20r-人參皂苷rg3對內(nèi)皮細胞損傷的保護作用及其機制

20r-人參皂苷rg3對內(nèi)皮細胞損傷的保護作用及其機制

動脈硬化是腦梗死、心臟病發(fā)作、壞疽和肢體功能喪失的主要原因之一。開始事件是由內(nèi)皮細胞損傷引起的。內(nèi)皮細胞被誘導分泌多種細胞因子,吸引炎性細胞的趨化和黏附,致使動脈粥樣斑塊形成。動脈粥樣硬化是對血管損傷的過度炎癥反應,其斑塊中有大量的炎癥介導物。腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)是一種主要由活化的單核巨噬細胞產(chǎn)生的糖蛋白,是炎癥反應的關鍵調節(jié)因子之一,可從多種不同的炎癥細胞中釋放,在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中起著關鍵的作用。血管內(nèi)皮細胞表面存在著TNF-α受體,為TNF-α主要的靶細胞之一,與正常細胞相比,其在動脈粥樣硬化病變中的表達明顯增加。TNF-α作用于血管內(nèi)皮細胞,一方面增加黏附分子的表達水平,促進對中性粒細胞的黏附作用;另一方面使血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生其他炎性介質,如白細胞介素-6和白細胞介素-8等,共同介導病變血管的炎癥反應。TNF-α損傷血管內(nèi)皮細胞后,產(chǎn)生明顯的病理和生理學變化,從而啟動局部的炎癥反應和粥樣斑塊的形成。因此,研究保護血管內(nèi)皮細胞的藥物將有利于動脈粥樣硬化的早期防治。20(R)-人參皂苷Rg3是從傳統(tǒng)中藥三七葉中提取分離得到的四環(huán)三萜類二醇型皂苷單體化合物,而五加科植物三七主要分布于我國西南部,是云南省盛產(chǎn)的名貴中藥材,它具有散淤止血,消腫定痛之功效。本研究通過觀察20(R)-人參皂苷Rg3對TNF-α誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞(humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC)損傷的保護作用,探討其對動脈粥樣硬化的可能機制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1細胞植物1.1.2培養(yǎng)基和指示劑20(R)-人參皂苷Rg3,純度98.5%,由昆明醫(yī)學院化學教研室詹爾益教授提供。尼莫地平注射液購自山東方明藥業(yè)股份有限公司;注射用尿激酶購自麗珠集團麗珠制藥廠;RPMI1640培養(yǎng)基干粉購自Gibco公司;胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所;胰蛋白酶、十二烷基硫酸鈉(SDS)、TNF-a均購自Sigma公司;噻唑藍(MTT)購自Bebco公司;熒光指示劑Fura-2/AM購自ANASPEC公司;組織型纖溶酶原激活物(tissueplasminogenactivator,t-PA)、1型纖溶酶原激活物抑制物(type-1plasminogenactivatorinhibitor,PAI-1)濃度測定試劑盒均購自上海太陽生物技術有限公司。1.1.3差顯微試驗二氧化碳培養(yǎng)箱(德國Hereaus);倒置相差顯微鏡(日本Olympus);酶標儀(Bio-radModel680,日本);雙波長熒光分光光度計(RF-5000,日本島津公司)。1.2細胞培養(yǎng)及分組按參考文獻方法,將HUVEC按1×105個/mL的細胞密度接種于96孔板上,置37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育,培養(yǎng)24h后,換無血清RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)孵育24h,將細胞分為正常對照組和TNF-α損傷組。正常對照組:加入無血清1640培養(yǎng)基;TNF-α損傷組:加入含TNF-α終質量濃度為40、20、10、5、2.5μg/L的無血清1640培養(yǎng)基,每一濃度設5個平行孔,作用時間為12、24、48h,實驗重復4次。噻唑藍法檢測細胞存活率,以確定最佳實驗條件。1.3復孔制備個人信息將HUVEC按1×105個/mL的細胞密度接種于96孔板上,分為空白對照組、模型組(TNF-α20μg/L)、20(R)-人參皂苷Rg380、40、20、10、5μmol/L濃度組,每個濃度均設5個復孔,實驗重復4次。在含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h,然后用含無血清的RPMI1640繼續(xù)培養(yǎng)24h。預先加入上述終濃度的20(R)-人參皂苷Rg3培養(yǎng)細胞24h后,將TNF-α加入模型組和20(R)-人參皂苷Rg3各組,TNF-α刺激細胞24h,用噻唑藍法檢測細胞活性。1.4細胞內(nèi)游離鈣濃度的測定Fura-2/AM熒光探針負載細胞成功后,用Tyrode-HEPES緩沖液調整細胞數(shù)至1×106個/mL,將細胞懸液吸入有攪拌裝置的石英杯中,用雙波長熒光光度法測定細胞內(nèi)游離鈣濃度。細胞懸液分為正常對照組、模型組(TNF-α20μg/L)、20(R)-人參皂苷Rg380、40、20、10、5μmol/L濃度組、50μmol/L尼莫地平組,每個濃度均設5個復孔,實驗重復4次。用直線回歸方法計算藥物影響鈣濃度的半數(shù)抑制濃度(halfmaximalinhibitoryconcentration,IC50)。1.5細胞培養(yǎng)和tnf-活性將HUVEC按1×105個/mL的細胞密度接種于96孔板上,分為空白對照組、模型組(TNF-α20μg/L)、20(R)-人參皂苷Rg380、40、20、10、5μmol/L濃度組、20000IU/mL尿激酶組,每個濃度均設5個復孔,實驗重復4次。在含10﹪胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h,然后用含無血清的RPMI1640繼續(xù)培養(yǎng)24h。預先加入上述不同濃度的20(R)-人參皂苷Rg3培養(yǎng)內(nèi)皮細胞24h后,將TNF-α加入模型組和20(R)-人參皂苷Rg3各組,TNF-α刺激細胞24h后,吸取每孔上清液-20℃保存,采用酶聯(lián)免疫吸附法測定細胞上清液t-PA和PAI-1濃度。用直線回歸方法計算藥物影響PAI-1濃度的IC50。1.6方差分析和q檢驗采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行分析,所有數(shù)據(jù)用(x±s)表示,組間比較采用方差分析,兩兩比較采用q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1不同存活率率比較不同濃度TNF-α作用12、24、48h細胞存活率比較,詳見表1。通過實驗選定TNF-α損傷HUVEC的條件:TNF-α的濃度為20μg/L,損傷時間為24h,在此條件下細胞損傷適中。2.2對照組、模型組和不同濃度為20r的人參糖苷rg3組的huvec活性對照組、模型組及不同濃度20(R)-人參皂苷Rg3組HUVEC活性(吸光度A值)比較,詳見表2。2.3不同處理對huvdc內(nèi)鈣離子濃度的比較對照組、模型組、不同濃度20(R)-人參皂苷Rg3組及尼莫地平組HUVEC內(nèi)鈣離子濃度比較,詳見表3。直線回歸方法計算20(R)-人參皂苷Rg3影響鈣濃度的IC50為67.2μmol/L。2.4尿激酶對t-pa及pai-1濃度的影響對照組、模型組、不同濃度20(R)-人參皂苷Rg3組及尿激酶組t-PA及PAI-1濃度比較,詳見表4。直線回歸方法計算20(R)-人參皂苷Rg3抑制PAI-1濃度的IC50為36.9μmol/L。3tnf-調節(jié)細胞內(nèi)皮細胞凋亡血管內(nèi)皮細胞是機體一類重要的細胞群體,在血管通透性屏障、免疫防御及炎癥反應中起著重要的作用。TNF-α是一種主要由活化的單核巨噬細胞系統(tǒng)分泌的炎癥介質,對血管內(nèi)皮細胞有多方面的作用,其損傷作用表現(xiàn)為對血管內(nèi)皮細胞的直接作用或通過其他細胞因子產(chǎn)生的作用,造成血管內(nèi)皮細胞形態(tài)改變,細胞膜及細胞器損害等。有報道,TNF-α對血管內(nèi)皮細胞具有直接細胞毒作用,增加內(nèi)皮細胞的通透性,使內(nèi)皮細胞間隙增大,可促進單核細胞、白細胞等跨內(nèi)皮遷移。本研究采用TNF-α作為誘導HUVEC損傷的因素,通過噻唑藍法測定HUVEC存活率。實驗結果表明,在觀察的濃度范圍內(nèi),TNF-α使HUVEC的活性降低,而預先加入20(R)-人參皂苷Rg3干預可提高HUVEC的活性,提示20(R)-人參皂苷Rg3具有抗TNF-α誘導的內(nèi)皮細胞損傷的作用。內(nèi)皮細胞的許多功能活動與細胞內(nèi)鈣動員有關,而且內(nèi)皮細胞活化后產(chǎn)生和分泌的許多血管活性物質又具有鈣離子敏感性和鈣離子依賴性。鈣離子本身可作為一種凋亡信號,調節(jié)關鍵酶誘導的內(nèi)皮細胞凋亡。TNF-α與細胞膜上的TNF-α受體結合后,通過IP3-鈣離子-鈣調蛋白激酶途徑導致細胞內(nèi)鈣釋放和細胞外鈣內(nèi)流,使細胞內(nèi)的游離鈣離子濃度升高。細胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高嚴重干擾線粒體的功能,導致氧化磷酸化過程受損,甚至導致線粒體的結構破壞;激活磷脂酶促進膜磷脂水解,造成細胞膜及細胞器膜受損,同時膜磷脂降解產(chǎn)物花生四烯酸、溶血磷脂等增多亦可導致細胞的功能紊亂;激活蛋白水解酶使自由基生成增加,或通過影響細胞基因的表達,誘發(fā)細胞的凋亡或壞死。本實驗結果表明,TNF-α能誘導內(nèi)皮細胞游離鈣離子濃度顯著增高,導致細胞內(nèi)鈣離子超載,說明TNF-α損傷內(nèi)皮細胞的作用可能是以鈣離子為信使進行細胞間信息傳遞的,這可能是TNF-α介導細胞損傷的重要機制之一。在本研究中,預先加入20(R)-人參皂苷Rg3能顯著抑制TNF-α誘導的內(nèi)皮細胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高,防止細胞內(nèi)鈣離子超載,提示20(R)-人參皂苷Rg3保護血管內(nèi)皮細胞損傷與其緩解細胞鈣超載有關。t-PA和PAI-1是纖溶系統(tǒng)的重要組成部分,t-PA使纖溶酶原激活為有活性的纖溶酶,啟動機體的纖溶系統(tǒng),促使局部血栓溶解;PAI-1是血漿中t-PA的重要生理快速抑制劑,以阻止t-PA啟動纖溶系統(tǒng),而促進血栓的形成和延展。近年研究表明,PAI-1對纖溶系統(tǒng)起著從頭抑制的作用,正常情況下,t-PA和PAI-1能夠在體內(nèi)以1∶1的比例形成穩(wěn)定的復合物,從而維持纖溶系統(tǒng)平衡。目前認為,血管內(nèi)皮損傷、血漿PAI-1增多是動脈粥樣硬化等血管、血栓性疾病發(fā)生的主要原因之一。PAI-1表達增高是動脈硬化或原發(fā)性高血壓疾病出現(xiàn)血液高凝現(xiàn)象的主要原因之一。研究表明,TNF-α能明顯增加HUVECPAI-1mRNA表達,說明在TNF-α作用下,PAI-1活性增加是由于HUVEC轉錄PAI-1基因增強,致使PAI-1蛋白合成增多所致;TNF-α增強HUVECPAI-1活性與mRNA表達,PAI-1活性提高與其mRNA表達增加呈正相關。本研究結果顯示,TNF-α20μg/L刺激內(nèi)皮細胞24h后,t-PA的濃度明顯下降,PAI-l濃度則出現(xiàn)顯著增高,增多的PAI與t-PA結合,導致局部纖溶系統(tǒng)傾向于血栓形成。這表明TNF-α影響血管內(nèi)皮細胞的功能主要是增強PAI-1濃度。本研究在預先用20(R)-人參皂苷Rg3干預后,發(fā)現(xiàn)20~80μmol/L的20(