水飛薊賓脂質(zhì)體的一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法測(cè)定

水飛薊賓脂質(zhì)體的一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法測(cè)定

從水生飛燕素系科植物中提取的黃酮類(lèi)化合物，主要成分為水飛燕素系。臨床上用于治療慢性肝炎、肝硬化和中毒性肝臟損傷。SLB難溶于水,已有的工藝是將其制成水溶性的葡甲胺鹽、卵磷脂復(fù)合物、固體分散體等,以提高生物利用度。脂質(zhì)體(liposome)作為一類(lèi)新型靶向藥物載體,脈管給藥后可顯著聚集于肝臟并緩慢釋藥,這種由肝臟枯否氏(kupffer)細(xì)胞吞噬所致的被動(dòng)靶向,無(wú)疑有利于肝位病灶,尤其是肝炎等的治療。我們以SLB為模型藥,首次嘗試制備水飛薊賓脂質(zhì)體(silybinliposomes),為控制其質(zhì)量,本文建立了一階導(dǎo)數(shù)分光光度法,用于水飛薊賓脂質(zhì)體包封率及水飛薊賓含量測(cè)定,該法操作簡(jiǎn)便,易于推廣。1實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備UV-2401PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)Heidolph);層析柱(天津玻璃儀器廠);超聲清洗儀(無(wú)錫超聲電子設(shè)備廠);水飛薊賓(中國(guó)藥品生物制品檢定所);豆磷脂(上海黃浦江磷脂公司);其余試劑為分析純。2方法和結(jié)果2.1脂質(zhì)體制備2.1.1白色脂質(zhì)體的制備豆磷脂、甲醇、氯仿及其它輔料按一定比例配方,采用薄膜勻化法制備空白脂質(zhì)體。2.1.2脂質(zhì)沉集法稱(chēng)取豆磷脂、水飛薊賓適量,共置于茄形瓶中,加入一定比例的甲醇-氯仿混合溶媒及其他輔料,使溶解至溶液澄清透明,利用真空泵在不斷旋轉(zhuǎn)振搖下,蒸發(fā)除去混合溶媒,使脂質(zhì)以薄膜狀沉集于瓶的內(nèi)壁。真空干燥數(shù)小時(shí),使殘留溶劑揮發(fā)殆盡,向茄形瓶中加入一定量的0.9%NaCl水合介質(zhì),旋轉(zhuǎn)水合2h得水飛薊賓脂質(zhì)體混懸液。于25℃放置數(shù)小時(shí),使其充分水合,即得。2.2導(dǎo)數(shù)光譜法的繪制2.2.1水飛薊賓供試液的制備精密稱(chēng)取一定量的水飛薊賓,用甲醇溶解,定容,制成20mg·L-1溶液,以甲醇為空白,置1cm石英比色皿中,于250~330nm內(nèi)以1nm為間隔進(jìn)行掃描,記錄零階光譜,見(jiàn)圖1中的曲線1,288nm處為水飛薊賓的峰值吸收;取空白脂質(zhì)體1.0mL于10mL容量瓶中,甲醇定容,得供試液1,吸取供試液11.0mL置另一10mL容量瓶中,甲醇定容,得供試液2。以甲醇為空白,供試液2于250~330nm以1nm為間隔進(jìn)行掃描,記錄零階光譜,見(jiàn)圖1中的曲線2。由圖1可見(jiàn),在250~330nm用零階導(dǎo)數(shù)光譜法測(cè)定水飛薊賓,空白脂質(zhì)體對(duì)測(cè)定產(chǎn)生干擾。2.2.2水飛薊賓及空白脂質(zhì)體的導(dǎo)數(shù)光譜圖由水飛薊賓及空白脂質(zhì)體的零階導(dǎo)數(shù)光譜,于UV-2401PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)直接進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,分別獲得水飛薊賓及空白脂質(zhì)體的一階導(dǎo)數(shù)光譜,見(jiàn)圖2。圖2表明:空白脂質(zhì)體的一階導(dǎo)數(shù)光譜在270~300nm近似于一條直線,而水飛薊賓的一階導(dǎo)數(shù)光譜在277nm和294nm處出現(xiàn)特征峰和谷,據(jù)此,可通過(guò)測(cè)定277nm和294nm處峰與谷的振幅ΔA對(duì)脂質(zhì)體中水飛薊賓的含量進(jìn)行測(cè)定。2.3溶液的制備2.3.1標(biāo)準(zhǔn)slb溶液的制備精密稱(chēng)取水飛薊賓對(duì)照品10mg,置于50mL容量瓶中,甲醇溶解,定容。所得SLB標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為0.2mg·mL-1。2.3.2磷酸貯存液的制備取空白脂質(zhì)體1.0mL于10mL容量瓶中,生理鹽水定容,搖勻,即得。2.3.3巴比溶液的制備取1.0mL的生理鹽水,用甲醇定容至10mL。2.4磷酸鹽溶液的配制精密移取SLB標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.0,0.10,0.25,0.5,1.0,1.5mL,分別置10mL容量瓶中,各加入1.0mL磷脂儲(chǔ)備液,依次用甲醇定容。以參比液為空白,依次測(cè)定各溶液在277nm處峰和294nm處谷間的振幅ΔA,并以ΔA對(duì)濃度C進(jìn)行回歸,得回歸方程:ΔA=3.76×10-3C+1.11×10-3,r=0.9998,表明在0.5~30.0mg·L-1ΔA與濃度呈線性關(guān)系。2.5回收率的測(cè)定準(zhǔn)確配制高、中、低3種濃度的SLB溶液,分別精密量取1.0mL,置10mL容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度。再分別精密量取各稀釋液1.0mL,置10mL容量瓶中,各加入1.0mL磷脂儲(chǔ)備液,用甲醇定容,搖勻,以參比液為空白,依次測(cè)定各溶液在277nm處峰和294nm處谷間的振幅ΔA,按回歸方程計(jì)算濃度,求得回收率,結(jié)果見(jiàn)表1。平均回收率為101.7%,RSD為1.8%。2.6水飛賓脂質(zhì)密封率測(cè)定2.6.1洗脫曲線slb取充分容脹的SephadexG-100適量,制備凝膠柱(150mm×200mm);精密量取脂質(zhì)體混懸液0.5mL上柱,以生理鹽水洗脫,流速1.1mL·min-1,每管1mL,收集90管。各管收集完畢,加甲醇定容至5mL;另取1.0mL生理鹽水,加甲醇定容至5mL,作為空白溶液,于288nm處(SLB的最大吸收波長(zhǎng))測(cè)定各樣品管溶液的吸光度,以樣品管編號(hào)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制洗脫曲線,見(jiàn)圖3。圖中的單峰為SLB脂質(zhì)體。2.6.2slb投料量的測(cè)定精密量取脂質(zhì)體混懸液1.0mL上柱,以生理鹽水洗脫,乳白色帶接近柱口時(shí)開(kāi)始收集,待其完全通過(guò)時(shí)停止收集,將收集到的SLB脂質(zhì)體以生理鹽水定容至10mL。精密量取此稀釋液1.0mL置10mL容量瓶中,用甲醇定容,搖勻,以參比液為空白,測(cè)定277nm處峰和294nm處谷間的振幅ΔA,由回歸方程計(jì)算被包封的SLB量We,按下式計(jì)算包封率(EN%):EN%=(We/Wt)×100%,式中Wt為SLB的投料量。采用該法測(cè)得藥脂比0.02~0.06的水飛薊賓脂質(zhì)體的包封率為65.1%~83.0%。2.7脂質(zhì)體混懸液中slb含量的測(cè)定精密量取脂質(zhì)體混懸液1.0mL,以生理鹽水定容至10mL,搖勻;精密量取此稀釋液1.0mL,置于10mL容量瓶中,用甲醇定容,搖勻,以參比液為空白,測(cè)定277nm處峰和294nm處谷間的振幅ΔA,由回歸方程計(jì)算脂質(zhì)體混懸液中SLB濃度,采用優(yōu)化工藝(詳細(xì)制備工藝另文發(fā)表)所制得的脂質(zhì)體中實(shí)際測(cè)得SLB平均濃度為760.4mg·L-1(n=4)。3凝膠柱色譜分離利用葡聚糖凝膠過(guò)濾色譜法將游離SLB和SLB脂質(zhì)體分離為