。Cas9與crRNA和tracrRNA建立核糖核蛋白(ribonucleoprotein,RNP)復合物來有效地切割DNA。crRNA在匹配和識別靶標DNA中起至關重要的作用。它包含一個序列，該序列通過與靶DNA的堿基配對將Cas9RNP引導至特定基因座，形成一個R環(huán)。R環(huán)的形成激活了HNH和RuvC樣核酸內切酶結構域，分別用于切割DNA的靶鏈和非靶鏈，形成DSB[63]。tRNA與募集到復合物中的crRNA和Cas9蛋白結合[64]。gRNA是由tRNA和crRNA組成的嵌合分子，由一個18-20-nt間隔序列與PAM附近的靶DNA互補而形成。PAM是一個3-nt(NGG)序列，位于sgRNA目標位點的下游，在和Cas9結合介導的DNA切割中起著至關重要的作用[65]。因此，CRISPR/Cas9基因編輯分三步進行：(1)核定位Cas9蛋白的表達；(2)生成含有20-nt與靶基因互補的gRNA；(3)需要NGGPAM位點識別，且該位點必須位于靶位點3’末端附近。在sgRNA的指導下，sgRNA和Cas9在基因組中搜索靶標，并在PAM位點上游約3bp處產生平末端DSB[66]。1.4.3CRISPR/Cas9的應用CRISPR/Cas9具有不同的識別位點，可同時編輯多個位點而無需二聚化。Cas9蛋白有與FokI酶相似的功能，具有高基因編輯效率，低細胞毒性以及對靶位點精確編輯，靶位點外不會發(fā)生基因突變，還具有易操作和穩(wěn)定遺傳優(yōu)勢[67]。CRISPR/Cas9技術已廣泛用于編輯多種植物功能基因，包括擬南芥[68]、水稻[69]、玉米[70]、大豆[71]、高粱[72]、棉花(陸地棉)[73-74]、番茄[75]和馬鈴薯[76]等。在擬南芥原生質體中，基于NHEJ的靶向編輯效率高達5.6%，而在煙草細胞中高達38.5%[77]。2015年，CRISPR/Cas9介導的大豆基因組編輯首次取得成功[78]；李東昊等(2017)使用CRISPR系統(tǒng)同時編輯水稻系統(tǒng)中8個功能基因，證明CRISPR系統(tǒng)可以同時靶向并敲除多個基因，實現(xiàn)多基因同時編輯[79]。Li等使用CRISPR/Cas9編輯棉花GhMYB25-likeA和GhMYB25-likeD基因，兩個基因靶點的編輯效率分別是14.2%至21.4%[80]。1.5CRISPR/Cas12a(Cpf1)1.5.1CRISPR/Cpf1的發(fā)現(xiàn)及結構CRISPR/Cas12a(Cpf1)屬于II類CRISPR系統(tǒng)，由RNA引導。該系統(tǒng)主要由弗朗西斯氏菌屬(Francisella)的FnCpf1，氨基酸球菌屬(Acidaminococcus)的AsCpf1和毛螺菌科(Lachnospiraceae)的LbCpf1組成，3者均具有DNA核酸內切酶活性。其中FnCpf1與CRISPR/Cas9類似，但表現(xiàn)出一些獨特的特征[49]。Cpf1由單個crRNA引導，并利用富含T的PAM序列切割靶標dsDNA[49]。Cas9切割DNA產生平末端，Cpf1在PAM的遠端位置生成末端交錯的DSB，這可能具有一定的優(yōu)勢，尤其是在進行基因功能敲入時，可能會提高基于NHEJ機制的敲入效率[81]。1.5.2CRISPR/Cpf1作用原理Cas9利用HNH和RuvC核酸內切酶結構域分別切割目標和非目標DNA鏈[82]。而Cpf1由一個RuvC核酸內切酶結構域和一個可切割DNA的Nuc結構域組成[83]，并以Nuc域替換了Cas9切割的DNA鏈的HNH核酶域[84-85,83]。另有報道，Cpf1可作為一種將前體crRNA剪切為成熟crRNA的RNase[86]，并已被用于處理植物中基因編輯的crRNA陣列[87]，這些特征提高了Cpf1切割位點的插入效率[88]。由crRNA引導的Cpf1與特定PAM附近的DNA靶序列結合，催化DNADSB，激活細胞內NHEJ或HR修復機制，并實現(xiàn)諸如基因敲除、插入和替換的編輯效果[84,89-91,83,92-93]。與Cas9在PAM位點附近引入雙鏈斷裂并產生平末端不同[82]，Cpf1切割PAM位點遠端的DNA并產生5-nt粘性末端[49]。這一特性使Cpf1成為有效的體外DNA拼接的工具，并基于Cpf1消化和T4DNA連接酶介導連接建立DNA拼接標準，即C-Brick[94]。值得注意的是，C-Brick標準既能識別長DNA序列，又能在部分之間產生短疤痕，具有廣泛的應用潛力。為進一步探索Cpf1識別和剪切RNA和DNA的機制，研究者從相關結構對其進行了分析，并比較了其與Cas9的異同。Dong等[95]分析了LbCpf1-crRNA二元復合物的晶體結構，表明該復合物為雙葉結構，具有三角形外觀，且復合物中央帶有帶正電的通道。與以擴展構象結合Cas9的sgRNA不同，crRNA是高度失真的構象，一旦被Cpf1蛋白中間的寡聚核苷酸結合域(oligonucleotidebindingdomain,OBD)識別，就會導致Cpf1的松散構象形成緊湊的三角結構。此時，位于蛋白質中心的帶正電荷的通道可以接受crRNA和靶序列形成的異源雙鏈體，從而促進下一步反應的進行。據推測，OBD的環(huán)狀螺旋(looped-outhelicaldomain,LHD)結構域與識別雙鏈DNA底物的PAM序列有關。Stella等[84]確定了三鏈R環(huán)(“R”莖環(huán))結構，對明確FnCpf1準確識別靶DNA序列等相關分子機制具有重要的意義。1.5.3CRISPR/Cpf1的編輯特點與Cas9的機制和結構特征不同，Cpf1不僅在基因編輯中具有更好的切割活性和更高的特異性，而且在多基因編輯中也具有更顯著的優(yōu)勢。1.5.3.1用于切割目標DNA的CRISPR/Cpf1位點與Cas9使用RuvC和HNH結構域進行平末端切割不同，Cpf1則用RuvC和Nuc結構域將靶DNA的第23位互補鏈和第18位非互補鏈作為靶標，以產生交錯的切割粘性末端[95]。除了切割靶DNA的互補鏈外，Lei等[96]還增加了Cpf1的切割特性。不僅靶標DNA的互補鏈的23位被切割，而且非互補鏈的第18位也被切割，并且在非互補鏈的14至18位形成多個切割位點。此外，還發(fā)現(xiàn)Cpf1的切割位點受crRNA間隔子序列長度的影響。當間隔序列的長度大于或等于20時，Cpf1傾向于切割非互補鏈的第18位；當間隔子序列長度小于20時，Cpf1傾向于切割非互補鏈的14位。此特性有助于插入新的DNA序列，并使Cpf1更有效地激活HR[93]。同時，Cpf1能在較短間隔子長度的crRNA介導下特異性切割靶DNA的第14與22位，形成8-nt長黏性末端的特征，結合具有高精度連接特性的TaqDNA連接酶，將其開發(fā)為體外無縫編輯大型DNA片段的新工具。15.3.2CRISPR/Cpf1對PAM選擇范圍Cas9蛋白傾向于含G的PAM序列，而5'-NGG-3'PAM在選擇CRISPR-Cas靶序列中的作用非常有限。相反，16種Cpf1家族蛋白都顯示出對富含胸腺嘧啶的PAM的選擇偏好性[49,97-98]。TuM等[91]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)nCpf1對PAM序列的識別可以延長到5'-KYTV-3'。因此，Cpf1的應用開發(fā)使基因編輯的選擇范圍擴大，尤其是它編輯富含嘧啶的PAM的靶位點更具優(yōu)勢。1.5.3.3CRISPR-Cpf1的特異性Cpf1不僅具有更好的切割活性，同時也具有更高的特異性。體外實驗中，Kleinstiver等[99]使用GUIDE-seq分析來比較AsCpf1、LbCpf1與SpCas9的脫靶條件。大多數脫靶位點中，Cpf1插入缺失的頻率小于0.1％。與SpCas9相比，Cpf1幾乎沒有脫靶的現(xiàn)象，對基因編輯特別是基因治療來說更重要[90,99,100]。1.5.3.4CRISPR/Cpf1對多基因的編輯Cpf1豐富了CRISPR家族，Cpf1又以其獨特的編輯功能成為Cas9技術的重要補充。基因組功能研究、遺傳育種和其他過程中需要多基因突變體，因此使用CRISPR技術對多基因進行編輯非常重要。盡管已經報道Cas9可用于多基因編輯，例如核糖核酸酶和Cas9共表達策略以及轉運RNA(tRNA)和導向RNA策略的組合[101-103]，但這些策略在設計、成本或經濟上仍然不方便，限制了Cas9在多基因編輯中的應用。Cpf1則在很大程度上彌補了Cas9在多基因編輯中的缺點。而且與Cas9相比，Cpf1在多基因編輯中具有以下優(yōu)點：(1)Cas9切割DNA需要兩個小RNA分子，而Cpf1只需一個RNA分子；(2)Cas9切割可形成平末端，而Cpf1形成粘性末端，粘性末端比平末端更易于操作；(3)Cpf1切割距離識別位點較遠，選擇范圍較寬；(4)Cpf1可以識別連續(xù)2或3胸腺嘧啶(T)的PAM序列，從而擴展基因編輯范圍；(5)Cpf1除了能對DNA切割外，同時也能對RNA切割，有利于構建多基因編輯載體[104,55]。由于Cpf1僅依靠crRNA即可完成基因組編輯且可獨立介導pre-crRNA的加工而無需其他分子的干預，RNA的加工能力又獨立于DNA剪切功能[49]。利用Cpf1的這一獨特功能，Zetsche等[55]設計一個CRISPR陣列，對HEK-293T細胞中的DNMT1、EMX1、VEGFA和GRIN2b等4個基因同時編輯，并對小鼠大腦中的DRD1、MECP2和NLGN33等3個基因同時編輯成功。1.5.4CRISPR/Cpf1的應用CRISPR/Cas9已廣泛應用于遺傳育種、基因治療等領域，而Cpf1系統(tǒng)具有多個編輯特點，因而有望成為與Cas9特性互補的一種新基因編輯工具。Kim等[105]使用AsCpf1和LbCpf1以RNP的形式編輯大豆FAD2基因和煙草AOC基因。Cpf1產生更多的基因功能缺陷類型，且顯示出更精確的靶向特異性，也就是說，在每個可能的脫靶位點都沒有發(fā)現(xiàn)脫靶現(xiàn)象；同時還利用LbCpf1/AsCpf1在煙草葉片原生質體對煙草茉莉酸酯合成酶基因ALLENOXIDECYCLASE(AOC)編輯成功。Yin等使用CRISPR/Cpf1系統(tǒng)研究控制水稻葉片氣孔密度的OsEPFL9基因，以OsEPFL9第一個外顯子作為基因編輯的靶標位點，結果表明，基因編輯陽性水稻植株的遠端表面的氣孔密度降低8倍以上[106]。Wang等在3個水稻基因中選擇6個位點，比較FnCpf1和LbCpf1的活性，發(fā)現(xiàn)Cpf1均可實現(xiàn)有效突變，且FnCpf1的活性低于LbCpf1[107]；同時，Wang等還設計由4個crRNA單元組成的crRNA矩陣序列，分別編輯OsRLK和OsBEL基因，每個位點的敲除效率在40%-75%之間。Hu等也利用Cpf1多基因編輯系統(tǒng)成功地編輯多個水稻基因[108]。Cpf1系統(tǒng)在水稻實現(xiàn)簡單有效的多基因編輯，擴展了CRISPR系統(tǒng)在植物中的應用，并為水稻基因組編輯提供了新的工具。1.6研究的目的與意義限制性內切酶通過特異性地識別雙鏈DNA中的特定堿基序列，而且只能識別一個特定位點；同時，限制性內切酶只能剪切DNA，而不能同時對剪切后的DNA片斷重新連接。盡管基因編輯技術不斷發(fā)展，但仍存在一些不足。首先，目前應用最廣泛的CRISPR/Cas9技術一般情況下只能執(zhí)行基因功能敲除，不能有效地使用同源重組和其他方法來取代基因片段和“敲入”基因功能。最后，盡管CRISPR/Cpf1的PAM與大多數CRISPR/Cas9不同之處在于它在5'端富含T序列，但對PAM序列相對固定的要求也限制了Cpf1在實際應用中對靶標的選擇。而我們在前期實驗中發(fā)現(xiàn)一種未曾報道過的DNA剪接新機制，即DNA片段在PCR擴增過程中，可以將兩個相同的正向重復序列剪切后重新拼接在一起，形成新的較短的序列。本研究旨在統(tǒng)計分析這種新的剪接機制的結果，并作進一步的驗證。這種DNA自我剪接的機制將有可能應用于基因編輯技術體系，在受體生物特定DNA中和供體DNA同時進行定向剪接，實現(xiàn)對基因功能的“敲入”，從而有可能實現(xiàn)DNA片斷定向替換的基因編輯目的，為未來基因編輯技術提供新的思路和方向。1.7研究內容本實驗選取不同大小的DNA分子片段，這些片斷均包含一段特定的發(fā)夾結構。我們發(fā)現(xiàn)，這些DNA片斷在體外PCR擴增過程會發(fā)生自我剪切（cleavage)和拼接(splice)。回收剪接后的產物，進行二代高通量測序，對測序結果數據庫(cleandata)中進行分析：首先在原始的DNA序列里查找到各種正向短重復序列的位置，設想兩兩序列之間進行剪切再拼接，于是得到拼接后的序列，然后用這些預期拼接后的序列在cleandata中進行比對與讀數的查找(blast)，記錄其剪接序列的讀數，對部分有讀數的剪接序列做進一步的驗證分析。第二部分試驗材料與方法2.1試驗材料與試劑2.1.1植物材料水稻品種日本晴葉片。2.1.2質粒包括NJZL(2.3kb)、F7869(1.0kb)、F2-28(2.1kb)等3個質粒，均為帶有特定發(fā)夾結構(大約500bp)DNA的T-載體質粒。2.1.3試驗試劑PCR擴增MIX(南京諾唯贊)、膠回收試劑盒(天根)、瓊脂糖、TAE電泳緩沖液、LB培養(yǎng)基、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂、氨芐青霉素、T-載體連接試劑盒(生工)、Trans1-T1感受態(tài)細胞(全式金)、CTAB、質粒提取試劑盒(Megan)。2.1.4主要試驗試劑的配制LB液體培養(yǎng)基(400ml)：胰蛋白胨(4g)、酵母提取物(2g)、氯化鈉(4g)；固體培養(yǎng)基再加入瓊脂(6g)。將以上成分混勻后，加入400ml的超存水，滅菌20min。氨芐青霉素：5g?Ampicillin置50ml塑料離心管中，加入40mlddH2O，充分混合溶解之后定容至50ml,?0.22μm濾膜過濾除菌，小份分裝(1ml/管)后，置于20℃保存。2%CTAB：CTAB(20g/L)、NaCl(81.82g/L)、0.5mol/LEDTA(pH=8.0，40mL/L)、1mol/LTris-HCl(pH=8.0，100mL/L)，用去離子水定容至1000mL。2.1.5試驗儀器表1實驗儀器信息Tab.1InformationofExperimentalInstrument儀器名稱來源HH-6數顯三用恒溫水箱科析儀器HC-2518高速離心機中科中佳D1008E高速離心機SCILOGEX移液槍GILSON培清JS-780全自動凝膠成像分析儀培清超純水機Kertone超低溫冰箱Thermo超凈工作臺蘇凈安泰DYY-6C型電泳儀北京六一PCR擴增反應離心管BIOGI54DWS立式壓力蒸氣滅菌鍋ZEALWAYT-100PCR擴增儀BIO金屬浴COYOTEWD-9403X藍光觀察儀北京六一智能恒溫培養(yǎng)振蕩器(HNY-2102C)天津歐諾電子天平(LQ-A1002)上?？破?.2試驗方法2.2.1水稻葉片DNA的提取(CTAB)(1)取適量水稻葉片，12000rpm離心1min；(2)加700μl的CTAB在65℃水浴鍋加熱45min，后加700μl氯仿，12000rpm離心15min，吸上清；(3)2倍體積100%乙醇，-20℃冷凍30min，12000rpm離心15min，棄上清；(4)700μl的70%乙醇洗滌2次(每次12000rpm離心15min，且均棄上清)；(5)空離2min，吸出液體，65℃水浴鍋涼5min，加100μl純水溶解5min，振蕩搖勻，12000rpm離心30s，收集DNA。2.2.2構建目的基因載體由金斯瑞生物科技有限公司合成并構建分別含有3個不同長度DNA片段的質粒載體。每個DNA片段除了含有特定的發(fā)夾序列(500bp)外，且不同長度的DNA片段也含有不同的組成結構。2.2.3PCR擴增體系(1)PCR擴增采用25μl的PCR反應體系：DNA模板1μl、5?primer1μl、3?primer1μl、VazymeGreenMix酶12.5μl和ddH2O9.5μl。PCR的反應條件設置為：94℃預變性5min，94℃變性30s，退火溫度55-58℃退火30s，72℃延伸30s-150s，設置28-32個循環(huán)(溫度、時間和循環(huán)數主要根據引物的長度大小和酶的擴增效率來確定)，72℃終延伸5min，12℃保存。(2)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物制膠體系：瓊脂糖2g、緩沖液100ml，配置好后晃動錐形瓶混勻，放置在微波爐中加熱至全部溶解，取出待不燙手后加入核酸染料5μl，插入梳子等待凝固。瓊脂糖凝膠完全凝固后放入電泳池中，在膠孔第一個位置加入DNAladderMaker，其他位置按照順序每個孔5μl的PCR擴增產物，120V、100mA，跑樣50min，電泳結束后在紫外成像儀下進行觀察，通過DNAladderMaker大小鑒定是否為需要的DNA條帶，然后切出目的條帶割膠回收。2.2.4PCR產物割膠純化回收根據電泳結果割膠回收目的條帶，操作步驟如下：(1)割膠目的條帶，稱重加等體積PN溶液，50℃水浴(注意：如果直接純化，則按1：3比例加入PN溶液)；(2)500μl的BL溶液于CA2吸附柱中，12000rpm離心1min棄廢液；(3)將步驟(1)所得溶液室溫放置2min后加入CA2吸附柱中靜置2min后12000rpm離心1min棄廢液；(4)加600μl的PW漂洗液室溫靜置5min，12000rpm離心1min棄廢液，此步驟重復2次；(5)12000rpm空離2min，之后室溫靜置15min；(6)將吸附柱放在一個新的且干凈離心管中，加40μlddH2O，靜置2min,離心2min，得到回收產物，置于-20℃保存。2.2.5PCR回收產物T-載體連接回收產物連接T-載體體系：2×RapidLigationBuffer5μl、PGEM-TEasyVector1μl、PCRProduct3μl和T4DNALigase1μl，之后4℃連接過夜。2.2.6轉化回收產物4℃連接過夜后，轉化Trans-T1感受態(tài)細胞，具體轉化步驟如下：(1)從-80℃冰箱取出適量Trans-T1感受態(tài)細胞于冰上解凍；(2)解凍后取5μl連接產物于50μl感受態(tài)細胞，輕混勻，冰浴30min；(3)冰浴后，42℃水浴鍋中熱擊30s，在冰浴2min；(4)加500μl的LB(不含Amp)液體培養(yǎng)，37℃、200rpm搖床中振蕩培養(yǎng)1h；(5)吸80μl細胞懸液均勻涂在(含Amp)LB固體培養(yǎng)基上；37℃培養(yǎng)平板過夜。2.2.7陽性克隆鑒定(1)在含Amp抗性的LB固體平板上挑取單克隆菌落，將其接種于含500μlAmp抗性的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200rpm搖床中振蕩培養(yǎng)5h左右；(2)取1μl菌液，用相對應的引物配對進行菌落PCR的鑒定。(3)PCR擴增結束后進行凝膠電泳檢測，將獲得的陽性克隆單株測序。2.2.8質粒提取(1)目的菌種接種培養(yǎng)過夜搖菌培養(yǎng)，1000rpm離心1min棄培養(yǎng)基；(2)250μlBufferP1，高速重懸細菌；(3)250μlBufferP2，顛倒混勻8-10次；(4)350μlBufferNP3,顛倒8-10次徹底中和，13000rpm離心1min；(5)上清液放入收集管中，13000rpm離心1min；(6)棄廢液，加500μlBufferPW1，13000rpm離心1min；(7)棄廢液，加600μlBufferPW2，13000rpm離心1min，重復操作該步驟；(8)棄廢液，13000rpm離心2min；(9)80μlElutionBuffer,靜置1min，13000rpm離心1min洗脫DNA，質粒-20℃保存。2.2.9高通量測序把1F2R、NJZL、F7869和F2-28的PCR擴增產物分別進行高通量測序。其中1F2R和NJZL的高通量測序由武漢博越致和生物科技有限公司完成，而F7869和F2-28的高通量測序由杭州聯(lián)川生物技術有限公司完成。高通量測序前處理：包括片斷打斷處理和不打斷處理。加上通用接頭，均連接到通用測序載體上，進行高通量測序。測序數據整理：對通過高通量測序得到大約6000000條測定的序列(rawdata)，剔除通用載體序列后得到cleandata數據庫。2.2.10正向重復序列(directrepeats)整理打開DNAStar中Editseq軟件，分別在DNA片斷1F2R(1.49kb)、NJZL(2.3kb)、F7869(1.0kb)、F2-28(2.1kb)原始序列中找到所有正向重復序列及其位置，用于分析那些預期的正向重復序列兩兩之間的剪切和拼接。2.2.11剪切和拼接結果的查找根據原始DNA序列里正向重復序列的數量和位置，設想兩兩之間剪切且拼接可形成一個新的較短的序列。將剪切拼接形成的序列在cleandate中進行讀數的查找(blast)，分別統(tǒng)計四個DNA片段正向重復序列兩兩之間剪切拼接后形成新的較短的序列的讀數(reads)。2.2.12驗證有讀數的剪接序列對部分讀數的剪接序列，在PrimerPremier5軟件中設計驗證所需的特異引物，并合成設計的引物(生工生物有限公司)。用設計合成的特異引物進行PCR的擴增，凝膠電泳檢測后回收目的條帶，將回收產物連接T-載體并轉化大腸桿菌、挑取單克隆，同時對挑取的單克隆菌株進行菌液PCR的鑒定，將鑒定出的陽性單克隆菌株測序。2.2.13高通量測序中重組序列的驗證特異引物進行PCR擴增，凝膠電泳檢測后，將目的條帶割膠回收，回收產物進行T-載體連接、轉化大腸桿菌、挑取單克隆，并對挑取的單克隆菌株進行菌液PCR的鑒定，鑒定出的陽性菌株測序。第三部分結果與分析3.11F2RDNA片斷PCR過程中剪接結果的統(tǒng)計分析3.1.1DNA片斷序列結構1F2RDNA片斷全長約1.49kb(圖2B)，其中包含1段長約500bp特定的發(fā)夾結構，即可以產生反向互補的回文結構(圖2A)。3.1.21F2RDNA片斷高通量測序引物序列：1F:5’AGTTGCTGAGGTTCGTTTGG3’2R:5’TGGAGGTTCTTGAGGCAGTT3’以水稻基因組DNA為模板，特異引物1F和2R配對進行PCR擴增。電泳結果可以看出，有最亮的1.49kb條帶。同時，該條帶下面還有2個亮度清晰的條帶，分別是大小為1.226kb和0.264kb的條帶(圖2C)。我們將1.49kb條帶下面的1.226kb條帶回收，連接到T載體并轉化大腸桿菌，挑單克隆，用通用引物M13F和M13R對T載體質粒測序。將測序結果在DNAStarMegalign軟件和Chromas峰形圖軟件中與原始序列進行仔細的比對和分析，我們發(fā)現(xiàn)該1.226kb片斷是由于1.49kb片斷在兩對正向重復序列之間分別進行剪切后再拼接形成的：一種是在1.49kb原始序列內3個GCAGC位點中第1個和第3個之間進行剪切再拼接(圖2D)；二是在1.49kb原始序列內3個TGTAGCC位點中第1個和第2個之間進行剪切再拼接(圖2E)。這兩種剪切方式中均會有一段0.264kb的中間片斷被切除下來(圖2D(c);2E(c))。這種特殊的DNA片斷體外剪切和拼接機制以前未曾報道過。同時，我們還觀察到，除了1.49kb、1.226kb和0.264kb這3條亮的PCR產物條帶外，電泳圖還有其他相對比較彌散的條帶。這些結果促使我們作進一步的設想：在體外PCR擴增過程中，1.49kb片斷中其他任意2個正向重復序列之間是否也會發(fā)生類似的剪切和拼接呢？也就是說，這種DNA片斷體外剪切后拼接的機制是否具有普遍性呢？為了驗證這個猜想，我們將1.49kb于DNA片斷作模板擴增的所有PCR產物混合回收，進行高通量測序，對這個特殊的剪切和拼接機制進行更深入的分析與驗證。圖2PCR擴增1F2R(1.49kb)DNA片段時在2對正向重復序列(GCAGC或TGTAGCC)位點處進行自我剪切和拼接(A)500bp發(fā)夾結構示意圖；(B)1F2R(1.49kb)DNA片斷序列結構；(C)PCR擴增1F2R(1.49kb)DNA片段的凝膠電泳以及可能由1F2R(1.49kb)DNA片段PCR擴增過程中的自我剪切、拼接或缺失產生的較小DNA片段；(D)(a)由1F2R(1.49kb)DNA片段PCR擴增過程中自我剪切和拼接產生的1F2R(1.49kb)(WT)和CSF1(1.226kb)DNA片段在Megalignment中的部分對比結果；剪切和拼接位點在1對正向重復的GCAGC上(第1和第3個位點，淺藍色下劃線)；(b)1.226kbDNA片段的部分色譜圖；(c)PCR擴增1F2R(1.49kb)DNA片段的自我剪切和拼接機制的示意圖，自我剪切和拼接后僅有的正向重復序列GCAGC用淺藍色表示；(E)(a)1F2R(1.49kb)(WT)和CSF1(1.226kb)DNA片段在Megalignment中的部分對比結果；后者是由前者中1對正向重復序列TGTAGCC(第1和第2個位點，藍色下劃線)之間的自我剪切和拼接產生的；(b)1.226kbDNA片段的部分色譜圖；(c)PCR擴增1F2R(1.49kb)DNA片段的自我剪切和拼接機制的示意圖，自我剪切和拼接后保留的正向重復序列TGTAGCC用藍色表示。在(D)和(E)中，相同顏色的下劃線表示相同的堿基序列。Fig.2Self-cleavage-and-spliceatpairofdirectrepeats,GCAGCorTGTAGCC,inthe1F2R(1.49kb)DNAfragmentduringPCRamplification(A)Schematicdemonstrationofthe500bphairpin;(B)Structureof1F2R(1.49kb)DNAfragmentsequence;(C)AgarosegelelectrophoresisofPCR-amplified1F2R(1.49kb)DNAfragmentalongwithsmallerDNAfragmentsprobablyresultingfromself-cleavage-and-spliceordeletionduringPCRamplificationof1F2R(1.49kb)DNAfragment;(D)(a)PartialmegalignmentoftheDNAfragmentsof1F2R(1.49kb)(WT)andCSF1(1.226kb)resultingfromself-cleavage-and-spliceof1F2R(1.49kb)DNAfragmentduringPCRamplification.Thecleavage-and-splicesiteisatthepairofdirectrepeatGCAGC(thefirstandthirdcopies,lightblue-underlined);(b)Partialchromatogramof1.226kbDNAfragment;(c)Schematicdemonstrationoftheself-cleavage-and-splicemechanismof1F2R(1.49kb)DNAfragmentduringPCRamplification.TheonlydirectrepeatGCAGCremainingafterself-cleavage-and-splicewascoloredinlightblue;(E)(a)PartialmegalignmentoftheDNAfragmentsof1F2R(1.49kb)(WT)andthearound1.226kb(CSF2);thelaterresultedfromtheself-cleavage-and-spliceatpairofdirect-repeatTGTAGCC(thefirstandsecondcopies,blue-underlined),intheformer;(b)Partialchromatogramofthearound1.226kbDNAfragmentsasshowninB;(c)Schematicdemonstrationoftheself-cleavage-and-splicemechanismof1F2R(1.49kb)DNAfragmentduringPCRamplification.TheonlydirectrepeatTGTAGCCremainingafterself-cleavage-and-splicewascoloredinblue.In(C)and(D),thesame-coloredunderlinesannotatingbasesequencesrepresentedidenticalsequences.3.1.3正向重復序列(directrepeats)位點的整理在對高通量測序結果的序列庫(readdatabase)進行查找和比對之前，首先我們對1F2R(1.49kb)原始序列中所有的正向重復序列列出清單。表2列出1F2R(1.49kb)片斷中部分正向重復序列的位置，其余的正向重復序列位置統(tǒng)計附表A?？梢园l(fā)現(xiàn)，在1F2R(1.49kb)序列中，有較多的正向重復序列，堿基數呈現(xiàn)出5-20bp不等。表21F2R(1.49kb)片斷中部分正向重復序列位置Tab.2Partiallistofdirectrepeatsin1F2R(1.49kb)DNAfragment堿基數(bp)正向重復序列位置1位置2位置3位置4位置5位置6位置75GTAGG119412546GTTTTA2494244364607077AAAACTA1942262592903834148ATCTGTAG4845776406697007669ATTGGCTAT86087210AAATCTGTAG57563866776411ACAAAACTACA19222425728838112ATCTGTAGTTTT48457764066970013TGTAGTTTTGTGA48751955158061164367214CTGTAGTTTTGTGA48655057964267115TGTAGTTTTGTGATA58061167217TCACAAAACTACAGGTA19025518TTTATCACAAAACTACAG21825137519AATCTGTAGTTTTGTGATA48357666820TTAAATCTGTAGTTTTGTGA5736363.1.4兩個正向重復序列之間的剪接結果統(tǒng)計獲得高通量測序結果后，我們先設想1F2R(1.49kb)體外PCR擴增過程中，如果兩個相同的正向重復序列剪切后重新拼接后形成新的較短序列，保留一個重復序列。然后我們利用這個假設產生的新序列在數據庫里進行比對，查找數據庫里面是否存在這樣對應的序列讀數。結果發(fā)現(xiàn)，對于大部分正向重復序列來說，數據庫中確實存在兩個正向重復序列之間剪切后再拼接形成的新的較短序列讀數。通過在高通量測序數據庫中查找這些設想可能通過以上所描述的剪切拼接機制產生的剪接序列，我們發(fā)現(xiàn)，這些剪接序列存在與否的情況是：讀數(read)為0，表明可能相應的兩個重復序列之間沒有發(fā)生剪接事件(event)；二是剪接序列有一定數量的讀數(reads)，表明相應的兩個重復序列之間發(fā)生剪接事件。我們對部分有讀數的序列做進一步的驗證分析。表3列出1F2R(1.49kb)片斷中部分正向重復序列剪接的結果，剪接序列中所有的紅色和黑色標記均指代不同的堿基序列，其中紅色標記均為正向重復序列的本身，而兩邊的黑色標記是各自的正向重復序列兩邊的序列。其余1F2R(1.49kb)片斷正向重復序列兩兩位點之間剪接結果的統(tǒng)計附表B。表31F2R(1.49kb)片斷中部分正向重復序列剪接結果的統(tǒng)計Tab.3Resultstatisticsofcleavage-and-spliceof1F2R(1.49kb)DNAfragmentbetweensomepairofofdirectrepeats正向重復序所在位置及個數剪接位點剪接序列讀數(reads)NJZL-1R1NJZL-1R2NJZL-2R1NJZL-2R2AGTGTCT3個(240-365-397)1-2GATTTAGTGTCTTCATT3032011-3GATTTAGTGTCTCCATT158342-3CATTTAGTGTCTCCATT333501ATTTAGTGT3個(236-329-361)1-2TACAGATTTAGTGTATTCG37001-3TACAGATTTAGTGTCTTCA3428012-3TATAGATTTAGTGTCTTCA13400AGAGA3個(742-744-1208)1-2AAGGAAGAGAAGAGC00001-3AAGGAAGAGAAATTA00002-3GGAAGAGAGAAATTA0000TTTATCACAAAACTACAG3個(218-251-375)1-2TACAATTTATCACAAAACTACAGGTACT43001-3TACAATTTATCACAAAACTACAGATTCA3027102-3TTCGTTTTATCACAAAACTACAGATTCA11604注：紅色標注序列為剪接后保留的一個重復序列本身，紅色標注序列兩端分別為剪接處兩個正向重復序列中前一個重復序列的前端序列和后一個重復序列的后端序列。3.1.51F2R內正向重復序列GTAGG之間剪接驗證的結果(1)設計引物的序列：ctcgatctcgtaggggaagtagaaggaagtagaagaggaaaggatgttgagatgaacattgggataagggtggtgaggcttagatcggaggcggtgatggagcttcgaccatgtggcgacactattgaaaagtattggacaagggtgtttgcgttggcgtggccatggaggtccagacaacggatgcttcacatcttggtgtggttgcgagtggcggcgatggacagggcaggcacaactgcctcaagaacctcca(2)引物序列：GTAGGF1:5?CTCGATCTCGTAGGGGAAGTAGAA3?GTAGGR1:5?GGAGGTTCTTGAGGCAGT3?GTAGGR2:5?TGTGAAGCATCCGTTGTC3?注：GTAGGF1為正向重復序列兩兩之間剪切拼接的序列前期的位點統(tǒng)計結果表明，原始序列里只有兩個GTAGG位點，分別是1194和1254。以水稻基因組DNA為模板擴增1F2R(1.49kb)片斷的回收產物為模板，引物1F和2R配對PCR擴增產物作為驗證GTAGG剪接序列的模板。引物GTAGGF1和GTAGGR1(目的條帶大小254bp)、GTAGGF1和GTAGGR2(目的條帶大小192bp)分別配對來驗證這2個位點之間否真的存在剪切拼接的情況。凝膠電泳結果中，我們可以看到這兩種引物搭配都有擴增條帶(圖3A)，且都與預期的目的條帶大小接近，這進一步說明該重復序列之間有可能存在有和GCAGC(1-3位點)和TGTAGCC(1-2位點)相似的剪接情況。為了進一步驗證這個相似的剪接情況，我們把GTAGGF1+GTAGGR1搭配所擴增出來的條帶割膠回收連接T-載體并轉化大腸桿菌、挑選20個單克隆。對挑取的單克隆用GTAGGF1+GTAGGR1引物進行菌液PCR鑒定，可以看到20個單克隆菌株中有16個菌珠DNA模板擴增出預期大小的DNA條帶(圖3B)。挑取4個單克隆菌液PCR產物測序。將測序結果在DNAStarMegAlign軟件中與原始序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)所測序的4個PCR產物中有3個是在預期位置，即1194-1254之間剪接形成的(圖3C)。表明GTAGG的2個位點之間存在剪接機制。由于我們并不能確定這個新的剪接機制是否具有普遍性，且1或2個正向重復序列的剪接結果也不能說明這個新的剪接機制就一定具有普遍性，于是我們又繼續(xù)對1F2R(1.49kb)DNA片斷里的其他正向重復序列進行了分析與驗證。圖3正向重復序列GTAGG之間剪接驗證(A)以1F2R(1.49kb)回收產物為模板并以引物1F+2R配對進行PCR擴增的產物為DNA模板，引物GTAGGF1+GTAGGR1、GTAGGF1+GTAGGR2分別配對進行PCR擴增的凝膠電泳結果；1-10：引物GTAGGF1+GTAGGR1配對；14-23：引物GTAGGF1+GTAGGR2配對；11和24：陰性對照；(B)以引物GTAGGF1+GTAGGR1配對PCR擴增的回收產物連接T-載體轉化大腸桿菌挑取單克隆菌落為DNA模板，引物GTAGGF1+GTAGR1對單克隆進行菌液PCR擴增的凝膠電泳結果；1-20：引物GTAGGF1+GTAGGR1配對，21：陰性對照；(C)(B)中PCR產物測序結果。M：DNAladderMarker。Fig.3Verificationofself-cleavage-and-splicebetweenpairofdirectrepeatGTAGG(A)AgrosegelelectrophoresisofPCRproductamplifiedbyusingprimersetofGTAGGF1+GTAGGR1andGTAGGF1+GTAGGR2,andrecovered1F2R(1.49kb)productastemplatewithprimersetof1F+2RPCRproductamplifiedasDNAtemplate;1-10:primersetofGTAGGF1+GTAGGR;14-23:primersetofGTAGGF1+GTAGGR2;11and24:negativecontrol;(B)AgrosegelelectrophoresisofPCRproductamplifiedbyusingprimersetofGTAGGF1+GTAGGR1,andmonoclonesofE.colitransformedwithT-vectorharbouringPCRproductofF1R1asDNAtemplate;1-20:primersetofGTAGGF1+GTAGGR1;21:negativecontrol;(C)SequencingresultsofPCRproductasmentionedin(B).M:DNAladderMarker.3.1.61F2R內正向重復序列TGTGG之間剪接驗證的結果(1)設計引物的序列：ttggcccgtgtggcgacacgacactattgaaaagtattggacaagggtgtttgcgttggcgtggccatggaggtccagacaacggatgcttcacatcttggtgtggttgcgagtggcggcgatggacagggcaggcacaactgcctcaagaacctcca(2)引物序列：TGTGGF1:5?TTGGCCCGTGTGGCGACA3?TGTGGR1:5?TGGAGGTTCTTGAGGCAGT3?TGTGGR2:5?TGTGCCTGCCCTGTCCAT3?注：TGTGGF1為正向重復序列兩兩之間剪切拼接的序列前期的位點統(tǒng)計結果表明，在原始序列中有3個TGTGG位點，分別是25、1346和1434。本結果驗證25-1346之間的剪接方式(位置)。以1F2R(1.49kb)片斷為模板，引物1F和2R配對進行PCR擴增的產物作為驗證TGTGG剪接序列的DNA模板。然后用引物TGTGGF1和TGTGGR1(目的條帶大小157bp)、TGTGGF1和TGTGGR2(目的條帶大小138bp)分別配對，進行PCR擴增。凝膠電泳結果表明，雖然兩種引物搭配都有條帶，但TGTGGF1與TGTGGR1引物搭配擴增的條帶更接近預期的目的條帶大小位置(圖4A)。為了驗證TGTGG的25和1346兩個位點之間剪接拼接形成的新的較短的序列是否存在，因此我們把引物TGTGGF1+TGTGGR1搭配所擴增出來的條帶割膠回收，連接T-載體轉化大腸桿菌，挑選20個單克隆。用這些單克隆菌液作DNA模板，引物TGTGGF1與TGTGGR1配對進行菌液PCR鑒定，其中13個菌株DNA模板擴增預期大小的PCR產物(圖4B)。隨機挑取4個單克隆菌液PCR產物測序。測序結果表明，所測序的4個PCR產物中有2個是在預期位置，即25-1346之間剪接形成的(圖4C)。說明在25和1346這兩個位點之間正向重復序列TGTGG具有剪接機制的存在。這進一步說明剪接機制在1.49kbDNA片斷里可能具有普遍性，為了更進一步的證明剪接機制在1.49kbDNA片斷里具有普遍性，針對1.49kbDNA片斷里的其他正向重復序列兩兩位點之間剪接形成的序列我們做了進一步驗證。圖4正向重復序列TGTGG之間剪接驗證(A)以1F2R(1.49kb)片斷為模板并以引物1F+2R配對進行PCR擴增的產物為DNA模板，引物TGTGGF1+TGTGGR1、TGTGGF1+TGTGGR2分別配對進行PCR擴增的凝膠電泳結果；1-7：引物TGTGGF1+TGTGGR1配對；11-16：引物TGTGGF1+TGTGGR2配對；8和21：陰性對照；(B)引物TGTGGF1+TGTGGR1配對PCR擴增的回收產物連接T-載體，轉化大腸桿菌挑單克隆菌液為DNA模板，引物TGTGGF1+TGTGGR1進行菌液PCR擴增的凝膠電泳結果；1-20：引物TGTGGF1+TGTGGR1配對，21：陰性對照；(C)(B)中PCR產物測序結果。M：DNAladderMarker。Fig.4Verificationofself-cleavage-and-splicebetweenpairofdirectrepeatTGTGG(A)AgarosegelelectrophoresisofPCRproductamplifiedusingprimersetofTGTGGF1+TGTGGR1andTGTGGF1+TGTGGR2,and1F2R(1.49kb)

fragmentastemplatewithprimersetof1F+2RPCRproductamplifiedasDNAtemplate;1-7:primersetofTGTGGF1+TGTGGR1;11-16:primersetofTGTGGF1+TGTGGR2;8and21:negativecontrol;(B)AgarosegelelectrophoresisofPCRproductamplifiedbyusingprimersetofTGTGGF1+TGTGGR1,andmonoclonesofE.colitransformedwithT-vectorharbouringPCRproductofF1R1asDNAtemplate;1-20:primersetofTGTGGF1+TGTGGR1;21:negativecontrol;(C)SequencingresultsofPCRproductasshownin(B).M:DNAladderMarker.3.1.71F2R內正向重復序列GCAGC之間剪接驗證的結果(1)設計引物序列：agagagaagagcagcacagaacagactccaagacctaacgtgtgtgtgattggtgggaccaggtattaatagtatagtaagcaactattgtatgaattggctattatattggctatagatgatttggagcttactattatagctagccaatctaatagtttattcatacaatagttacttataaacatatactacaccattaatatatggtcccgcctctcgtacacatataacgttttggagtctgtgctgcagctggctacaaatttgtagcctgctttgcttctctctcctcttttttctcttccacatgtgcttatagctgacttgtagcctgctattgtacctgctctaaacgagattcaataaaatgttactattaaataatgggcacttattaaatctttacgtagacctctactcgatctcgtaggagaaataaaagagaaattatattgtgaatctttgctgagacttttactcgatcttgtaggggaagtagaagaggaaaggatgttgagatgaacattgggataagggtggtgaggcttagatcggaggcggtgatggagcttcgaccatgtggcgacactattgaaaagtattggacaagggtgtttgcgttggcgtggccatggaggtccagacaacggatgcttcacatcttggtgtggttgcgagtggcggcgatggacagggcaggcacaactgcctcaagaacctcca(2)引物序列為：GCAGCF1:5?AGAGAGAAGAGCAGCACAGA3?GCAGCR1:5?GCACAGACTCCAAAACGT3?GCAGCR2:5?ATTTGTAGCCAGCTGCAG3?注：GCAGCF1為正向重復序列兩兩之間剪切拼接的序列前期正向重復序列位點整理結果表明原始序列里有3個GCAGC位點，即752、780和1016處，本結果驗證752-780之間的剪接方式(位置)。以1F2R(1.49kb)片斷為模板，引物1F和2R配對進行PCR擴增的產物作為驗證GCAGC剪接序列的模板。然后用引物GCAGCF1和GCAGCR1(目的條帶大小249bp)、GCAGCF1和GCAGCR2(目的條帶大小266bp)分別配對，進行PCR擴增。凝膠電泳表明，兩種引物搭配都有條帶，但引物GCAGCF1+GCAGCR1配對擴增的條帶更符合預期的目的條帶(圖5A)。雖然通過PCR擴增有所需的目的條帶，但是這不能說明在752和780這兩個位點之間就存在與752和1016這兩個位點之間相似的剪接機制，所以我們把GCAGCF1+GCAGCR1引物配對擴增的條帶割膠回收進行T-載體連接、轉化大腸桿菌，挑選20個單克隆。在以挑取的單克隆菌液為DNA模板，GCAGCF1+GCAGCR1引物配對進行菌液PCR鑒定，有12個菌株作DNA模板擴增有預期大小的PCR產物條帶(圖5B)。隨機取4個單克隆菌液PCR產物測序。將測序結果與原始序列比對分析后發(fā)現(xiàn)，測序的4個PCR產物均是以預期剪接方式(位置)形成的，即752-780之間(圖5C)。測序結果同樣表明在752和780這兩個位點之間具有剪接機制的存在圖5正向重復序列GCAGC之間剪接驗證(A)以1F2R(1.49kb)片斷為模板并以引物1F+2R配對進行PCR擴增的產物為DNA模板，引物GCAGCF1+GCAGCR1、GCAGCF1+GCAGCR2分別配對PCR擴增的凝膠電泳結果；1-9：GCAGCF1+GCAGCR1配對；13-21：GCAGCF1+GCAGCR2配對；10和22：陰性對照；(B)引物GCAGCF1+GCAGCR1配對PCR擴增的回收產物進行T-載體連接轉化大腸桿菌，挑取的單克隆的菌液DNA為模板，引物GCAGCF1+GCAGCR1配對對菌液PCR擴增凝膠電泳結果；1-20：GCAGCF1+GCAGCR1；21：陰性對照；(C)(B)中PCR產物測序結果。M：DNAladderMarker。Fig.5Verificationofself-cleavage-and-splicebetweenpairofdirectrepeatGCAGC(A)AgarosegelelectrophoresisofPCRproductamplifiedbyusingprimersetsofGCAGCF1+GCAGCR1andGCAGCF1+GCAGCR2,and1F2R(1.49kb)

fragmentastemplatewithprimersetof1F+2RPCRproductamplifiedasDNAtemplate;1-9:primersetofGCAGCF1+GCAGCR1;13-21:primers