奶牛布氏桿菌病的診斷與防治

奶牛布氏桿菌病的診斷與防治

草坪病，也被稱為狼病，是由腸球菌引起的自然流行病。該病可感染人類、多種家畜和野生動物,引起相似的臨床癥狀與病理損傷,如發(fā)熱、流產、死胎、不育等,造成巨大的經濟損失,導致嚴重的公共衛(wèi)生問題,危害人類健康。家畜布氏桿菌病常發(fā)生于牛、豬、羊,是引起人類布氏桿菌病的主要傳染源。為此,世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將布氏桿菌病列為B類動物疫病,我國將其列為二類動物疫病,是國際貿易衛(wèi)生檢疫中必檢的傳染病。2008年10～12月份期間,某規(guī)模養(yǎng)殖場先后從天津、唐山、西安引進奶牛258頭,與本地奶?；烊猴曫B(yǎng)。隨著奶牛的大量異地調運,該場布病疫情出現快速上升的趨勢。2009年6月份至11月份,該場布病感染陽性奶牛的比例從0.85%上升到5.89%;從2009年11月10日～2010年2月11日,在3個月的時間內感染牛群中44頭奶牛發(fā)生了流產、死胎。上述結果證實,該規(guī)模養(yǎng)殖場發(fā)生了布氏桿菌野生強毒株的侵襲和蔓延。嚴峻的布病疫情不僅制約了奶牛業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,而且威脅著牛乳及其乳制品的安全,成為影響國計民生的一件大事。我國對家畜布氏桿菌病采取以檢疫凈化為主的綜合防控措施,同時包括對重點疫區(qū)的易感動物接種疫苗,待臨床病例逐漸減少和疫情得到有效控制以后,再實施群體和地域的凈化。為此,該規(guī)模養(yǎng)殖場對布病陽性牛進行隔離淘汰處理,對布病陰性牛(假定健康牛)進行免疫接種。現將奶牛群接種S2株布氏桿菌減毒活疫苗的免疫效果報告如下。1材料和方法1.1內使用—試劑、疫苗布病虎紅平板凝集試驗抗原和試管凝集試驗抗原購自青島易邦生物工程有限公司,在有效期內使用,按GB/T18646—2002規(guī)定的程序操作;S2株布氏桿菌活疫苗購自中牧實業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠,每瓶含布氏桿菌弱毒活菌4000億CFU,用生理鹽水稀釋疫苗,每頭奶?？诜臃N500億活菌劑量,以投藥器噴注到牛舌根及咽喉部免疫。1.2疫苗安全試驗口服接種S2株布氏桿菌減毒活疫苗以后,觀察奶牛群的疫苗接種反應,記錄疫苗接種前后一個月的泌乳牛產量。1.3服免疫對布病感染牛群控制排流率根據奶牛場的生產記錄,逐月統(tǒng)計疫苗接種前后能繁母牛發(fā)生流產、死胎的病例數,了解口服免疫對布病感染牛群控制流產率的效果;口服接種活疫苗以后15d、30d、45d、60d和90d,對免疫奶牛群按20%的比例隨機抽取血液樣本,定性(虎紅平板凝集試驗)和定量(試管凝集試驗)檢測血清中的布氏桿菌抗體水平,了解活疫苗誘導的抗體消長動態(tài)。1.4pcr檢測omp25基因的擴增10×PCRBuffer、MgCl2、dNTP、TaqDNA聚合酶、D200DNAMarker等購自大連寶生物工程有限公司。按照中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準(NY/T1467—2007),從鮮乳樣本提取總DNA作為模板,針對布氏桿菌OMP25基因合成內外兩對引物,采用嵌合式PCR方法進行擴增,擴增完成以后取5μLPCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。同時以S2株布氏桿菌活疫苗作為陽性對照,滅菌雙蒸水作為空白對照,預期擴增片段長度為419bp的DNA條帶。2結果2.1泌乳牛和牛奶產量奶牛群接種S2株布氏桿菌減毒活疫苗以后,均未觀察到任何接種反應,包括發(fā)熱、呼吸急促、食欲下降、流產和死胎等癥狀;接種疫苗前一個月泌乳牛產量達到13.65kg,接種疫苗后一個月泌乳牛產量為13.66kg,對牛奶產量沒有顯著的影響。結果表明S2株布氏桿菌減毒活疫苗口服接種是安全的。2.2接種疫苗之前是否能繁民法?2010年2月14日該奶牛場口服接種S2株布氏桿菌減毒活疫苗,疫苗接種前后逐月統(tǒng)計能繁母牛的流產率,結果見圖1。接種疫苗以前3個月,布病感染奶牛場中能繁母牛的月平均流產率達到4.55%,2月上旬出現流產高峰(7.34%);接種疫苗以后,能繁母牛的月平均流產率降低至2.11%,目前控制在1%以下。試驗結果證實,S2株布氏桿菌減毒活疫苗能有效控制布病感染牛群流產、死胎率,減少能繁母牛因流產、死胎導致的經濟損失。2.3免疫牛檢測抗體水平奶牛群接種疫苗以后,定期采集血清樣本檢測疫苗誘導的抗體水平,結果見表1。奶牛接種疫苗以后15d,即可檢出疫苗誘導的布氏桿菌抗體,29.7%的免疫牛顯現虎紅平板凝集陽性(血清學轉換);30d抗體水平達到高峰(36%);45～90d抗體陽性率呈現緩慢下降的趨勢(31.1%→245%)。試管凝集定量檢測的抗體效價較低,5.6%～14%的血清樣本抗體效價為1:50;6.9%～10.8%的血清樣本抗體效價達到1:100以上。試管凝集試驗測定的抗體消長動態(tài)與虎紅平板凝集結果基本一致。監(jiān)測結果表明,口服接種S2株布氏桿菌減毒活疫苗誘導形成的血清抗體水平較低,消失也較緩慢。2.4菌種omp實施嵌合式pcr檢測結果從接種疫苗的奶牛群不間斷隨機采集鮮乳樣本90份,按NY/T1467—2007規(guī)定的程序操作,針對布氏桿菌OMP25基因進行嵌合式PCR擴增。結果見圖2。S2株布氏桿菌活疫苗陽性對照顯現一條約420bp的DNA條帶,滅菌雙蒸水空白對照不顯現任何條帶,4份被檢鮮乳樣本顯現一條約420bp的DNA帶,與預期擴增長度相符合。檢測結果證實,免疫奶牛鮮乳樣本中能夠檢出布氏桿菌核酸,檢出率為4.44%(4/90)。3布氏桿菌接種疫苗后存在的問題3.1根據我國對牲畜布病疫情的監(jiān)測結果分析,在20世紀80年代以前,布病疫區(qū)主要集中在內蒙古、新疆、青海、寧夏和西藏五大牧區(qū);從20世紀90年代以后,牧區(qū)布病疫情依然嚴重,同時半農半牧區(qū)和農區(qū)省份的布病疫情明顯上升。2008年底,該規(guī)模養(yǎng)殖場從天津、唐山、西安大量引進奶牛,與本地牛群混合飼養(yǎng),導致了布病疫情的流行和蔓延。由于養(yǎng)殖場中奶牛的布病感染率和患病率較高,處于布病感染潛伏期的奶牛數量較大,現階段對布病重點疫區(qū)實施疫苗接種和檢疫撲殺的綜合防控策略。試驗結果表明:對奶?？诜臃NS2株布氏桿菌減毒活疫苗是安全的,免疫接種能夠有效控制布病感染牛群發(fā)生流產、死胎的癥狀,減少由此導致的經濟損失。但是,疫苗接種只是一種權宜之計,是目前控制重點疫區(qū)布病流行的一種方法。由于疫苗接種動物與自然患病動物無法甄別,一旦奶牛群接種活疫苗以后,法定檢疫措施嚴重受阻。另一方面,布氏桿菌是一種慢性胞內寄生感染菌,疫苗活菌在動物體內殘存的時間較長,對奶牛群構成潛在的風險。同時,S2株活疫苗對人體具有一定的毒性,對奶牛場的飼養(yǎng)員、繁殖員和獸醫(yī)形成潛在的威脅。根據內蒙古農牧業(yè)科學院防制布病的經驗,采用“S2株菌苗口服免疫為主的綜合性防制措施”,一年一次即可控制布病大面積流行,連續(xù)3年免疫可完全控制布病,通過加強檢疫、監(jiān)測和逐步淘汰,3～5年內可實現奶牛場布病凈化的目標。3.3OMP25存在于所有布氏桿菌中,是布氏桿菌主要外膜蛋白成分之一;OMP36主要存在于牛流產布氏桿菌(B.abortus)中,是構成跨膜通道的膜孔蛋白;OMP31主要存在于羊馬爾它熱布氏桿菌(B.melitensis)中,在綿羊附睪型布氏桿菌(B.ovis)和犬布氏桿菌(B.canis)中表達量也相對較高。按農業(yè)行業(yè)標準NY/T1467—2007規(guī)定的程序操作,針對布氏桿菌OMP25基因進行嵌合式PCR擴增,有利于提高樣本中布氏桿菌的檢出率,保證布氏桿菌核酸擴增的屬特異性。溫富勇等采用布病乳汁環(huán)狀試驗抗原檢測了86份免疫奶牛的鮮乳樣本,未檢出布氏桿菌特異性抗體,因此認為乳汁是安全的;風英等采用選擇性培養(yǎng)基對鮮乳樣本進行細菌學檢查,未分離到布氏桿菌,因此認為布病陰性泌乳牛免疫后乳汁無排菌現象;本試驗從布病陰性奶牛免疫后采集的鮮乳樣本檢出布氏桿菌核酸,檢出率為4.44%。關于疫苗接種奶牛是否存在乳汁排菌的風險,各地學者持有不同的觀點,有不同的報告結果,還有待于進一步深入研究。中國農業(yè)大學動物布病防控研究室吳清明指出,在布魯氏病流行和防控技術研究對策中,應增加動物性食品布病病原體的基本檢測項目。近年來隨著現代分子生物學技術的不斷發(fā)展,國內外學者開始將多聚酶鏈式反應技術(PCR)應用于布氏桿菌核酸的檢測。在本試驗檢出的4份陽性鮮乳樣本中,是存在活的布氏桿菌還是死的布氏桿菌,是接種的減毒疫苗株還是流行的野生強毒株,目前尚不清楚,關于鮮乳樣本中布氏桿菌的分離培養(yǎng)與種型鑒定正在研究中。3.2奶牛接種布氏桿菌疫苗后,以誘導機體細胞免疫為主