基因育種在發(fā)酵型酵母中的應(yīng)用

基因育種在發(fā)酵型酵母中的應(yīng)用

發(fā)酵是啤酒發(fā)酵的靈魂和生命線，也被稱為“發(fā)酵之母”。酵母的發(fā)酵性能直接影響到啤酒的品質(zhì)和生產(chǎn)成本,它是啤酒生產(chǎn)的第一關(guān)鍵因素。對(duì)于啤酒生產(chǎn)來說,酵母除具有正常的生長(zhǎng)繁殖和發(fā)酵性能以外,最重要的兩點(diǎn)是:雙乙酰和高級(jí)醇的產(chǎn)生量要低,這有助于提高啤酒質(zhì)量、縮短發(fā)酵周期和降低生產(chǎn)成本,從而提高企業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)和獲利能力,特別是滿足低價(jià)位的廣大農(nóng)村市場(chǎng)。因此,釀酒酵母的基因育種成為我國(guó)啤酒企業(yè)緊迫而重大的戰(zhàn)略性課題。目前企業(yè)使用的酵母主要是用傳統(tǒng)育種獲得,即根據(jù)釀酒酵母的發(fā)酵性能和啤酒的風(fēng)味選育出的菌種,其性能改良程度有限。隨著生物工程技術(shù)的飛速發(fā)展和釀酒酵母遺傳背景的深入研究,進(jìn)行定向基因育種的研究已經(jīng)取得一些應(yīng)用性成果。本文針對(duì)性分析和總結(jié)了釀酒酵母基因育種中雙乙酰和高級(jí)醇兩個(gè)主要方面的研究及其應(yīng)用,以推動(dòng)今后對(duì)釀酒酵母綜合發(fā)酵性能的研究開發(fā)和提高啤酒行業(yè)的整體技術(shù)水平。1低醇酒母的基因育種1.1-乙酰乳酸的消除雙乙酰(2,3-丁二酮)是啤酒的重要風(fēng)味物質(zhì),但超過其口味閾值(普通啤酒為0.15mg/L,淡色啤酒為0.1mg/L)就會(huì)產(chǎn)生令人不愉快的餿飯味,因此要嚴(yán)格控制啤酒中雙乙酰含量。由于α-乙酰乳酸經(jīng)非酶促氧化脫羧生成雙乙酰的速度比雙乙酰還原成2,3-丁二醇的速度慢10倍左右,所以α-乙酰乳酸的消除成為控制雙乙酰的限速步驟,并導(dǎo)致啤酒成熟時(shí)間長(zhǎng)達(dá)5～6周。因此,基因改良菌種是從根本上實(shí)現(xiàn)對(duì)雙乙酰生成和消除的有效控制,從而提高啤酒質(zhì)量和降低生產(chǎn)成本。1.2雙乙酰在酵母體內(nèi)的還原酶作用雙乙酰是酵母生長(zhǎng)繁殖階段纈氨酸合成途徑中的α-乙酰乳酸滲透到細(xì)胞外經(jīng)非酶作用氧化脫羧反應(yīng)而生成。雙乙酰在酵母體內(nèi)可被還原酶作用生成乙偶姻(3-羥基-2-丁酮)和2,3-丁二醇,或直接被α-乙酰乳酸脫羧酶作用快速生成乙偶姻,如圖1所示。從圖1可知降低啤酒中雙乙酰含量的四種途徑為:酵母直接將雙乙酰還原成乙偶姻和2,3-丁二醇、降低α-乙酰乳酸生成量、提高α-乙酰乳酸轉(zhuǎn)變成乙偶姻或轉(zhuǎn)變成纈氨酸的量。1.3-乙酰乳酸脫羧酶基因缺失菌株的構(gòu)建及回復(fù)突變率測(cè)定通過結(jié)構(gòu)類似物選育低α-乙酰乳酸合成酶(AHAS)活性或雙乙酰還原能力強(qiáng)的抗性突變株,或選育異亮氨酸和纈氨酸(Ile-和val-)營(yíng)養(yǎng)缺陷株,達(dá)到降低雙乙酰的目的。這些傳統(tǒng)育種方法都可行,但存在降低雙乙酰的程度有限和容易回復(fù)突變等缺點(diǎn),所以目前主要采用基因工程方法進(jìn)行育種。1.3.1構(gòu)建乙酰羧酸合成酶基因缺失或AHAS活性低的工程菌。對(duì)于嘉士伯釀酒酵母(sacchromycescarsbergensis)含有乙酰羥羧合成酶基因的兩種不同結(jié)構(gòu)的等位基因,一種類似于釀酒酵母的ILV2基因,另一種不同于釀酒酵母基因。李艷等人采用基因工程方法取代其中的ILV2基因,即降低ILV2基因編碼的AHAS酶活性,從而使α-乙酰乳酸生成量減少,同時(shí)又不至于使AHAS完全失活而變成為異亮氨酸、纈氨酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株,防止影響菌株的正常發(fā)酵性能。結(jié)果表明ILV2缺失的釀酒酵母發(fā)酵性能正常,而其AHAS活性降低75%,啤酒中雙乙酰含量比原始菌株降低30%。1.3.2增加酵母細(xì)胞羥基乙酰同分異構(gòu)還原酶基因(ILV5)的拷貝數(shù),提高羥基乙酰同分異構(gòu)還原酶(RI)活力。Dillmans等人通過增加酵母單倍體中ILV5拷貝數(shù),使RI活力提高5～10倍,使α-乙酰乳酸快速轉(zhuǎn)化成纈氨酸,并使雙乙酰的峰值降低50%～60%。MithieuxS等人將ILV5在酵母中表達(dá),此工程菌發(fā)酵的啤酒中雙乙酰含量比原始菌株降低50%,而RI活力大幅度提高,有效縮短啤酒的成熟時(shí)間。比利時(shí)研究人員用ILV5取代ILV2,即達(dá)到降低AHAS酶活性,減少α-乙酰乳酸以及雙乙酰的合成,同時(shí)又促進(jìn)生成的α-乙酰乳酸更多地轉(zhuǎn)變成纈氨酸,從而進(jìn)一步降低了雙乙酰的生成量。1.3.3構(gòu)建α-乙酰乳酸脫羧酶基因(ALDC)的工程菌。YamanoS等人將ALDC基因整合到啤酒酵母染色體上,發(fā)酵表明可顯著降低雙乙酰的生成量,而工程酵母的正常發(fā)酵性能未發(fā)生改變。郭文杰、秦玉靜等人都構(gòu)建出含有ALDC基因的酵母工程菌,發(fā)酵實(shí)驗(yàn)證明可顯著降低啤酒中雙乙酰含量,同時(shí)又能簡(jiǎn)化發(fā)酵操作,使主發(fā)酵和后發(fā)酵時(shí)間縮短5d以上。假如采用ALDC取代ILV2,結(jié)果將即能減少α-乙酰乳酸生成,又能加速α-乙酰乳酸轉(zhuǎn)變成乙偶姻,從根本上減少雙乙酰的生成量。但ALDC基因都來自細(xì)菌,對(duì)工程酵母發(fā)酵生產(chǎn)的啤酒是否安全尚需要時(shí)間檢驗(yàn),但作為一種育種途徑具有很高的研究?jī)r(jià)值。對(duì)使用低雙乙酰工程酵母的啤酒廠,應(yīng)用效果良好,但仍需配合發(fā)酵工藝等措施來有效控制雙乙酰。2低醇酒和酵母的基因育種2.1高級(jí)醇的含量高級(jí)醇俗稱雜醇油,是具有三個(gè)碳鏈以上的一價(jià)醇類,是啤酒發(fā)酵的主要副產(chǎn)物,包括正丙醇、異丁醇、異戊醇、活性戊醇、苯乙醇等。高級(jí)醇形成了啤酒的香氣和風(fēng)味,并使啤酒口感柔和協(xié)調(diào)、酒體豐滿圓潤(rùn)。啤酒中主要高級(jí)醇又有其獨(dú)特的風(fēng)味和相應(yīng)的風(fēng)味閾值,如表1所示。當(dāng)高級(jí)醇含量過高時(shí)將會(huì)影響啤酒的風(fēng)味和口感,飲后會(huì)“上頭”而嚴(yán)重影響到啤酒的質(zhì)量。例如啤酒中總高級(jí)醇含量超過100mg/L(下面發(fā)酵啤酒為60-90mg/L;上面發(fā)酵啤酒小于100mg/L)時(shí)會(huì)使啤酒口味和受歡迎程度明顯下降。2.2發(fā)酵期間形成的發(fā)酵研究表明啤酒中80%的高級(jí)醇是在主發(fā)酵期間形成的。因此,要控制發(fā)酵過程中產(chǎn)生的高級(jí)醇就必須從酵母產(chǎn)生高級(jí)醇的途徑入手,主要有以下兩種途徑:2.2.1氨基酸代謝的分解代謝方法也稱為再謝序列，即再謝過程氨基酸酮酸醛高級(jí)醇2.2.2異戊醇的影響正常發(fā)酵中75%的高級(jí)醇來自糖代謝,25%來自氨基酸脫羧還原生成。異戊醇通常占到高級(jí)醇總量的50%,是影響最主要的高級(jí)醇。因此,需要重點(diǎn)研究異戊醇的生成代謝途徑,如圖2的糖代謝途徑。2.3營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株可采用選育纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等營(yíng)養(yǎng)缺陷型或滲漏型突變株的傳統(tǒng)育種方法,獲得總高級(jí)醇降低的菌株。Rous等人對(duì)葡萄酒酵母的研究結(jié)果表明:支鏈氨基酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株比原始菌株能夠減少總高級(jí)醇20%,特別是異戊醇減少達(dá)50%,而本研究室的研究也取得相似結(jié)果。但由于傳統(tǒng)育種方法的隨機(jī)性和不穩(wěn)定性等問題,致使低高級(jí)醇的研究目前主要采用基因工程的方法。2.3.1eca33、eca40對(duì)異戊醇和異丁醇的影響B(tài)CAT能夠切斷或減弱氨基酸轉(zhuǎn)變成α-酮酸的能力,從而減少纈氨酸到異丁醇、亮氨酸到異戊醇的產(chǎn)生,A.Eden等人研究表明異戊醇、活性戊醇和異丁醇受ecaΔ39、ecaΔ40的影響顯著。Benvenisty等人研究表明缺失ecaΔ39、ecaΔ40的菌株能夠顯著降低異丁醇、雙乙酰的含量,但對(duì)異戊醇含量的影響不顯著。Dickenson等人研究證實(shí):從纈氨酸到異丁醇的代謝途徑中丙酮酸脫羧酶是合成異丁醇的關(guān)鍵步驟。因此,構(gòu)建丙酮酸脫羧酶活性降低的工程菌能夠有效降低異丁醇的產(chǎn)生量。2.3.2工程菌的構(gòu)建通過同源重組的方法,將酵母中的YDL080c基因調(diào)出并破壞后,再轉(zhuǎn)回原菌種,完成構(gòu)建YDL080c基因缺失的工程菌(本研究室正在做)。此工程菌由于YDL080c基因不能合成丙酮酸脫羧異構(gòu)酶,從而能夠有效阻斷由亮氨酸代謝分解生成的異戊醇,使啤酒中異戊醇的含量顯著降低。因此,構(gòu)建ecaΔ39、ecaΔ40和YDL080c基因缺失的工程菌,能夠共同降低異丁醇、異戊醇含量,從而有效控制啤酒中的總高級(jí)醇。這對(duì)于提高啤酒質(zhì)量,優(yōu)化發(fā)酵工藝控制,甚至提高主發(fā)酵溫度都具有重大意義和通用性。由于高級(jí)醇在啤酒中生成后就很難采用有效的方法消除,所以在發(fā)酵過程中要嚴(yán)格控制,包括從低高級(jí)醇生成菌種和發(fā)酵工藝等方面綜合優(yōu)化,以達(dá)到控制和降低啤酒中高級(jí)醇的目的。此外,通