第11章-基因組學(xué)與比較基因組學(xué)

基因組與比較基因組學(xué)第11章

什么是基因組，基因組學(xué)？基因組（Genome）：是指生物體的單倍體細(xì)胞中所有的DNA，包括細(xì)胞核內(nèi)的DNA和各種細(xì)胞器中的DNA，是生物體內(nèi)遺傳信息的集合?；蚪M學(xué)（genomics）：是研究并解析生物體整個基因組所有遺傳信息的一門學(xué)科。結(jié)構(gòu)基因組學(xué)功能基因組學(xué)比較基因組學(xué)基因組學(xué)的發(fā)展：從序列到功能結(jié)構(gòu)基因組學(xué)結(jié)構(gòu)基因組學(xué)：基因組計劃基因組作圖測定核苷酸序列基因定位功能基因組學(xué)

功能基因組學(xué)：后基因組學(xué)（postgenomics)

利用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)提供的信息和產(chǎn)物，在基因組系統(tǒng)水平上全面分析基因的功能的一門學(xué)科。比較基因組學(xué)

比較基因組學(xué)：研究不同物種之間在基因組結(jié)構(gòu)和功能方面的親源關(guān)系及其內(nèi)在聯(lián)系的學(xué)科。

基因組計劃的主要任務(wù)是獲得全基因組序列；現(xiàn)在的測序方法每次只能測800-1000bp，大量的測序片段要拼接；要知道序列在染色體上的位置才能正確拼接，因此需構(gòu)建基因組圖譜。教學(xué)內(nèi)容一、高通量DNA序列分析技術(shù)二、人類基因組計劃三、比較基因組學(xué)DNA序列分析技術(shù)

DNA序列分析鳥槍法測序技術(shù)及其改良一、高通量DNA序列分析技術(shù)（一）DNA序列分析技術(shù)DNA序列測定：是指DNA一級結(jié)構(gòu)的測定，是在核酸酶學(xué)和生物化學(xué)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)立并發(fā)展起來的一門重要的DNA技術(shù)學(xué)。DNA序列測定的技術(shù)

雜交測序法質(zhì)譜法單分子測序法原子探針顯微鏡測序法

DNA芯片法經(jīng)典方法:

雙脫氧鏈末端終止法(Sanger,1977)DNA化學(xué)降解法(Maxam&Gilbert,1977)新技術(shù)方法:是由英國劍橋分子生物學(xué)實驗室的生物化學(xué)家F.Sanger等人于1977年發(fā)明的。利用雙脫氧核苷酸作為鏈終止物測定DNA核苷酸順序的方法。1980年諾貝爾獎金獲得者F.Sanger1、雙脫氧鏈末端終止法（1）Sanger雙脫氧鏈末端終止法測定DNA序列的基本原理：以DNA合成反應(yīng)為基礎(chǔ)，加入ddNTP生成特定末端不同長短的DNA片段；聚丙烯酰胺凝膠電泳可以區(qū)分長度只差一個核苷酸的DNA分子。

DNA合成反應(yīng)

利用DNA聚合酶不能夠區(qū)分dNTP和ddNTP的特性，在DNA合成反應(yīng)中，加入ddNTP，ddNTP不存在3′-OH末端，故不能與下一個核苷酸的5′-P端形成3′、5′-磷酸二酯鍵，導(dǎo)致DNA新鏈的延伸提前終止于ddNTP

。

ATP、dATP和ddATP的結(jié)構(gòu)ATPdATPddATP這樣以待測序列的DNA為模板，加入引物和4種dNTP（其中一種為α-32P標(biāo)記），將此反應(yīng)物分為4等份，每份內(nèi)加入一定比例的一種ddNTP，如此形成A、T、C、G四個反應(yīng)體系，最后在各反應(yīng)體系中加入DNA聚合酶催化DNA片段合成。這樣各反應(yīng)體系中即可形成以一種ddNTP殘基為3’端結(jié)尾的一系列長短不一片段。CAGTTemplatePrimerdATPdNTPPolymeraseTerminatorTHEPROCESSTCGACGTCGACGTCGACGTTAAACTGGCCTAATCGAGTCAGTTGACCGGAT

DNA模板ATTGCAGTCGAC

生成的新鏈TAACGTCAGCTG

T管：

C管：

TAACGTCAGCT

TAACGTCAGC

TAACGT

TAACGTC

TTAAC

G管：

A管：

TAACGTCAGCTGTAACGTCA

TAACGTCAG

TAA

TAACG

TA

TAACGTCAGCTGTAACGTCAGCTTAACGTCAGCTAACGTCAGTAACGTCATAACGTC

TAACGTTAACGTAACTAATA

T

（2）雙脫氧末端終止法主要步驟

單鏈DNA模板的制備DNA模板與測序引物退火延伸-終止反應(yīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳放射性自顯影閱讀測序結(jié)果將DNA克隆到質(zhì)粒載體將DNA克隆到M13噬菌體載體將DNA克隆到酵母人工染色體——基因組DNA大片段文庫PCR雙脫氧鏈末端終止法要求單鏈作為模板如何得到單鏈DNA？2、DNA測序自動化

DNA測序的自動化是在Sanger的雙脫氧鏈末端終止法的基礎(chǔ)上在1987年由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司進(jìn)一步發(fā)展起來的激光測序法，其基本原理與末端終止法一樣，都是通過ddNTP競爭性的終止新合成的DNA鏈。DNA測序自動化步驟：

4種帶有不同熒光染料標(biāo)記的終止物ddNTPsSanger測序反應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物電泳分離激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子，發(fā)射出四種不同波長的熒光熒光信號采集、計算機(jī)分析與DNA自動排序TemplatePrimerdNTPPolymeraseTerminatorCGTATHEPROCESSTCGACGTCGACGTCGACGTTAAACTGGCCTAATCGAGTCAGTTGACCGGATC以熒光化合物標(biāo)記雙脫氧核苷酸的自動測序（二）鳥槍法測序技術(shù)及其改良

基因組的每條染色體長度可達(dá)數(shù)百萬堿基對以上，將鏈終止法測定的小片段DNA組裝成真實的排列順序是一項浩繁而精細(xì)的工作。DNA順序的組裝主要方法：全基因組鳥槍法測序改良鳥槍法：大片段克隆法、靶標(biāo)鳥槍法1、全基因組鳥槍法測序鳥槍法的順序組裝是直接從已測序的小片段中尋找彼此重疊，然后依次向兩側(cè)鄰接的序列延伸。DNA的鳥槍法測序的主要步驟

第一，建立高度隨機(jī)、插入片段大小為2kb左右的基因組文庫。第二，高效、大規(guī)模的末端測序。第三，序列集合。第四，填補(bǔ)缺口。鳥槍法測序示意圖鳥槍法的優(yōu)勢：

鳥槍法的主要優(yōu)勢在于：測序速度快，并且無須提供相關(guān)的遺傳圖譜和物理圖譜。

20世紀(jì)90年代末，用鳥槍法在較短時間內(nèi)成功地完成了流感嗜血桿菌的基因組測序，引發(fā)了一場微生物基因組測序的熱潮。這些研究項目的實施，表明鳥槍法測序可以組建一條流水工作線，一個科研小組可以分工合作，一部分人專門負(fù)責(zé)制備DNA，一部分人負(fù)責(zé)測序和數(shù)據(jù)分析。經(jīng)驗證明，一個5Mb大小基因組的測序可以在一年內(nèi)完成。鳥槍法的局限：拼接組裝困難：對于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大基因組而言，鳥槍法的序列組裝的起始階段工作量非常大。。重復(fù)序列的存在：在序列組裝時可能出現(xiàn)錯誤連接，使某些片段從原位置跳到另一無關(guān)位置。因此，對于缺少重復(fù)順序的小基因組（<5Mb）而言，鳥槍法仍為最佳的選擇，但對于大基因組而言，還需要更加有效的策略。2、改良鳥槍法（1）大片段克隆法：將基因組DNA分解為若干個較大的DNA片段，構(gòu)建基因組文庫；根據(jù)克隆插入子兩端的DNA序列查找與之連接的克隆建立重疊群；每個克隆可以獨立進(jìn)行鳥槍法測序；依據(jù)克隆重疊群進(jìn)行序列組裝這種方法又稱為克隆重疊群測序法?？寺≈丿B群大片段克隆法（2）靶標(biāo)鳥槍法根據(jù)染色體上已知基因或遺傳標(biāo)簽的位置來確定部分DNA片段的排列順序，再逐步確定各片段在染色體上的相對位置，是建立在基因組圖譜基礎(chǔ)上的”鳥槍法”。教學(xué)內(nèi)容一、高通量DNA序列分析技術(shù)二、人類基因組計劃三、比較基因組學(xué)二、人類基因組計劃人類基因組計劃（Humangenomeproject）于1990年啟動，我國于1999年加入該計劃，承擔(dān)其中1%的任務(wù)，即人類3號染色體短臂上約30Mb的測序任務(wù)。（一）人類基因組計劃概述1986年諾貝爾獎獲得者R.Dulbecco（杜爾貝科）提出人類基因組計劃——測出人類全套基因組的DNA堿基序列（

3X109bp

）1988年美國能源部和國家衛(wèi)生研究院率先在美國開展人類基因組計劃，并經(jīng)國會批準(zhǔn)由政府給予資助。此后，成立了一個國際間的合作機(jī)構(gòu)——人類基因組織(HumanGenomeOrganization)，由多個國家籌集資金和科研力量，積極參加這一國際性研究計劃。1989年，美國國立衛(wèi)生研究院成立了人類染色體研究中心，沃森出任第一任主任。1990人類基因組計劃起動；1995第一個原核生物（細(xì)菌）基因組測序完成；1996第一個真核生物（酵母）的基因組測序完成；1998第一個多細(xì)胞生物（線蟲）的基因組測序完成；2000果蠅和擬南芥的基因組測序完成；人類和水稻的第一張基因組草圖完成；2001人類基因組測序（精細(xì)圖）完成；水稻（秈稻和粳稻）基因組草圖完成。2003年4月，人類基因組序列圖（完成圖）完成。人類基因組計劃的進(jìn)展?fàn)顩r二000年六月二十六日克林頓宣布人類基因組草圖繪制完成2000年6月26日，美國總統(tǒng)克林頓(中)、塞萊拉公司董事長兼首席科學(xué)家克雷格·文特爾(左)和人類基因組計劃首席科學(xué)家弗胡西斯·柯林斯(右)在華盛頓白宮參加慶祝人類基因組草圖繪制成功。人類基因組計劃的科學(xué)意義（1）確定人類基因組中約數(shù)萬個編碼基因的序列及其在基因組中的物理位置，研究基因的產(chǎn)物及其功能。（2）了解轉(zhuǎn)錄和剪接調(diào)控元件的結(jié)構(gòu)與位置，從整個基因組結(jié)構(gòu)的宏觀水平上理解基因轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。（3）從整體上了解染色體結(jié)構(gòu)，包括各種重復(fù)序列以及非轉(zhuǎn)錄“框架序列”的大小和組織，了解各種不同序列在形成染色體結(jié)構(gòu)、DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)調(diào)控中的影響與作用。（4）研究空間結(jié)構(gòu)對基因調(diào)節(jié)的作用。（5）發(fā)現(xiàn)與DNA復(fù)制、重組等有關(guān)的序列。（6）研究DNA突變、重排和染色體斷裂等，了解疾病的分子機(jī)制，為疾病的診斷、預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。（7）確定人類基因組中轉(zhuǎn)座子、逆轉(zhuǎn)座子和病毒殘余序列，研究其周圍序列的性質(zhì)。遺傳圖譜轉(zhuǎn)錄圖譜0.7cM

或kb

序列圖譜物理圖譜100kbSTSmap遺傳圖、物理圖、轉(zhuǎn)錄圖、序列圖（二）人類基因組計劃的工作任務(wù)1、遺傳圖遺傳圖概念：又稱連鎖圖，是指采用遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建顯示基因或DNA分子標(biāo)記在基因組上相應(yīng)位置和遺傳距離的圖譜。

遺傳作圖是將每條染色體上的基因或DNA標(biāo)記的相對位置經(jīng)連鎖分析確定下來，構(gòu)成圖譜，因此，需借助相應(yīng)的遺傳標(biāo)記。遺傳作圖遺傳圖譜的標(biāo)記是什么呢？標(biāo)記1標(biāo)記2標(biāo)記3染色體上的基因和DNA序列均可作為路標(biāo),他們由特定的DNA順序組成.路標(biāo)位于染色體上的位置是固定的，不會更改的，從而而提供了作圖的依據(jù)。遺傳標(biāo)記最早的遺傳標(biāo)記——基因第一代遺傳標(biāo)記——限制性片段長度多態(tài)性第二代遺傳標(biāo)記——簡單序列長度多態(tài)性第三代遺傳標(biāo)記——單核苷酸多態(tài)性（1）基因是首先被使用的標(biāo)記孟德爾→豌豆植株高矮、豌豆的形狀等摩爾根—顯微鏡、肉眼→果蠅軀體顏色、翅膀形狀等生化表型→細(xì)菌、酵母遺傳學(xué)研究；人類中如血型系列（ABO）分析、血清蛋白和免疫蛋白基因是非常有用的標(biāo)記，但并不是理想的，基因標(biāo)記的缺點：1、可用作標(biāo)記的基因十分有限，許多性狀都涉及多基因。2、高等生物基因組中存在大量的基因間隔區(qū)，遺傳圖中留下大片的無標(biāo)記區(qū)段。3.只有部分基因其等位基因成員可以通過常規(guī)實驗予以區(qū)分，因而產(chǎn)生的遺傳圖是不完整的。（2）限制性片段長度多態(tài)性

（restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLP）最早發(fā)現(xiàn)的DNA分子標(biāo)記：指同一物種的亞種、品系或個體間基因組DNA受到同一種限制性內(nèi)切酶作用而形成不同的酶切圖譜的現(xiàn)象，稱為限制性片段長度多態(tài)性（RFLP)。限制性片段長度多態(tài)性是由于基因組DNA某一位點上的變異引起該位點特異性的限制性內(nèi)切酶識別位點的改變（原有位點的消失或出現(xiàn)新的酶切位點），致使酶切片段長度隨之發(fā)生變化而產(chǎn)生。

RFLP多態(tài)性的產(chǎn)生與檢測

RFLP的優(yōu)點（1）遍布于整個基因組，位置相對固定；（2）無表型效應(yīng)，不受發(fā)育階段及器官特異性限制；（3）共顯性，可區(qū)分純合子和雜合子；（4）結(jié)果穩(wěn)定、可靠；共顯性:

兩個親本的性狀在子代個體中同時出現(xiàn)，沒有顯隱關(guān)系。

限制性片段長度多態(tài)性的缺點制備可表現(xiàn)基因組DNA多態(tài)性的探針較為困難；DNA需要量大，實驗操作較繁鎖，檢測周期長成本費(fèi)用也很高；RFLP分子標(biāo)記分布密度過于稀疏，現(xiàn)已逐步被其他類型分子標(biāo)記所取代。RFLP是最早發(fā)現(xiàn)的分子標(biāo)記，也被稱為第一代分子標(biāo)記。又稱串聯(lián)重復(fù)序列，其多態(tài)性主要來自重復(fù)序列拷貝數(shù)的變化，包括小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA。小衛(wèi)星DNA—由15-65bp的基本單位串聯(lián)重復(fù)而成，長度一般不超過20kb。重復(fù)次數(shù)（小衛(wèi)星DNA區(qū)的長度）在人群中是高度變異的；按照孟德爾的規(guī)律遺傳微衛(wèi)星DNA/簡短串聯(lián)重復(fù)（STR、STRP或SSLP），重復(fù)單元2-8bp，通常重復(fù)10-60次GCTTATATATATATATATATATATATAAGCT（3）簡單序列長度多態(tài)性微衛(wèi)星序列（SSR）如何檢測SSR根據(jù)簡單重復(fù)順序兩側(cè)的序列設(shè)計引物,經(jīng)聚丙烯胺凝膠電泳分辯.

SSR標(biāo)記的優(yōu)點（1）在基因組中隨機(jī)分布，檢測的多態(tài)性頻率高；（2）PCR特異引物，重復(fù)性好；（3）共顯性，操作相對簡單。

SSR標(biāo)記的缺點（1）SSR需要測序和設(shè)計引物，因而需要大量的人力、物力和時間；（2）另外其種屬特異性強(qiáng)，開發(fā)所需的費(fèi)用高昂。

SSLP標(biāo)記又稱為第二代分子標(biāo)記（4）單核苷酸多態(tài)性

（singlenucleotidepolymorphisms,SNP）SNP是指同一物種不同個體基因組DNA的等位序列上單個核苷酸存在差異的現(xiàn)象。其中最少一種在群體中的頻率不小于1％；如果出現(xiàn)頻率低于1％，則視作點突變。人類99．9％的基因密碼是相同的，而差異不到0．1％，不同人群僅有140萬個核苷酸差異。這些差異是由“單一核苷酸多樣性”（SNP）產(chǎn)生的，它構(gòu)成了不同個體的遺傳基礎(chǔ)。SNP與RFLP和STR標(biāo)記的主要不同之處在于，它不再以DNA片段的長度變化作為檢測手段，而直接以序列變異作為標(biāo)記。連鎖互換定律的基本內(nèi)容位于同一染色體上的兩個或兩個以上的基因遺傳時，常有連在一起遺傳的傾向——連鎖；但在配子形成過程中，同源染色體的非姊妹染色單體間發(fā)生局部交換的結(jié)果導(dǎo)致重組類型的產(chǎn)生——互換（重組）；連鎖的頻率大于重組的頻率。遺傳作圖——連鎖互換分析AB

Ab

aB

ab(25)

(25)(25)

(25)(50)

(0)(0)

(50)(48)

(2)(2)

(48)配子類型(%)獨立遺傳孟德爾第二定律完全連鎖不完全連鎖連鎖遺傳定律ABABabab×遺傳作圖——連鎖互換分析基因（遺傳標(biāo)記）在染色體上的位置是相對恒定的，它們之間的重組率也是相對恒定的，不同基因之間的重組率不同。相鄰的兩個基因（遺傳標(biāo)記）由于重組而分開的概率將低于距離較遠(yuǎn)的兩個，所以重組率的大小可反應(yīng)它們之間在染色體上距離的遠(yuǎn)近；因此可通過基因重組率的計算來估算基因（遺傳標(biāo)記）間的遺傳距離。遺傳圖距的單位：厘摩（cM）——每單位厘摩為1％重組率如果兩個基因間有1%的重組值，其遺傳圖的距離為1厘摩。計算出不同基因（遺傳標(biāo)記）之間的重組率，就可以構(gòu)建出顯示基因在染色體上相對位置的圖——遺傳圖譜。遺傳作圖的主要方法雜交實驗家系分析

雜交實驗的連鎖分析的程序:

選擇已知基因型的親本→設(shè)計雜交方案→獲得交配的子代→分析其表型及基因型

玉米中的連鎖遺傳

有色飽滿

X無色皺縮

CS/CS

cs/cs

↓

測交：F1CS/c

sXcs/cs（雙隱性）

↓

CS/cs

Cs/cs

cS/cs

cs/cs

有、滿有、皺無、滿無、皺自由組合預(yù)期：1111實驗結(jié)果：40321491524035

親組合重組合

96.4%3.6%重組率繪制遺傳圖重組率為測量基因之間相對距離的尺度.與經(jīng)典遺傳作圖類似，只是統(tǒng)計性狀改為DNA分子標(biāo)記。

程序：選擇已知基因型的親本→設(shè)計雜交方案→獲得交配的子代→分析其DNA分子標(biāo)記DNA分子標(biāo)記遺傳圖繪制物理圖概念：采用分子生物學(xué)方法直接將基因或DNA分子標(biāo)記標(biāo)定在基因組實際位置的圖譜。以已知核苷酸序列的DNA片段（序列標(biāo)簽位點，sequence-taggedsite,STS）為“路標(biāo)”，以堿基對作為基本測量單位（圖距）的基因組圖。2、物理圖STS作圖的原理兩個STS出現(xiàn)在同一片段的機(jī)會取決于他們在基因組中的距離，彼此靠的越近，分離的幾率越小，彼此相隔越遠(yuǎn)，分離的幾率越大。兩個STS之間相對距離的估算與連鎖分析的原理一樣，它們之間的圖距根據(jù)它們的分離頻率來算。STS作圖原理圖示通過PCR或分子雜交檢測含有