自溶過(guò)程對(duì)啤酒酵母蛋白質(zhì)和核酸酶的影響

自溶過(guò)程對(duì)啤酒酵母蛋白質(zhì)和核酸酶的影響

自20世紀(jì)90年代以來(lái)，對(duì)母乳素可萃取物質(zhì)的研究在中國(guó)非常流行。研究方向主要集中在三種方法：分離苦法（以啤酒為原料）、自溶促進(jìn)劑（食鹽等）、自溶條件（溫度、ph、變溫條件、時(shí)間）的選擇、蛋白質(zhì)分解作用等方面。目前，中國(guó)母乳素的產(chǎn)率約為35%57%。國(guó)外主要的提取方法是自我溶，其次是先對(duì)母細(xì)胞進(jìn)行稀釋，然后添加酶分解。這兩種方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。在產(chǎn)率上，第一種高約為70%，第二種幾乎為90%。從成分上看，具有添加酶法的母乳素產(chǎn)品中的氨基酸含量很高，而自溶法產(chǎn)品中的5'-氨基酸含量很低。這是因?yàn)槟讣?xì)胞體本身含有超磷酸酶，因此可以將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為3'-氨基酸。此外，通過(guò)添加酶法制備的工廠中的低分子糖和化合物含量較高，產(chǎn)品的味道更重。從這兩個(gè)點(diǎn)來(lái)看，添加酶法更有吸引力，但添加酶法相對(duì)復(fù)雜，自溶法相對(duì)簡(jiǎn)單。目前,國(guó)內(nèi)酵母抽提物產(chǎn)品存在的主要問(wèn)題是:酵母抽提物中呈味核苷酸的含量較低,酵母抽提物鮮度不夠.本論文采用自溶法工藝制備酵母抽提物,主要研究了麥芽根核酸酶在酵母抽提物中的應(yīng)用,目的是提高酵母抽提物中5′-核苷酸的含量.有關(guān)麥芽根在酵母抽提物中的應(yīng)用,國(guó)外在20世紀(jì)60年代開(kāi)始即有報(bào)道,國(guó)內(nèi)自70年代起,也有關(guān)于利用綠麥芽根提高酵母抽提物中呈味核苷酸含量的報(bào)道.事實(shí)上,在現(xiàn)有文獻(xiàn)中,有關(guān)麥芽根提高酵母抽提物中呈味核苷酸含量的報(bào)道基本限于定性報(bào)道,而酵母自溶過(guò)程中關(guān)于核酸的降解及核苷酸的生成鮮有定量報(bào)道.論文通過(guò)測(cè)定酵母自溶過(guò)程中核酸、可溶性蛋白、總可溶性固形物含量隨自溶時(shí)間的變化來(lái)判斷自溶效果,以期通過(guò)控制多重指標(biāo)包括可溶性蛋白質(zhì)、總可溶性固形物及呈味核苷酸的生成量等指標(biāo),得到高得率、高呈味核苷酸含量的酵母抽提物產(chǎn)品.1材料和方法1.1相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定啤酒廢酵母泥:太湖水啤酒廠提供;核酸酶:按文獻(xiàn)的方法從麥芽根制備;NaCl、NaHCO3、NaOH、HCl、鉬酸銨、高氯酸、NaCO3、CuSO4、硫酸鋰、液溴、酒石酸鉀、鎢酸鈉、鉬酸鈉:均為分析純;磷酸:優(yōu)級(jí)純;甲醇:色譜純;沉淀劑:0.25%鉬酸銨溶于25%高氯酸中;超濾膜:截留相對(duì)分子質(zhì)量分別為1萬(wàn)和3千,天津紡院生產(chǎn);超濾器:天津紡院生產(chǎn);HPLC:Varian,5000型,C18柱;7520紫外分光光度儀:上海分析儀器廠生產(chǎn);722光柵分光光度儀:上海第三分析儀器廠制.1.2測(cè)量1.2.1可溶性蛋白質(zhì)1福林-酚法.1.2.2總可溶性固形物1直接干燥法.1.2.3原子能1紫外吸收法.1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法HPLC法.將濃縮4倍的酵母抽提物離心,取上清液,采用截留相對(duì)分子質(zhì)量為3000的膜超濾以除去大分子.所得透過(guò)液采用HPLC檢測(cè)其中的核苷酸含量.采用SIGMA公司的3′-AMP,5′-AMP,5′-GMP,5′-CMP,5′-UMP,3′-UMP和3′-CMP作為標(biāo)樣.HPLC色譜條件為:體積積流量1.0mL/min,波長(zhǎng)為265nm,采用梯度洗脫.0min時(shí),30%的質(zhì)量濃度為0.05g/dL磷酸水溶液+70%水;5min時(shí),30%的質(zhì)量濃度為0.05g/dL磷酸水溶液+70%水;15min時(shí),50%的0.05g/dL磷酸水溶液+50%水;18min時(shí),50%的質(zhì)量濃度為0.05g/dL磷酸水溶液+50%水;22min時(shí),30%的質(zhì)量濃度為0.05%的磷酸水溶液+70%水.1.3測(cè)試方法1.3.1雜質(zhì)的提取將啤酒廢酵母離心,去除上清液后加2倍體積的無(wú)菌水,攪拌均勻,采用70目篩子篩分去除雜質(zhì),然后加2倍體積的0.5%的NaHCO3溶液,攪拌均勻,離心分離,去除上清液;再依次用2倍體積的無(wú)菌水和0.5%的NaHCO3溶液洗滌,最后用無(wú)菌水洗至中性后待用.1.3.2可溶性固形物、總核苷酸及單核苷酸含量測(cè)定在200g酵母中加2倍體積的無(wú)菌水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaCl,攪拌均勻后將料液升溫至55℃,保溫30h并保持不斷攪拌,期間每隔一定時(shí)間取樣.所取樣品立即置于100℃水浴中保溫20min,然后離心分離,取上清液,測(cè)定總可溶性固形物、總可溶性蛋白質(zhì)、總核酸及單核苷酸含量.1.3.3攪拌、均質(zhì)、保溫200g酵母加2倍體積無(wú)菌水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaCl,攪拌均勻后在40MPa壓力下均質(zhì)3次,然后升溫至55℃,保溫30h并不斷攪拌,期間每隔一定時(shí)間取樣.以下處理同1.3.2,對(duì)照不均質(zhì).1.3.4均質(zhì)、均質(zhì)、培養(yǎng)200g酵母加2倍體積的無(wú)菌水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaCl,再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的核酸酶,攪拌均勻,在400kg壓力下均質(zhì)3次,然后升溫至55℃,保溫30h并不斷攪拌,期間每隔一定時(shí)間取樣,以下處理同1.3.2,對(duì)照不加核酸酶.1.3.5處理u200g未均質(zhì)破壁組:200g酵母加2倍體積的無(wú)菌水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaCl后,攪拌均勻,用4mol/LNaOH將pH調(diào)至8,再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的核酸酶,然后升溫至55℃自溶,同時(shí)用4mol/LNaOH維持至pH8,2h后,用4mol/LHCl將pH調(diào)至5.自溶期間每隔一定時(shí)間取樣,以下處理同1.3.2,對(duì)照不調(diào)節(jié)pH.均質(zhì)破壁組:200g酵母加2倍體積無(wú)菌水和5%NaCl后,攪拌均勻,用4mol/LNaOH將pH調(diào)至8,再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的核酸酶,然后在40MPa壓力下均質(zhì)3次,再升溫至55℃自溶,同時(shí)用4mol/LNaOH將pH調(diào)至8,2h后,用4mol/LHCl將pH調(diào)至5.自溶期間每隔一定時(shí)間取樣,以下處理同1.3.2,對(duì)照不調(diào)節(jié)pH.1.3.61.比較出口產(chǎn)品和市售產(chǎn)品中5:5%的質(zhì)量采用HPLC分別測(cè)定自制產(chǎn)品、市售國(guó)產(chǎn)酵母抽提物及進(jìn)口酵母抽提物中核苷酸的含量.所有樣品均配成25%溶液,離心分離后取上清液待用.2結(jié)果與討論2.1啤酒酵母中核酸酶的變化均質(zhì)破壁對(duì)于酵母自溶進(jìn)程的影響見(jiàn)圖1,2.從圖1可以看出,均質(zhì)破壁不能顯著提高自溶產(chǎn)物的得率,但可以明顯加快自溶進(jìn)程.均質(zhì)樣品自溶2h,其總可溶性固形物含量即達(dá)到非均質(zhì)樣品自溶15h的水平.均質(zhì)破壁能顯著提高自溶產(chǎn)物中可溶性蛋白質(zhì)的含量,圖1顯示均質(zhì)樣品自溶產(chǎn)物中的可溶性蛋白質(zhì)含量約為對(duì)照的2倍.同時(shí),均質(zhì)破壁也能有效促進(jìn)酵母中核酸的降解.從圖2可以看出,均質(zhì)樣品自溶產(chǎn)物中的核酸含量?jī)H為對(duì)照的1/2左右,而核苷酸含量約為對(duì)照的3倍.啤酒酵母所含的核酸酶主要為3′-核苷酸生成酶.表1顯示,非均質(zhì)樣品的自溶產(chǎn)物中,基本不含5′-核苷酸,而均質(zhì)樣品則含有很少量的5′-核苷酸.從圖2還可以看出,在酵母自溶過(guò)程中,對(duì)照與均質(zhì)樣品中的核酸的變化趨勢(shì)很相似:核酸含量先呈上升趨勢(shì),隨后逐漸下降,再略有回升,然后再次呈下降趨勢(shì).表2表明,均質(zhì)樣品的變化趨勢(shì)更顯著一些.對(duì)于核酸的這種變化,可以認(rèn)為是由于核酸溶出與降解速率的不平衡引起的.研究發(fā)現(xiàn),啤酒酵母中的核酸酶的最適作用溫度約在55℃左右,45℃以上開(kāi)始不穩(wěn)定,55℃保溫2h后,酶活力損失約為80%.啤酒酵母中核酸酶的這種性質(zhì)造成了酵母自溶過(guò)程核酸含量的起伏.酵母自溶是在55℃下進(jìn)行的.在開(kāi)始階段,核酸逐漸溶出,此時(shí)核酸酶活力較高,核酸降解迅速,核苷酸也迅速生成,造成核酸含量的第一次起伏.隨著核酸酶活力的下降,核苷酸生成速率漸緩,而核酸溶出依然保持一定的速率,直至完全溶出,導(dǎo)致了核酸含量的第二次起伏.2.2最適條件和用量從圖3,4和表1,3的結(jié)果來(lái)看,麥芽根核酸酶的加入可以顯著提高酵母抽提物中呈味核苷酸的含量,顯著降低3′-核苷酸的含量,但對(duì)可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量沒(méi)有明顯影響.有研究表明,麥芽根中的核酸酶主要為5′-核苷酸生成酶,其最適作用溫度在55℃左右,最適pH有兩個(gè),分別在pH5和pH8左右;該酶在pH>2.5,溫度小于50℃環(huán)境下很穩(wěn)定.在pH6、55℃條件下保溫2h后,其活力損失約為40%.而啤酒酵母核酸酶的最適作用溫度為55℃左右,但在45℃以上開(kāi)始不穩(wěn)定,55℃時(shí)保溫2h,酶活力損失約80%.因此推斷,在破壁酵母中直接加入麥芽根核酸酶可以競(jìng)爭(zhēng)底物RNA,從而有效地提高酵母自溶產(chǎn)物中呈味核苷酸的含量.表3所示結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn).在加酶自溶30h的樣品中,5′-GMP的含量高達(dá)6.37mg/g,約為市售國(guó)產(chǎn)酵母抽提物的3倍.2.3u3000酸酶系統(tǒng)的穩(wěn)定性試驗(yàn)pH對(duì)酵母自溶總的得率影響不大,但對(duì)于自溶產(chǎn)物的組成成分有顯著影響.從圖5,6的結(jié)果可以看出,在pH8自溶的產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量顯著低于對(duì)照,而核酸的含量則遠(yuǎn)高于對(duì)照,核苷酸的含量又明顯低于對(duì)照,這種趨勢(shì)在均質(zhì)破壁樣品更明顯.從表4～6的核苷酸生成進(jìn)程表來(lái)看,非均質(zhì)破壁的條件下,在pH8自溶的產(chǎn)物中5′-核苷酸的量與在pH5自溶的產(chǎn)物中的量相當(dāng),而3′-核苷酸的量則顯著低于在pH5自溶的產(chǎn)物中的量;在均質(zhì)破壁條件下,在pH8自溶的產(chǎn)物中兩種核苷酸的量均顯著低于在pH5自溶的產(chǎn)物中的量.在pH8自溶的產(chǎn)物中3′-核苷酸的量顯著低于在pH5自溶的產(chǎn)物中的量,說(shuō)明pH8可以有效抑制酵母中產(chǎn)3′-核苷酸的核酸酶的活力.而在pH8自溶的產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量顯著低于對(duì)照,則說(shuō)明pH8對(duì)于酵母中的蛋白酶也有抑制作用.酵母中的蛋白酶主要有4種,其最適pH和最適溫度見(jiàn)表7.這些蛋白酶的溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性均比較差.從試驗(yàn)結(jié)果看,雖然試樣在pH8的條件下保溫2h后,隨即將pH調(diào)回5.0,仍然對(duì)蛋白酶造成了很明顯的抑制作用.另外,由于外加的麥芽根核酸酶的pH穩(wěn)定性較好,理論上講,在pH8加酶的自溶過(guò)程中,核酸的降解應(yīng)該比較迅速并能生成較大量的呈味核苷酸.但試驗(yàn)未達(dá)到預(yù)想結(jié)果.這可能有以下原因?qū)е碌?第一,由于在pH8的條件下,阻礙蛋白質(zhì)降解,也阻礙了細(xì)胞器中核酸的溶出,導(dǎo)致在核酸酶失活前生成的核苷酸總量下降.比較圖6中的a和b可以看出,均質(zhì)破壁的酵母在自溶前期,產(chǎn)物中的核酸含量明顯高于未破壁的,同時(shí)核苷酸含量也大了將近一倍.雖然pH8阻礙了蛋白質(zhì)的降解,然而均質(zhì)能有效破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),因此破壁酵母的自溶產(chǎn)物中的核苷酸含量要高得多.這可以部分說(shuō)明在pH8外加核酸酶未能有效生成呈味核苷酸可能是由于細(xì)胞膜或細(xì)胞器膜未能被有效破壞所導(dǎo)致的.第二,對(duì)照表5和表3的結(jié)果可以看出,在pH8自溶的產(chǎn)物中,5′-CMP和5′-UMP生成量較在pH5時(shí)大,而5′-AMP和5′-GMP的生成量較在pH5小.因此,有理由相信,pH會(huì)影響麥芽根核酸酶系的水解作用,導(dǎo)致產(chǎn)物不同.2.4麥芽根核酸酶能有效地提高酵母抽提物中5-核苷酸含量HPLC測(cè)定自制樣品中5′-GMP的含量約6.37mg/g,國(guó)產(chǎn)樣品約1.58mg/g,進(jìn)口樣品約2.09mg/g.這個(gè)結(jié)果說(shuō)明了采用麥芽根核酸酶能有效地提高酵母抽提物中5′-核苷酸含量.3強(qiáng)化酵母抽提物中5-核苷酸含量主要研究了機(jī)械破壁、pH以及麥芽根核酸酶的作用對(duì)酵母自溶過(guò)程的影響.均質(zhì)破壁能顯