健康人群內谷胱甘肽的氧化還原電位測定

健康人群內谷胱甘肽的氧化還原電位測定

水體氧化還原（railol）影響著許多代謝和身體功能。許多生物材料的結構和功能與氧化還原平衡態(tài)有關。但體液氧化-還原態(tài)的監(jiān)測指標卻是一個至今未能取得共識的懸案,已被探索的指標包括還原型、氧化型谷胱甘肽的比值(GSH/GSSG),NADPH/NADP+,NADH/NAD+,還原型、氧化型輔酶Q(CoQH2/CoQ)等,及體液的氧化-還原電位。本文檢測了成都地區(qū)青年健康人群中GSH/GSSG的分布狀態(tài),以初步確認GSH/GSSG是否有一相對穩(wěn)定的范圍?是否呈正態(tài)或近似正態(tài)分布?可否作為一項可用的體液氧化-還原態(tài)的監(jiān)測指標?并為進一步建立GSH/GSSG在健康人群中的正常范圍積累基礎資料。同時,對建立的GSH、GSSG測定方法進行了質控檢驗,以確認方法的可信度。1測定方法正常人群從健康學生志愿者中募集。年齡22～25歲,平均年齡為23.5歲。男20人,女22人。熒光試劑鄰苯二醛(O-phthaldehyde,OPT,為瑞士Fluka公司產品),N-乙基馬來酰亞胺(N-ethylmaleimide,NEM,為瑞士Fluka公司產品),GSH和GSSG標準品均為Sigma公司產品。其余均為國產分析純試劑。所用均為雙重蒸餾水。日本島津RF-510型熒光分光光度儀。德國賀利氏低溫離心機。血漿制備:清晨用肝素抗凝的真空采血管抽取血液5ml,立即放入離心機中離心10分鐘后迅速分離出血漿。取500μl血漿加入等體積0.04MNEM混勻后放置30分鐘,以測定GSSG。再取500μl血漿加入等體積10%偏磷酸(m/v)除蛋白后進行GSH測定。紅細胞制備:將剩余的紅細胞用等體積生理鹽水洗滌三次,將洗滌后的紅細胞吸取500μl,加入等體積蒸餾水充分溶血后加入1mlNEM以及10%偏磷酸除蛋白。放置30分鐘后進行GSSG的測定。將洗滌后的紅細胞吸取500μl,加入等體積蒸餾水充分溶血后加入10%偏磷酸除蛋白后進行GSH測定。將制備好的血漿或紅細胞樣品分別取100μl,測定GSH時加入0.1M磷酸氫二鈉-0.005MEDTA緩沖液900μl;測定GSSG時加入緩沖液0.1MNaOH900μl。混勻后分別各取100μl再加入相應緩沖液1.9ml,加入100μlOPT,充分混勻放置30分鐘后,在激發(fā)波長334.4nm,發(fā)射波長422.4處測熒光強度。1.6u3000gsh和gssg標準曲線的繪制和回收率Eh=Eo+RT/2Fln[(GSSG)/(GSH)2]其中,R為氣體常數;F為法拉第常數;E0為GSH-GSSH的標準電位值,以血液pH值7.4為標準,E0為-264mV。根據此公式計算GSH-GSSG的氧化還原電位值。GSH配制用磷酸緩沖液(pH8.0);GSSG配制緩沖液為0.1M氫氧化鈉溶液。GSH和GSSG濃度依次為:0.5、1、2、4、6、8、10ug/ml。標準管加入不同濃度的標準液0.1ml,空白管加入0.1ml蒸餾水,各管分別加入相應緩沖液1.9ml,混勻后加入0.1ml的OPT-甲醇溶液,混勻后室溫下靜置30分鐘。以空白管調零,在激發(fā)波長334.4nm,發(fā)射波長422.4處測熒光強度,繪制標準曲線。在新鮮血漿和紅細胞樣品和中分別加入GSH和GSSG標準品,計算其回收率。在樣品加入OPT后5分鐘開始測定熒光強度,并以5分鐘為時間間隔,在加入OPT后60分鐘停止測定。觀察其熒光強度的變化。將新鮮血漿和紅細胞在-80℃下保存24小時后解凍血漿和紅細胞按照新鮮標本步驟進行處理測量。計算出濃度后同新鮮血漿和紅細胞內GSH/GSSG進行比較。采用spss11.5forwindows統(tǒng)計軟件處理數據。數據用均數±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,統(tǒng)計分析采用t檢驗,p<0.05有統(tǒng)計學意義。2結果2.1重復性和穩(wěn)定性每天新鮮配制GSH和GSSG標準溶液,各重復測定5次結果。其不同含量的合并變異系數(CV)分別為3.25%和2.76%,顯示出良好的重復性,較穩(wěn)定。以均值繪制標準曲線,見圖1。線性關系良好,r值皆大于0.99。其直線回歸方程為:Y=49.41195x-3.5377(GSH)(r=0.997)Y=19.59371x+12.74259(GSSG)(r=0.998)2.2回收率加入標準品后樣品GSH和GSSG的回收率分別為98.1%和97.5%,回收較完全。表明本方法具有良好的準確度。見表1、表2。2.3穩(wěn)定性試驗在加入OPT后前25分鐘熒光強度不穩(wěn)定,在30分鐘時達到穩(wěn)定,其后30分鐘內都較為穩(wěn)定,變化不大(CV<10%)。2.4凍融后的gsh/gssg分析經過凍存后的血漿和紅細胞中的GSH和GSSG都比新鮮血漿和紅細胞的含量升高(p<0.05),但凍融后的紅細胞內的GSH/GSSG比值卻比新鮮紅細胞內的比值降低。見表3和表4。去蛋白與否對凍存的血漿和紅細胞內的GSH、GSSG和GSH/GSSG的測定值有輕微影響,但無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。2.5血漿gsh/gssg的測定共測得42名青年健康志愿者(男20名,女22名,平均年齡23.5歲),其血漿中GSH含量范圍是8.64±1.40μmol·L-1;GSSG的范圍為1.08±0.24μmol·L-1;GSH/GSSG的范圍為10.27±1.54,經正態(tài)性檢驗,呈正態(tài)或近似正態(tài)分布,如圖2。紅細胞中GSH含量的范圍為6.81±1.38μmol·L-1RBC;GSSG的范圍為:0.77±0.39μmol·L-1RBC;GSH/GSSG的范圍為:9.02±3.61。經檢驗符合正態(tài)分布。見圖3。經公式計算出電位,血漿GSH/GSSG的氧化-還原電位Eh=-213.9mV±4.94mV;RBC液GSH/GSSG的氧化-還原電位Eh=-221.4mV±3.16mV。其頻數分布亦符合正態(tài)分布,如圖4。男女性別間無統(tǒng)計學意義的差別(p>0.05)。3gsh/gssg的氧化-還原電位檢測GSH/GSSG是體液中含量最高的蛋白質氧化-還原對,參與對許多代謝、生理功能的調控和防御功能。如黃嘌呤脫氫酶/黃嘌呤氧化酶,由同一基因編碼,主要參與嘌呤核苷酸的代謝。兩者皆催化次黃嘌呤→黃嘌呤→尿酸的氧化降解反應,黃嘌呤脫氫酶以NAD+為電子受體,生成NADH;而黃嘌呤氧化酶則以O2為電子受體,生成超氧陰離子O2和H2O2。兩者活性的轉化主要受控于體液氧化-還原態(tài)的高低,給予GSH使該酶主要表現為黃嘌呤脫氫酶活性,而給予GSSG又可使該酶主要表現為黃嘌呤氧化酶活性,顯示出GSH/GSSG對酶活性的強大調控能力。JonesDP等發(fā)現,血漿GSH/GSSG的比值在中年以前一直很穩(wěn)定,但45歲以后該比值進行性地呈線性增高的氧化態(tài)轉化,顯示其與衰老的可能關系。本研究檢測了健康青年人的GSH/GSSG比值,其血漿內的比值為10.27±1.54,RBC液的比值為9.02±3.61。經計算轉換成為氧化-還原電位,分別為血漿:-213.9mV±4.94mV,RBC液:-221.4mV±3.16mV,與JonesDP的結果相近,略偏向還原方向(Eh更負)。本結果標準差小,呈正態(tài)分布,表明本結果可作為正常國人血漿和紅細胞的GSH、GSSG、GSH/GSSG比值,及其氧化-還原電位的參考值。對GSH和GSSG的測定有酶循環(huán)法,但此法只能測定谷胱甘肽總量,而不能將GSH和GSSG區(qū)分開來;高效液相色譜法(HPLC)雖然可以區(qū)分GSH和GSSG,但樣本的處理過程復雜,價格昂貴。本實驗將組織中谷胱甘肽的熒光測定法改進為對血漿和紅細胞內谷胱甘肽還原型和氧化型的測量。用熒光測定法可以同時測定還原型(GSH)和氧化型(GSSG),其方法具有準確、穩(wěn)定以及操作簡便的特點。其標準曲線線性關系良好;重現性高,變異系數(CV)分別為3.25%和2.76%;回收率在98.1%和97.5%之間,亦顯示出良好的準確度。在熒光物質(OPT)與樣本結合半小時后,熒光讀數顯示出良好的穩(wěn)定性。在對樣品的處理方面,本文摸索了去蛋白對結果的影響,改進了用10%的偏磷酸代替原方法中25%的偏磷酸,以防止對血漿和紅細胞過度去蛋白而影響GSH和GSSG的測定結果。同時本次實驗對樣品保存方式進行了探討,在-80℃條件下凍存的樣品在室溫條件下自然解凍后血漿內和紅細胞的GSH和GSSG都有所升高(p<0.01)