產(chǎn)淀粉糖化酶米曲霉的篩選與鑒定

產(chǎn)淀粉糖化酶米曲霉的篩選與鑒定

作為一種發(fā)酵黃酒的糖化劑，麥曲含有大量的微生物可以分泌淀粉糖化酶。糖化酶可將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖，然后被微生物發(fā)酵，生產(chǎn)酒精。糖化酶活力高,原料利用率就高,因此篩選高產(chǎn)糖化酶菌株對釀酒工業(yè)具有重要意義。本研究從不同麥曲中分離篩選高產(chǎn)淀粉糖化酶菌株,依據(jù)形態(tài)特征和ITS序列分析對篩選菌株進(jìn)行鑒定,并研究了粗酶的酶學(xué)特性。1材料和方法1.1in認(rèn)為斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯(去皮)200g,葡萄糖20g,水1000mL,瓊脂20g,自然pH值,121℃濕熱滅菌20min。選擇性平板培養(yǎng)基(產(chǎn)透明圈):可溶性淀粉2g,蛋白胨0.5g,瓊脂20g,氯化鈣0.4g,磷酸氫二鈉0.8g,自然pH值;水1000mL,121℃高壓蒸汽滅菌20min。固體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基:麩皮8g,玉米粉1g,大豆粉1g,鹽溶液10mL,121℃高壓蒸汽滅菌20min(鹽溶液:K2HPO42%,(NH4)2SO44%)。1.2淀粉糖化酶活力測定初篩:取粉碎好的麥曲10g,裝入帶玻璃珠的90mL無菌水的三角瓶中,搖晃打散,使麥曲中的微生物形成懸浮液,用無菌移液管對懸浮液進(jìn)行稀釋,稀釋至10-1~10-6。吸取各種稀釋度溶液0.1mL涂布于選擇性培養(yǎng)基平板上,置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d,取出培養(yǎng)皿,滴加盧戈氏碘液,測量透明圈直徑D和菌株直徑d。挑取D/d較大的菌株接種斜面保藏。復(fù)篩:無菌水洗出孢子,用血球計數(shù)板調(diào)整孢子濃度,接種于固體培養(yǎng)基中?；靹蚝?30℃培養(yǎng)72h,培養(yǎng)期間每隔一段時間搖動一次。培養(yǎng)結(jié)束后,加入50mL蒸餾水并將固體培養(yǎng)基搗碎,40℃水浴1h,取出粗酶液8000r/min離心5min,棄沉淀得粗酶液,測定淀粉糖化酶活力。淀粉糖化酶活力測定采用碘量法。酶活力單位定義為1mL酶液,于40℃、pH4.6的條件下,1h分解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖,即為1個酶活力單位,以U/g(U/mL)表示。1.3提取細(xì)菌dna和pcr擴(kuò)增采用北京索萊寶科技有限公司的真菌基因組提取試劑盒提取純株真菌的基因組DNA。1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。PCR擴(kuò)增參照方華等的方法。1.4酶特征的研究1.4.1溫度對水浴鍋酶活力的影響在自然pH值條件下,將酶液和淀粉混合液分別置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴鍋中水解30min,測定酶活力,考察溫度對酶活的影響。將酶液分別置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴鍋中加熱30min,然后再加入淀粉溶液,在40℃測定殘余酶活力,考察溫度穩(wěn)定性。每組重復(fù)3次,取平均值。1.4.2ph值對產(chǎn)酶的影響配制pH值不同的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液:pH3.0、pH4.0、pH5.0、pH6.0、pH7.0,在40℃分別測定酶活力,考察pH值對酶活的影響。將酶液置于不同pH值的緩沖液中30min,然后再加入淀粉溶液,40℃酶解30min,測定酶活。每組重復(fù)3次,取平均值。1.4.3金屬離子對淀粉酶活性的影響在反應(yīng)體系中分別加入1mL濃度為1mmol/L的各種金屬離子,研究金屬離子對淀粉酶活性的影響。2結(jié)果與分析2.1景觀菌株的復(fù)篩滴加盧戈氏碘液后,靜置30min。觀察培養(yǎng)皿中有無透明圈,若有,測量菌株直徑d和透明圈直徑D,挑選D/d較大的菌株進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩結(jié)果見表1,其中菌株A17糖化酶活力最高。2.2香辛料ls1b菌株A17的菌落形態(tài)和鏡檢形態(tài)見圖1。A17的菌落形態(tài):菌落生長快,10d直徑達(dá)5cm~6cm,質(zhì)地疏松,初白色、黃色,后變?yōu)楹稚恋G褐色。背面無色。在含0.05%茴香醛的察氏培養(yǎng)基上,分生孢子呈現(xiàn)紅色。A17的鏡檢形態(tài):分生孢子頭放射狀,直徑150μm~300μm。分生孢子梗2mm左右,無隔膜。頂囊近球形,分生孢子卵圓形或近球形。2.3系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建將菌株A17的ITS序列結(jié)果通過Blast程序與Genbank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。結(jié)果表明,菌株A17的ITS序列和曲霉菌的結(jié)構(gòu)相似,結(jié)合其形態(tài)特性(圖1)和ITS序列比對結(jié)果,初步鑒定菌株A17為米曲霉。2.4酶特征的研究2.4.1酶最適溫度的確定溫度對酶活力及酶熱穩(wěn)定性的影響見圖3。在30℃~60℃時,隨著溫度升高,酶活力逐漸增大,60℃后,該酶蛋白由于高溫部分失活,活力下降,因此,該酶的最適溫度為60℃。由酶的熱穩(wěn)定性曲線可知,酶在30℃~55℃較穩(wěn)定,相對酶活力保持在80%以上,當(dāng)溫度升高為60℃時酶活迅速下降為40%左右,因此,該酶的熱穩(wěn)定范圍為30℃~55℃。2.4.2最適ph的確定pH值對酶活力的影響及酶的pH值穩(wěn)定性見圖4。由圖4可知,該酶在pH3~7都具有較高的活力,pH4.0時達(dá)最大,因此,該糖化酶的最適pH值為4.0,為一酸性淀粉糖化酶。酶液在不同pH值緩沖溶液中處理30min后,在pH4~5之間比較穩(wěn)定,保持80%以上的酶活性。2.4.3金屬離子對淀粉酶活性的影響各金屬離子對酶活力的影響見表2。Mg2+、Ca2+對該酶有一定的激活作用,Fe3+、Mn2+、Cu2+對該酶有較強(qiáng)的抑制作用。3制備酶活復(fù)篩糖化酶的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大,特別是在食品生產(chǎn)行業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。如糖化酶的應(yīng)用使糧醅入酵后發(fā)酵升溫快、幅度大,提高原料的出酒率,可縮短發(fā)酵周期;在食用醋生產(chǎn)中,應(yīng)用糖化酶可以解決企業(yè)自制酒母質(zhì)量不穩(wěn)定和夏季高溫等生產(chǎn)難題,使食用醋生產(chǎn)正常進(jìn)行。本研究以透明圈平板初篩,固態(tài)發(fā)酵測酶活復(fù)篩的方法從黃酒麥曲中篩選到一株產(chǎn)糖化酶活力較高的菌株A17,經(jīng)鑒定為米曲霉。將菌株A17進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵后,酶活力可達(dá)1835U/g干曲。對該酶酶學(xué)性質(zhì)的初步研究表明,該酶的最適作用溫度為60