蟲草素對結(jié)腸癌細胞增殖和遷移能力的影響

蟲草素對結(jié)腸癌細胞增殖和遷移能力的影響

草地昆蟲素是牧草最重要的生理活性成分。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認為:冬蟲夏草性平味甘,入肺、腎二經(jīng),“肺與大腸相表里”。研究顯示北冬蟲夏草具有提高免疫力和抗腫瘤的作用。但是冬蟲夏草的主要有效成分蟲草素是否同樣具有預(yù)防和治療結(jié)腸癌的作用及其作用機制引起廣泛關(guān)注。本研究運用血清藥理學(xué)的方法,給BALB/c裸鼠分別喂飼蟲草素或同體積生理鹽水后處死取血清,將各組血清分別或聯(lián)合順鉑在體外與人結(jié)腸癌細胞株SW1116共培養(yǎng),研究蟲草素對結(jié)腸癌細胞的增殖、遷移能力的影響,及其誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用。材料和方法一、動物房標準飼養(yǎng)6~8周齡大BALB/c雌性裸鼠,體重20g左右,由中國科學(xué)院上海生物化學(xué)和細胞生物學(xué)研究所動物房提供,在復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院動物房SPF條件下標準飼養(yǎng)。人結(jié)腸癌細胞株SW1116由上海消化外科研究所保留傳代。二、細胞毒性檢測蟲草素(北冬蟲夏草提取)由中國國寶生物研究所提供,生產(chǎn)批號:20090201;RPMI1640培養(yǎng)液(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司);順鉑(齊魯制藥有限公司);CCK-8細胞増殖/細胞毒性分析試劑盒(中國碧云天生物技術(shù)研究所);AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(中國碧云天生物技術(shù)研究所);Hoechst33258熒光檢測試劑盒(中國碧云天生物技術(shù)研究所);Safire2型多功能酶標儀(瑞士Tecan公司);U-SPT熒光顯微鏡(Olympus,日本);H-500透射電子顯微鏡(Hitachi,日本);BDCalibur流式細胞儀(BDBiosciences,美國)。三、連續(xù)給藥4d劑量l選用6~8周齡BALB/c雌性裸鼠20只。隨機分為蟲草素組和空白對照組,每組10只。蟲草素組:按1000mg·kg-1·d-1的量,每日喂飼蟲草素配制液0.3ml(每0.3ml含20mg蟲草素);空白對照組:每日喂飼生理鹽水0.3ml。各組裸鼠連續(xù)喂飼3d,末次給藥后1h處死小鼠取血。為避免溶血,將每只小鼠血液分別離心取上層血清后,再將同組血清混合,-80℃保存?zhèn)溆谩Ｋ?、組和處理1.組取處于對數(shù)生長期的SW1116腫瘤細胞,隨機分為四組:蟲草素組、化療組、蟲草素+化療組、空白對照組。2.增設(shè)保養(yǎng)劑為抗菌素聯(lián)合化療組edta的細胞培養(yǎng)CCK-8試劑盒以一種新的四唑鹽為底物,經(jīng)細胞代謝產(chǎn)生水溶性甲瓚產(chǎn)物,可直接用酶標儀檢測450nm和630nm吸光度值(OD值),OD值與活細胞數(shù)量成正比。取處于對數(shù)生長期的SW1116腫瘤細胞,用0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化后計數(shù),以100μl/孔(5000個細胞)接種于96孔培養(yǎng)板,各組分別加入下列處理因素:(1)蟲草素組:將喂飼蟲草素的裸鼠10份血清混合后取1/200的量(0.119μl)加入該組腫瘤細胞;(2)化療組:以順鉑0.001mg+空白對照組血清10份混合后的1/200的量(0.1μl)加入該組腫瘤細胞;(3)蟲草素+化療組:將喂飼蟲草素的裸鼠10份血清混合后取1/200的量(0.119μl)+順鉑0.001mg加入該組腫瘤細胞;(4)空白對照組:空白對照組血清10份混合后的1/200的量(0.1μl)加入該組腫瘤細胞。上述各組加樣后將96孔培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)0h、24h、48h、72h、96h、120h后,以CCK-8法檢測細胞增殖抑制作用。3.細胞培養(yǎng)和樣品前處理腫瘤細胞懸液制備:各組細胞棄去原培養(yǎng)液,無菌PBS液洗滌以充分除去死亡細胞,以新鮮的無血清培養(yǎng)液重懸細胞并計數(shù),調(diào)整細胞懸液的濃度至5×105個細胞/ml。分別加入下列各處理因素:(1)蟲草素組:將蟲草素組10份血清混合后取1/100的量(0.238μl)加入該組腫瘤細胞;(2)化療組:以順鉑0.002mg+空白對照組血清10份混合后的1/100的量(0.2μl)加入該組腫瘤細胞;(3)蟲草素+化療組:將蟲草素組10份血清混合后取1/100的量(0.238μl)+順鉑0.002mg加入該組腫瘤細胞;(4)空白對照組:空白對照組血清10份混合后的1/100的量(0.2μl)加入該組腫瘤細胞。每組細胞200μl(1×105個細胞/孔)加入Transwell小室的上室,下室中加入600μl含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。細胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。棄去上室中的培養(yǎng)液,取出小室,吸棄上室液體,用棉簽仔細擦凈膜上未遷移的細胞,取下上室底部的膜。37℃預(yù)溫的PBS液漂洗兩次,4%多聚甲醛固定,Giemsa染液染色。顯微鏡200×視野下任取6個不重復(fù)視野,拍照計數(shù)。以上實驗重復(fù)2次。4.腫瘤細胞染色體畸變試驗各組細胞棄去原培養(yǎng)液,以每孔4×105個細胞鋪入6孔板,如下加樣:(1)蟲草素組:將蟲草素組10份血清混合后取1/25的量(9.52μl)加入該組腫瘤細胞;(2)化療組:以順鉑0.08mg+空白對照組血清10份混合后的1/25的量(8μl)加入該組腫瘤細胞;(3)蟲草素+化療組:將蟲草素組10份血清混合后取1/25的量(9.52μl)+順鉑0.08mg加入該組腫瘤細胞;(4)空白對照組:空白對照組血清10份混合后的1/25的量(8μl)加入該組腫瘤細胞。細胞凋亡過程中細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)發(fā)生改變,分為三期:Ⅰ期的細胞核呈波紋狀(rippled)或呈折縫樣(creased),部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài);Ⅱa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化;Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊,產(chǎn)生凋亡小體。凋亡細胞在熒光顯微鏡下顯示為亮藍色細胞,而正常細胞為暗藍色。5.流式細胞儀檢測結(jié)果SW1116腫瘤細胞以500μl/孔(4×105個細胞)接種于6孔培養(yǎng)板。如下加樣:(1)蟲草素組:將蟲草素組10份血清混合后取1/25的量(9.52μl)加入該組腫瘤細胞;(2)化療組:以順鉑0.08mg+空白對照組血清10份混合后的1/25的量(8μl)加入該組腫瘤細胞;(3)蟲草素+化療組:將蟲草素組10份血清混合后取1/25的量(9.52μl)+順鉑0.08mg加入該組腫瘤細胞;(4)空白對照組:空白對照組血清10份混合后的1/25的量(8μl)加入該組腫瘤細胞。流式細胞儀檢測結(jié)果判斷標準如下:正常的活細胞不被AnnexinV-FITC和碘化丙啶染色;早期凋亡細胞僅被AnnexinV-FITC染色,碘化丙啶染色呈陰性;凋亡晚期細胞可以同時被AnnexinV-FITC和碘化丙啶染色;壞死細胞僅被碘化丙啶染色,AnnexinV-FITC染色呈陰性。重復(fù)3次,取均數(shù),統(tǒng)計細胞凋亡率。五、統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(ˉx±s)表示,兩組間差異比較采用t檢驗,多組間差異采用單因素方差分析(One-wayANOVA)檢驗,統(tǒng)計分析由SPSS11.5統(tǒng)計軟件包完成,P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果一、煙草素和化療組各刑罰執(zhí)行指標比較處理后四組細胞OD值和生長曲線見圖1,表1。處理24h后,蟲草素組OD值小于空白對照組(P=0.01);化療組OD值小于空白對照組(P=0.01),蟲草素+化療組OD值小于其余三組(與蟲草素組比較P=0.01,與化療組比較P=0.03,與空白對照組比較P<0.01)。處理48h及72h后,蟲草素+化療組和化療組OD值均低于其余兩組,但該兩組相互之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(48h:P=0.30,72h:P=0.14);蟲草素組OD值均小于空白對照組。處理96h后,蟲草素+化療組OD值小于其余三組(與化療組比較P=0.02,與蟲草素組和空白對照組比較均為P<0.01);化療組OD值小于蟲草素組;蟲草素組OD值小于空白對照組。以上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。處理120h后,蟲草素+化療組OD值小于其余三組(與化療組比較P=0.02,與蟲草素組和空白對照組比較均為P<0.01);化療組OD值小于蟲草素組;蟲草素組OD值小于空白對照組。以上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。二、遷移細胞數(shù)的比較處理后四組細胞(×200不同視野下)細胞數(shù)見圖2~5。遷移實驗統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果(表2):蟲草素+化療組發(fā)生遷移細胞數(shù)為(38.17±4.41)個,少于其余三組;化療組發(fā)生遷移細胞數(shù)為(66.58±6.43)個,少于蟲草素組和空白對照組;蟲草素組發(fā)生遷移細胞數(shù)為(116.83±6.74)個,少于空白對照組。以上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=91.04,P<0.01)。三、細胞肺癌試驗的結(jié)果1.凋細胞改變Hoechst33258熒光染色可將正常細胞、凋亡細胞區(qū)別開來。熒光顯微鏡下(圖6~9)可見典型的凋亡細胞改變,細胞呈亮藍色,早期有體積縮小、月牙形細胞核等改變,晚期可見核碎裂等。實驗結(jié)果提示:除空白對照組外,其余三組均可見大量呈亮藍色的凋亡細胞,其中蟲草素+化療組與其余三組相比,可見更多凋亡細胞。2.各組細胞凋亡率四組細胞經(jīng)不同處理后,結(jié)果顯示蟲草素+化療組細胞凋亡率[(28.10±4.21)%]高于其余三組細胞凋亡率[蟲草素組:(16.19±5.65)%,化療組:(14.90±3.56)%,空白對照組:(6.83±1.65)%],差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而其余三組之間兩兩比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。討論一、活性成分對體外實驗的作用近年來,結(jié)腸惡性腫瘤的發(fā)病率與死亡率呈上升趨勢,歐美國家結(jié)直腸癌的發(fā)病率位列惡性腫瘤的第二位,在我國為第四位。據(jù)2005年上海統(tǒng)計,結(jié)直腸癌的發(fā)病率已高居惡性腫瘤的第二位。手術(shù)仍是目前治療結(jié)直腸腫瘤的主要手段。但近30年來療效提高并不顯著。由于大部分結(jié)直腸惡性腫瘤患者在臨床確診時已伴有腹膜轉(zhuǎn)移或其他重要臟器的微轉(zhuǎn)移,單靠擴大切除范圍難以改善預(yù)后。臨床常采用術(shù)后輔助化療為主的綜合治療方案,間或加用物理治療、靶向藥物和中藥,但中晚期患者的術(shù)后無瘤生存率和總生存率仍不令人滿意。約有50%的患者死于術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此,有必要探尋新型輔助藥物以提高結(jié)直腸癌療效,改善預(yù)后。冬蟲夏草是我國的珍稀藥材,其具有提高免疫力和抗腫瘤的作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示:冬蟲夏草中最主要的生理活性成分為蟲草素和蟲草多糖(CP)。有研究顯示CP可以通過激活宿主免疫反應(yīng)而發(fā)揮抗腫瘤作用。另有研究顯示蟲草素和CP能夠促進人扁桃體及小鼠T-淋巴細胞的增殖,并且能夠促進環(huán)磷酰胺(CY)抑制鼠脾活化T細胞增殖;在一定濃度下,可以顯著升高人扁桃體活化T細胞TNF-β的分泌水平,這對增強機體抗腫瘤免疫功能具有很大的作用。但目前文獻報道的體外實驗大多將蟲草素或CP直接作用于離體細胞,這與臨床實際用藥以及藥物實際作用情況明顯不符。一般在臨床上患者口服用藥后,藥物需經(jīng)消化道吸收、經(jīng)血液運送到全身各部、再經(jīng)機體代謝和排泄,因此對腫瘤起治療作用的成分不一定是藥物的原形,它可以是經(jīng)代謝后的其他產(chǎn)物,也可以是藥物在體內(nèi)經(jīng)過許多中間環(huán)節(jié)引導(dǎo)機體產(chǎn)生的其他藥理反應(yīng),為此我們根據(jù)血清藥理學(xué)的原則設(shè)計了本實驗:先給裸鼠喂飼蟲草素,讓藥物經(jīng)消化道進入機體,通過一定的代謝過程,使血液富含藥物有效成分,然后提取其血清,在體外將含藥血清和(或)聯(lián)合鉑類化療藥物作用于結(jié)腸癌SW1116細胞,借以間接觀察蟲草素對腫瘤細胞增殖、遷移的影響及其誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。如此設(shè)計似較直接加藥法更符合臨床實際,更為合理?！把逅幚韺W(xué)”的概念和基本原理最早在1988年由日本學(xué)者田代真一提出,用于改進以前的不太合理的體外藥理實驗方法。事實上體外實驗是藥理的實驗研究中不可或缺的手段。其優(yōu)點是條件可控性強,可在細胞、亞細胞水平進行超微、生化、受體、基因等方面的研究,揭示藥物機制較為深入,重復(fù)性好,使用材料少。但隨著研究的深入,某些藥物直接加入離體反應(yīng)體系進行體外實驗的研究方法存在很多問題。由于某些藥物化學(xué)成分復(fù)雜,口服后體內(nèi)要進行一系列的生物轉(zhuǎn)化以發(fā)揮藥效,而且理化性質(zhì)復(fù)雜,經(jīng)常造成一些假陰性和假陽性的結(jié)果,例如:20世紀50、60年代國內(nèi)外用腫瘤細胞株在體外過篩數(shù)千種植物提取物,報道了上百個陽性結(jié)果,但用于體內(nèi)實驗結(jié)果大部分為陰性。這促使各國學(xué)者不斷努力,尋找更好的方法。1984年,在日本召開的第一屆和漢醫(yī)藥學(xué)會上,日本學(xué)者首次提出給動物灌服藥物一定時間后,取其血清進行實驗的藥理學(xué)新方法。1988年田代真一正式提出了“血清藥理學(xué)”這一新概念。此后,血清藥理學(xué)廣泛應(yīng)用于腫瘤、心血管、消化、免疫等方面的藥理學(xué)研究中,并與體外實驗所見作比較,取得了很大的進展。為此本研究應(yīng)用血清藥理學(xué)方法,進行蟲草素抗結(jié)腸癌的體外實驗。二、牧草素聯(lián)合化療藥物的作用人結(jié)腸癌細胞具有增殖快、易于向周圍組織浸潤及經(jīng)淋巴道早期轉(zhuǎn)移的特點,這是結(jié)腸癌導(dǎo)致患者死亡的重要原因。腫瘤細胞的遷移是造成腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素。有效地抑制腫瘤細胞增殖、減少細胞遷移,可以減少腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生率。本研究通過CCK-8細胞增殖抑制實驗發(fā)現(xiàn),蟲草素組血清在作用于結(jié)腸癌細胞株SW111624h后出現(xiàn)顯著抑制細胞增殖的作用,但對細胞增殖的抑制作用不如傳統(tǒng)化療藥物順鉑明