弓形蟲(chóng)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系的建立及應(yīng)用

弓形蟲(chóng)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系的建立及應(yīng)用

這是一種特殊的細(xì)胞寄生蟲(chóng)（1908），發(fā)現(xiàn)了在牙齒和動(dòng)物幫俞（1908）級(jí)織尿組織中發(fā)現(xiàn)的獨(dú)特細(xì)胞寄生蟲(chóng)。它顯示了一種缺乏營(yíng)養(yǎng)的狀態(tài)。換句話說(shuō)，只能將牛仔布轉(zhuǎn)換成鳥(niǎo)類飼料，但不能反向轉(zhuǎn)化。因此,宿主細(xì)胞的腺苷成為弓形蟲(chóng)合成嘌呤最有效的補(bǔ)救來(lái)源,而三磷酸核苷水解酶(nucleosidetriphosphatehydrolase,NTPase)在此過(guò)程中起關(guān)鍵作用。它可以利用宿主來(lái)源的ATP,將其分解成AMP后,被速殖子膜上的5′-核苷酸酶水解生成腺苷,以合成自身所必需的嘌呤核苷酸。編碼該酶的基因具有高度保守性,且其堿基序列在強(qiáng)弱蟲(chóng)株中略有不同,但目前尚未見(jiàn)將該基因用于診斷的研究報(bào)道。弓形蟲(chóng)因能引起對(duì)人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展具有嚴(yán)重危害的人獸共患弓形蟲(chóng)病而備受人們的關(guān)注,其診斷方法也在不斷發(fā)展,主要包括病原學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢查等。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技術(shù)自Notomi等于2000年報(bào)道以來(lái),以其特異性高、敏感性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)得到人們普遍應(yīng)用。本研究選取弓形蟲(chóng)NTPase基因的保守序列為靶基因,建立LAMP診斷方法,以期為后期快速檢測(cè)田間樣品奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1基因組dna和血液原蟲(chóng)病弓形蟲(chóng)GJS株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所人獸共患原蟲(chóng)病課題組分離、保存,犬新孢子蟲(chóng)基因組DNA由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)劉群教授惠贈(zèng),鸚鵡熱衣原體基因組DNA由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所人獸共患細(xì)菌病課題組提供,柔嫩艾美耳球蟲(chóng)基因組DNA由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所人獸共患絳蟲(chóng)病課題組提供,羊巴貝斯蟲(chóng)未定種、牛巴貝斯蟲(chóng)、呂氏泰勒蟲(chóng)基因組DNA由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所血液原蟲(chóng)病課題組提供。大腸桿菌JM109、載體pMD19-T均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2月齡長(zhǎng)白豬(弓形蟲(chóng)IHA抗體效價(jià)≤1∶4),體重(15±2)kg,由甘肅省蘭州市榆中縣某豬場(chǎng)提供。1.3基因組織、活性成分、kpn、dntps和氨基酸提取試劑盒BstDNA聚合酶為NEB公司產(chǎn)品;PremixTaq酶、限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、dNTPs、基因組提取試劑盒、DL1000DNAMarker均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品;甜菜堿為Sigma公司產(chǎn)品;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.4ssr引物的設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI中的序列(登錄號(hào)為L(zhǎng)39079),設(shè)計(jì)NTPase基因PCR引物,引物由大連寶生物工程有限公司合成(見(jiàn)表1)。構(gòu)建重組陽(yáng)性質(zhì)粒pMD19-T-NTPase。1.5引物的設(shè)計(jì)與合成對(duì)弓形蟲(chóng)NTPase基因用PrimerExplorerV4在線軟件(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設(shè)計(jì)引物,引物由大連寶生物工程有限公司合成(見(jiàn)表2)。1.6ntpase-pcr反應(yīng)體系的構(gòu)建以本試驗(yàn)中LAMP的端引物F3和B3為PCR引物,以構(gòu)建的陽(yáng)性重組質(zhì)粒為模板,建立NTPase-PCR反應(yīng)體系,總體系為25μL。1.7反應(yīng)系統(tǒng)的lampLAMP反應(yīng)體系按楊吉飛等的優(yōu)化條件操作。1.8酶切鑒定及鑒定將擴(kuò)增的目的片段使用軟件PrimerPremier5.0進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析,用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ對(duì)LAMP產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定,37℃作用4h。反應(yīng)后用10g/L的瓊脂糖進(jìn)行電泳。1.9lamp特異性試驗(yàn)利用建立的LAMP方法,對(duì)犬新孢子蟲(chóng)、鸚鵡熱衣原體、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)、呂氏泰勒蟲(chóng)、羊巴貝斯蟲(chóng)未定種、牛巴貝斯蟲(chóng)和弓形蟲(chóng)基因組DNA進(jìn)行LAMP特異性試驗(yàn)。反應(yīng)后用10g/L的瓊脂糖進(jìn)行電泳。1.10抗lamp敏感性測(cè)試1.10.lamp反應(yīng)的敏感性檢測(cè)將已知濃度的弓形蟲(chóng)陽(yáng)性質(zhì)粒模板定量到100ng/μL(即拷貝數(shù)為1×108copies/μL),然后將其依次稀釋為1×10-1～1×10-88個(gè)濃度后檢測(cè)LAMP反應(yīng)的敏感性。同時(shí)用相應(yīng)濃度質(zhì)粒DNA進(jìn)行的NTPase-PCR反應(yīng)做比較。反應(yīng)后分別用10g/L的瓊脂糖進(jìn)行電泳。1.10.lamp和其他dna片段的檢測(cè)用弓形蟲(chóng)GJS株強(qiáng)毒活蟲(chóng)腹腔接種試驗(yàn)豬3頭,劑量為1×107/頭。在攻蟲(chóng)前和攻蟲(chóng)后第2、3、4天于前腔靜脈采血。以血液基因組為模板,分別進(jìn)行LAMP檢測(cè)和基于529bp重復(fù)DNA片段的PCR檢測(cè)。PCR檢測(cè)的引物和反應(yīng)體系按Homan等的方法操作。2結(jié)果2.1反應(yīng)條件確定通過(guò)優(yōu)化LAMP的反應(yīng)條件,確定本試驗(yàn)中最佳反應(yīng)條件為65℃30min。將LAMP反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后,可見(jiàn)明顯的瀑布狀特異性條帶,陰性對(duì)照不出現(xiàn)條帶(見(jiàn)圖1)。2.2lamp引物的反應(yīng)性分析用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ對(duì)LAMP產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定,結(jié)果顯示得到2個(gè)大小約為260bp和180bp的片段(見(jiàn)圖2),表明設(shè)計(jì)的LAMP引物具有良好的反應(yīng)性。2.3lamp反應(yīng)對(duì)犬新孢子蟲(chóng)、鸚鵡熱衣原體、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)、呂氏泰勒蟲(chóng)、羊巴貝斯蟲(chóng)未定種和牛巴貝斯蟲(chóng)進(jìn)行LAMP反應(yīng)。結(jié)果顯示,上述DNA樣品均沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物(見(jiàn)圖3),表明該LAMP方法具有很高的特異性。2.4lamp和pcr方法檢測(cè)質(zhì)粒的靈敏度以不同濃度的陽(yáng)性質(zhì)粒pMD19-T-NTPase為模板進(jìn)行LAMP和PCR反應(yīng)。結(jié)果顯示,LAMP方法可檢測(cè)到20fg重組陽(yáng)性質(zhì)粒,即檢測(cè)限為20copies,PCR方法可以檢測(cè)到200fg重組陽(yáng)性質(zhì)粒,即檢測(cè)限為200copies(見(jiàn)圖4、5)?？梢?jiàn)本試驗(yàn)建立的LAMP檢測(cè)方法比PCR方法敏感性高10倍。對(duì)攻蟲(chóng)前和攻蟲(chóng)后第2、3、4天的3頭試驗(yàn)豬采血提取血液基因組,分別用LAMP方法和PCR方法檢測(cè)。結(jié)果顯示,LAMP方法可以在攻蟲(chóng)后第2天看到清晰的瀑布狀條帶,而PCR方法在攻蟲(chóng)后第4天出現(xiàn)陽(yáng)性條帶(見(jiàn)圖6)。3弓形蟲(chóng)基因檢測(cè)LAMP方法是一種簡(jiǎn)便、快速的新式基因擴(kuò)增方法,與PCR相比其最大的優(yōu)勢(shì)是反應(yīng)所需的時(shí)間短。本研究中,LAMP反應(yīng)在15min便可以檢測(cè)到陽(yáng)性重組質(zhì)粒,而在反應(yīng)進(jìn)行到30min時(shí),可檢測(cè)到20copies重組NTPase基因,敏感性比普通PCR高10倍;而且LAMP方法不需要專門(mén)的反應(yīng)儀器,只需恒溫水浴鍋就可以滿足試驗(yàn)所需;此外,LAMP反應(yīng)結(jié)果可以用濁度儀測(cè)其副產(chǎn)物——焦磷酸鎂沉淀的濁度來(lái)觀察。本試驗(yàn)中LAMP反應(yīng)后沉淀的量很少,故采用瓊脂糖凝膠電泳分析法進(jìn)行觀察。但是將該反應(yīng)后產(chǎn)物離心,即可用肉眼觀察到沉淀。NTPase約占弓形蟲(chóng)蟲(chóng)體總蛋白的2%～8%,在弓形蟲(chóng)生存和繁殖過(guò)程中起重要作用。且在原蟲(chóng)中只有犬新孢子蟲(chóng)存在該基因,而其他原蟲(chóng)如瘧原蟲(chóng)、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)等均無(wú)NTPase存在。因此,本研究選取弓形蟲(chóng)NTPase基因中216bp片段設(shè)計(jì)引物進(jìn)行LAMP試驗(yàn)。結(jié)果顯示,包括犬新孢子蟲(chóng)在內(nèi)的其他蟲(chóng)株均為陰性,而弓形蟲(chóng)基因檢測(cè)為陽(yáng)性,說(shuō)明本方法的特異性良好。本研究對(duì)早期感染弓形蟲(chóng)試驗(yàn)豬血液,用建立的LAMP方法和Homan等建立的PCR方法進(jìn)行比較。雖然529bp重復(fù)DNA片段在弓形蟲(chóng)基因組DNA中有200～300個(gè)拷貝,而NTPase基因在弓形蟲(chóng)基因組DNA中是單拷貝基因,但LAMP方法可比PCR方法提前2d檢測(cè)到血液樣本中的弓形蟲(chóng),且LAMP反應(yīng)時(shí)間大大縮短。在全血中提取DNA時(shí),可能會(huì)有一些遺留的PCR的抑制因子而影響PCR反應(yīng)的特異性和敏感性,但這種抑制因子對(duì)LAMP反應(yīng)無(wú)效。這不但進(jìn)