細(xì)胞工程學(xué)：第10章 轉(zhuǎn)基因植物

由中國(guó)農(nóng)科院生物工程中心開(kāi)發(fā)的Bt棉對(duì)棉鈴蟲(chóng)有顯著的抗性。與對(duì)照相比減少農(nóng)藥用量80％，并減少用工150個(gè)/hm2，以上兩者可使每公頃節(jié)省1500元，Bt轉(zhuǎn)基因棉種深受棉農(nóng)的歡迎。Chapter10TransgenicPlant第10章轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)容提要TransgenicPlant10.1植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)10.2-3轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用：

作物改良、生物制藥10.4轉(zhuǎn)基因植物的安全性問(wèn)題

將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞或組織中，經(jīng)組織培養(yǎng)后獲得具有外源基因表達(dá)新遺傳性狀的植物。轉(zhuǎn)基因植物（TransgenicPlant）概念：§10-1轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)1、目的基因的獲得：克隆？2、植物受體：種類(lèi)？3、基因?qū)敕椒ǎ?、再生植株的獲得：組織培養(yǎng)5、外源基因表達(dá)檢測(cè)、篩選？1、植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)路線(xiàn)植物轉(zhuǎn)基因基本程序2、轉(zhuǎn)基因受體◆葉盤(pán)：取自于幼嫩植物上的葉圓片（d=5mm)；◆原生質(zhì)體：無(wú)細(xì)胞壁易于接受外源基因；◆懸浮細(xì)胞：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率高，性狀穩(wěn)定；◆其它外植體：胚軸、莖尖、莖段、活體傷口◆愈傷組織：分生能力強(qiáng)，易于接受外源基因；◆胚狀體：來(lái)源于單細(xì)胞（合子），無(wú)嵌合現(xiàn)象；3、植物轉(zhuǎn)基因方法◆直接導(dǎo)入法（特殊處理的裸露DNA直接導(dǎo)入植物細(xì)胞）

基因槍法、PEG法、顯微注射法、脂質(zhì)法等◆載體介導(dǎo)法：農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法（1974年）◆花粉管通道法◆病毒感染法（1）外源基因直接導(dǎo)入法?基因槍法：最早是由美國(guó)康奈爾大學(xué)Sanford最先提出的，通過(guò)高速飛行的金屬顆粒將包被的目的基因直接導(dǎo)入到受體細(xì)胞內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的方法。GenegunsandelectricshockstransferDNAintoplantcells影響基因槍轉(zhuǎn)化的因素?第一因素是動(dòng)力系統(tǒng)。?根據(jù)動(dòng)力系統(tǒng)，基因槍分為三大類(lèi)：一類(lèi)是以火藥爆炸力作為動(dòng)力加速微彈；第二類(lèi)是以高壓氣體作為動(dòng)力；第三類(lèi)是以電弧放電蒸發(fā)浪作為動(dòng)力。?第二因素是微彈的制備過(guò)程。用的微載體有兩類(lèi) ：一是鎢粉，另一個(gè)是金粉，直徑一般為0.6－

4μm。

常用的將DNA包被到微載體上所用的沉淀試劑有亞精胺、氯化鈣、乙醇、聚乙二醇、異丙醇等。?第三個(gè)因素是受體材料的選擇?！癎enegun”methodadvantages◆對(duì)受體種類(lèi)無(wú)限制，特別農(nóng)桿菌法無(wú)法浸染的植物如單子葉植物；◆無(wú)需構(gòu)建復(fù)雜的質(zhì)粒載體，還可使用兩個(gè)以上質(zhì)粒載體進(jìn)行同時(shí)轉(zhuǎn)化；◆快速簡(jiǎn)便，轉(zhuǎn)化率較高；PEG或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將需轉(zhuǎn)移的外源DNA載體與PEG/脂質(zhì)體混合，通過(guò)PEG-Ca2+介導(dǎo)膜疏通，或通過(guò)脂質(zhì)體與受體細(xì)胞膜融合，從而將外源DNA轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞內(nèi)。效率高。Agrobacteriumtype

根癌農(nóng)桿菌Agrobacteriumtumefaciens（2）載體介導(dǎo)法-農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移屬土壤細(xì)菌，能侵染大多種雙子葉植物，很少感染單子葉植物！發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacteriumrhizogenes）

T－DNA區(qū)能插入到寄主植物基因組中，表達(dá)生長(zhǎng)素、分裂素和冠癭堿合成酶；其兩端各有一段25bp重復(fù)序列LB和RB，在T-DNA的切除和整合過(guò)程中起著至關(guān)重要作用。

Vir區(qū)不插入寄主植物基因組DNA中，促進(jìn)T－DNA的轉(zhuǎn)移，其缺失或突變不能感染植物。LBori

C GBAD

EvirT-DNA

RBopinesynthasegenes

Ti

opine catabolismA、農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒特性Ti質(zhì)粒(Tumor-inducingplasmid)包含：T-DNA(transferredDNA,轉(zhuǎn)移DNA)、Vir區(qū)兩個(gè)功能區(qū)Ti質(zhì)粒Ri質(zhì)粒(Root-inducingplasmid)B、農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞作用機(jī)制C、植物遺傳轉(zhuǎn)化表達(dá)載體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)?必須具備以下的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：?1）多克隆位點(diǎn)/MCS(酶切位點(diǎn)）?2）基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止子?3）T－DNA右邊界序列/RB?4）具有選擇標(biāo)記基因,如Kan?5）vir區(qū)域:利用共整合載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)解決（一）共整合載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)cointegrationvector

T-DAN間同源重組（置換）導(dǎo)入目的基因共整合載體和農(nóng)桿菌質(zhì)粒同源重組過(guò)程（二）雙元載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)

binaryvector雙元載體轉(zhuǎn)化與表達(dá)（2）煙草PG基因反義RNA轉(zhuǎn)化表達(dá)6、生根培養(yǎng)與移栽葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法

3、農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化

4、誘導(dǎo)愈傷組織

5、分化生芽D、農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因基本程序葉盤(pán)法：雙子葉植物較為常用、簡(jiǎn)單有效的方法。2、受體準(zhǔn)備1、轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建7、轉(zhuǎn)基因植株鑒定a：基因槍法b：根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)P86：外源目的基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞（3）花粉管通道法花粉管通道法是指在授粉后向子房胎痤位置注射含目的基因的DNA載體溶液，利用植物在受精過(guò)程中形成的花粉管通道，將外源DNA導(dǎo)入受精卵細(xì)胞或胚細(xì)胞基因組中，隨著受精卵或胚細(xì)胞的發(fā)育而成為帶轉(zhuǎn)基因的新個(gè)體。該方法的最大優(yōu)點(diǎn)是不依賴(lài)組織培養(yǎng)人工再生植株，技術(shù)簡(jiǎn)單，不需要裝備精良的實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)育種工作者易于掌握。（4）病毒感染法常用的逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種整合型的單鏈RNA病毒。將目的基因重組到反轉(zhuǎn)錄病毒載體上，感染細(xì)胞。病毒進(jìn)入細(xì)胞后，利用宿主細(xì)胞的酶體系自行轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，從而可以使病毒單拷貝基因組穩(wěn)定地進(jìn)入宿主細(xì)胞。常用花椰菜花葉病毒（CaMV)、番茄金花葉病毒(TGMV).(一)選擇性培養(yǎng)檢測(cè)-轉(zhuǎn)化體的篩選篩選時(shí)期：轉(zhuǎn)化后的外植體的愈傷誘導(dǎo)、抗性芽形成、器官分化、生根培養(yǎng)的整個(gè)過(guò)程。篩選方法：多輪篩選原則：根據(jù)轉(zhuǎn)化載體中含有的選擇標(biāo)記基因類(lèi)型，在抗性芽篩選培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基中加入適宜濃度的抗生素，如100mg/L

Kanr（NTPII)、Cat(氯霉素）。4、轉(zhuǎn)基因植物的鑒定轉(zhuǎn)耐鹽基因煙草愈傷組織的Kanr抗性篩選CKCK（二）遺傳標(biāo)記檢測(cè)-報(bào)告基因

①GUS（β-葡萄糖苷酸酶）基因是目前最廣泛使用的報(bào)告基因，可在愈傷培養(yǎng)的早期檢測(cè)。★GUS檢測(cè)原理：轉(zhuǎn)化體中GUS基因表達(dá)的蛋白酶能夠?qū)⑷旧褐屑尤氲牡孜飜-gluc分解后（37℃過(guò)夜），產(chǎn)生藍(lán)色的物質(zhì)。CK1：無(wú)DNA金粉轟擊CK2：未轟擊葉片老葉嫩葉②利用熒光素酶基因檢測(cè)TPb-葡糖醛酸糖苷酶報(bào)告基因

GUS應(yīng)答調(diào)控元件轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子鹵代葡萄糖醛苷酸X-gluc藍(lán)色化合物熒光素酶報(bào)告基因

GFP發(fā)射熒光昆蟲(chóng)熒光素?zé)晒馑孛富蛟跓煵葜校?986）WMBarnesVariablePatternsofExpressionofLuciferaseinTransgenicTobaccoLeavesPNAS87:9183-9187.

（三）目的基因分子水平檢測(cè)檢測(cè)方法：DNA水平上：PCR、Southernblot、測(cè)序法RNA水平上：Northernblot、RT-PCR、

Real-timePCR蛋白水平上：Westernblot、ELISA等。DNAmRNA蛋白質(zhì) 功能產(chǎn)物轉(zhuǎn)開(kāi)花基因煙草植株P(guān)CR初步檢測(cè)NPTIIEJLFYPCR檢測(cè)法優(yōu)點(diǎn)：對(duì)DNA樣品需量少，故在較早期可進(jìn)行初步鑒定；操作簡(jiǎn)單、快速、費(fèi)用低。缺點(diǎn)：存在一定的假陽(yáng)性；不能確定目的基因整合進(jìn)植物基因組的具體位點(diǎn)信息。Southernblot法檢測(cè)原理：探針與DNA的互補(bǔ)配對(duì)原理。優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)結(jié)果可信度高；可以獲得外源基因在基因組中的拷貝數(shù)、整合位點(diǎn)信息等。缺點(diǎn)：對(duì)樣品DNA需量較多，故只能在成苗期進(jìn)行鑒定。操作程序繁雜、需時(shí)較長(zhǎng)、費(fèi)用高。被XbaI酶切EJLFY線(xiàn)雜交

DNA水平鑒定點(diǎn)雜交RT-PCR檢測(cè)NorthernmRNA水平鑒定Protein水平檢測(cè)檢測(cè)方法：Westernblot、ELISA。檢測(cè)原理：抗原抗體（探針）結(jié)合反應(yīng)原理。檢測(cè)目的：＊外源基因是否已在Protein水平上發(fā)生了翻譯表達(dá)。包括外源基因的轉(zhuǎn)譯活性大小、蛋白質(zhì)的含量及分子量大小、穩(wěn)定性等。Westerndot-blot§10-2、3

轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)用：基因改良、生物制藥

抗除草劑的轉(zhuǎn)基因植物（最早進(jìn)入田間生產(chǎn)，目前栽培面積最 大）如Monsanto的抗除草劑草甘膦大豆

抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物

如轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)棉、玉米

抗病轉(zhuǎn)基因植物（抗病毒，抗真菌，抗細(xì)菌）

抗環(huán)境脅迫轉(zhuǎn)基因作物

（溫度、水分、化學(xué)物）

植物發(fā)育調(diào)節(jié)基因工程

（控制果實(shí)成熟，雄性不育，改良植物品質(zhì)）

醫(yī)藥領(lǐng)域中的轉(zhuǎn)基因植物（利用植物作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)藥用蛋 白、食用疫苗等）轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)棉遭受蟲(chóng)害的普通玉米抗蟲(chóng)的Bt轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)歐洲山楊抗病毒的番木瓜

結(jié)果:轉(zhuǎn)基因的番木瓜抗PRSV病毒（番木瓜環(huán)斑病毒導(dǎo)致全世界的番木瓜嚴(yán)重減產(chǎn)）

導(dǎo)入的基因:PRSV外殼蛋白基因轉(zhuǎn)基因方法:基因槍法完成人:Gonsalves(美國(guó))等抗CMV病毒轉(zhuǎn)基因番茄抗CMV病毒轉(zhuǎn)基因甜椒轉(zhuǎn)查爾酮合酶矮牽牛花抗除草劑的白楊

抗除草劑大豆早開(kāi)花的歐洲山楊結(jié)果:轉(zhuǎn)基因的童期僅5個(gè)月，非轉(zhuǎn)基因的8-20年導(dǎo)入的基因:擬南芥LFY基因，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法文獻(xiàn):Nature,1995,377:495-500轉(zhuǎn)魚(yú)抗凍基因的耐寒番茄GoldenRice樣品比較（左為普通棉花，右為兔毛轉(zhuǎn)基因棉花）轉(zhuǎn)基因品質(zhì)改良藥用蛋白包括生長(zhǎng)激素、抗體、生長(zhǎng)因子等。老鼠抗體輕鏈轉(zhuǎn)基因植物生物制藥老鼠抗體輕鏈功能性抗體轉(zhuǎn)乙肝抗原基因的西紅柿預(yù)防乙肝AreTransgenicPlantsSafe?§10-4轉(zhuǎn)基因植物的安全性羞羞答答的轉(zhuǎn)基因大豆油轉(zhuǎn)基因植物安全性評(píng)價(jià)環(huán)境生態(tài)安全性如：轉(zhuǎn)Bt作物對(duì)昆蟲(chóng)群落的影響及害蟲(chóng)的抗性、基因漂流問(wèn)題；超級(jí)雜草現(xiàn)象。食品安全性如：抗生素抗性、Bt蛋白毒性、過(guò)敏性等。（一）轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境安全性1、轉(zhuǎn)基因植物是否會(huì)比非轉(zhuǎn)基因植物在自然界生存中具有競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?yōu)勢(shì)？

答案是：大多不會(huì)。大量田間試驗(yàn)表明：抗蟲(chóng)、抗病、抗除草劑、抗逆等轉(zhuǎn)基因（具有難抵抗的雜草性質(zhì)）植物一旦離開(kāi)了選擇壓特定的環(huán)境，其生存競(jìng)爭(zhēng)性并不比非轉(zhuǎn)基因植物強(qiáng)，因此基本不會(huì)導(dǎo)致農(nóng)田“超級(jí)雜草”的出現(xiàn)。

2、轉(zhuǎn)基因是否會(huì)通過(guò)自然雜交“基因漂流”到近緣野生種植物、昆蟲(chóng)或微生物中？

答案是：只要嚴(yán)格控制，風(fēng)險(xiǎn)幾乎微乎其微。自然界中自古就存在著天然雜交，即發(fā)生了基因漂流，人們從未懷疑過(guò)，也未發(fā)生過(guò)不良后果。轉(zhuǎn)基因漂流的方式主要通過(guò)：花粉傳播（受傳播方式、花期、花粉競(jìng)爭(zhēng)力、氣候條件等影響）、種子散落或無(wú)性繁殖體的混雜（可人為控制）。

（一）轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境安全性轉(zhuǎn)基因植物的基因漂流應(yīng)該具有三個(gè)條件：空間上接近、時(shí)間上接近、必須是近緣種之間（即沒(méi)有遺傳障礙）。因此，只要做到：

嚴(yán)格遵守安全性法規(guī)；在大田釋放前對(duì)所轉(zhuǎn)基因的類(lèi)型及可能后果進(jìn)行充分評(píng)估和長(zhǎng)期試驗(yàn)；將轉(zhuǎn)基因植物在種植上進(jìn)行嚴(yán)格的空間隔離，切斷基因漂流途徑。（一）轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境安全性2、轉(zhuǎn)基因植物是否會(huì)對(duì)自然界的生物類(lèi)群產(chǎn)生負(fù)面影響？

答案是：有一定可能，需要科學(xué)控制。所轉(zhuǎn)的抗性基因植物在長(zhǎng)期種植條件下，其抵抗的昆蟲(chóng)可能會(huì)產(chǎn)生抗性或適應(yīng)性，使轉(zhuǎn)基因植株及相關(guān)農(nóng)藥生產(chǎn)失去意義。一般要求間作種植一定比例的非轉(zhuǎn)基因植株可得到控制。大量試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因植物對(duì)非靶向生物昆蟲(chóng)如蜜蜂等有益昆蟲(chóng)無(wú)傷害性影響。（一）轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境安全性4、轉(zhuǎn)抗病毒基因植物是否會(huì)通過(guò)病毒RNA異源重組和異源包裝方式產(chǎn)生新的病毒變種？

答案是：理論上可能，但尚未發(fā)現(xiàn)。轉(zhuǎn)基因植物的mRNA可能會(huì)與侵染的病毒RNA進(jìn)行重組，然后在CP下包裝成新病毒，這在自然界中是存在的。很可能轉(zhuǎn)基因中所形成的病毒重組體類(lèi)型曾經(jīng)在自然界出現(xiàn)過(guò)，但并沒(méi)有在自然選擇中取得優(yōu)勢(shì)。因此，過(guò)分擔(dān)憂(yōu)是沒(méi)有必要的，但仍需保持清醒的認(rèn)識(shí)。轉(zhuǎn)基因食品是指用含轉(zhuǎn)基因的植物產(chǎn)品加工生產(chǎn)的食品。1993年OECD（經(jīng)合組織）提出了轉(zhuǎn)基因食品安全性評(píng)價(jià)原則：如果一種轉(zhuǎn)基因食品與現(xiàn)存的傳統(tǒng)食品相比較，其特性、化學(xué)成分、營(yíng)養(yǎng)成分、所含毒素以及人和動(dòng)物食用和飼用情況是類(lèi)似，那么它們就具有實(shí)質(zhì)等同性。這表明：轉(zhuǎn)基因食品與非轉(zhuǎn)基因食品如果具有實(shí)質(zhì)等同性，則是安全的，反之則應(yīng)該進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。（二）轉(zhuǎn)基因植物的食品安全性實(shí)例：抗甲蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯轉(zhuǎn)基因馬鈴薯與原始品種相比：

Bt蛋白和NPTII蛋白對(duì)人無(wú)明顯的過(guò)敏反應(yīng)；

蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、可食性纖維、灰分含量相同；

維生素C、B6、B1、B3、煙酸、葉酸含相同；

礦質(zhì)無(wú)素鈣、銅、鐵、碘、磷、鉀、鈉、鋅相同；

抗?fàn)I養(yǎng)因子茄堿含量相同；

飼喂大鼠28天，兩者在毛重、生長(zhǎng)速率和器官毛重方面無(wú)差異1、轉(zhuǎn)基因食品是否會(huì)對(duì)人畜造成一定的毒害以及通過(guò)融合到腸道微生物DNA而引致新的疾??？

答案是：理論上是安全的。大量實(shí)驗(yàn)表明:Bt毒蛋白只對(duì)相關(guān)昆蟲(chóng)有毒，而對(duì)脊椎人畜無(wú)害。1993年世界健康組織討論了標(biāo)記基因由植物向微生物轉(zhuǎn)移的可能性:

1)目前尚不知有基因自植物向微生物轉(zhuǎn)移的機(jī)制，也沒(méi)有充分的證據(jù)證明這一點(diǎn);

2)Zambryski等曾證明，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移中，T-DNA一旦整合進(jìn)植物基因組中，它即使在基因的再次活化下也不在移動(dòng);（二）轉(zhuǎn)基因植物的食品安全性3)植物的DNA向細(xì)菌轉(zhuǎn)移需經(jīng)5個(gè)步驟：細(xì)菌感受態(tài)的誘導(dǎo)、與DNA結(jié)合、DNA穿過(guò)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜、進(jìn)入宿主細(xì)胞、