牛妊娠相關糖蛋白elisa法在早期妊娠診斷中的應用

牛妊娠相關糖蛋白elisa法在早期妊娠診斷中的應用

隨著科學技術的發(fā)展，通過檢測奶牛和血液中牛血液中糖蛋白（pag）濃度的變化，可以進行牛的早期育種和診斷。哺乳動物妊娠時,外周血液中PAG變化可作為母牛是否懷孕的標志。在母牛懷孕時,PAG濃度從妊娠后第15～35d開始上升,但因血清中不同PAG水平的差異,到妊娠第26～30d才能將PAG作為可靠的妊娠指標。目前,商業(yè)化檢測PAG對待檢牛影響小,結果判定標準化,適用于規(guī)模牛場母牛早期妊娠診斷。為了分析利用牛妊娠相關糖蛋白檢測奶牛早期妊娠診斷的實際效果,于2012年6～8月對寧夏平吉堡奶牛場273頭配種后28～45d的荷斯坦奶牛使用基于PAG的商品化試劑盒(IDEXX牛懷孕檢測試劑盒)進行早期孕檢,并在人工授精后75d進行直腸妊娠診斷確認,分析快速PAG酶聯(lián)免疫法的實際應用效果,以期提高奶牛繁殖效率,并為奶牛場進行母牛的早期妊娠診斷提供借鑒。1材料和方法1.1試驗動物選擇發(fā)情配種后28～45d的黑白花奶牛273頭,采集靜脈血液10mL,送入實驗室進行快速PAG酶聯(lián)免疫法妊娠診斷。1.2試劑牛懷孕檢測試劑盒由北京愛德士元亨生物科技有限公司提供。批次41169-X961,有效期至2013年2月28日。1.3妊娠合并心臟病模型將待檢血清和牛懷孕檢測試劑盒恢復到室溫,按照ELISA試劑盒產品說明書要求進行孵育和操作,檢測待檢牛的妊娠狀況,具體結果詮釋方法為:血清或EDTA血漿S-N值<0.300,為陰性,表示母?？諔?血清或EDTA血漿S-N值≥0.300,為陽性,表示母牛懷孕。1.4矛盾的完成牛懷孕檢測試劑盒診斷出的陰性(空懷)牛和陽性(懷孕)牛均不予處理,等待配種后75d進行直腸妊娠診斷確認。自然返情時直腸觸診有卵泡發(fā)育以及75d直腸觸診未懷孕者確定為空懷牛;75d直腸妊娠檢查懷孕的母牛確定為懷孕牛。1.5空懷牛樣品的pag檢測結果在結果判定中,敏感性為妊娠牛樣品中PAG酶聯(lián)免疫法檢測結果為陽性的比例;特異性為空懷牛樣品中PAG檢測結果為陰性的比例。結果的陽性預測值為PAG檢測為已孕的牛確定為真實妊娠的比例,結果的陰性預測值為PAG檢測為空懷的牛確定為真實為空懷的比例;結果的準確性為PAG檢測的妊娠狀況(妊娠+空懷)與直腸觸診結果一致的比例。1.6比較性試驗結果利用Kappa值對PAG酶聯(lián)免疫法和直腸觸診妊娠診斷結果進行一致性評價。Kappa值為1表明完全符合,0為完全不符。在比較性試驗中,Kappa值在0.4～0.5之間,說明符合率中等;0.5～0.6說明符合率良好;>0.6說明符合率很高。2pagelisa試劑盒的準確性和安全性分析在試驗期間,對273頭奶牛分別使用牛妊娠相關糖蛋白(PAG)ELISA試劑盒和直腸檢查兩種方法進行妊娠檢測,并將得到的結果進行比對。利用PAGELISA試劑盒共檢測出80頭奶牛陰性(空懷),193頭奶牛陽性(懷孕)。在75d直腸檢查時發(fā)現(xiàn),使用PAGELISA試劑盒檢測為陰性(空懷)的80頭牛全部為空懷。因此,使用牛妊娠相關糖蛋白(PAG)ELISA試劑盒檢測的陰性預測值為100%(見表1)。PAGELISA試劑盒檢測為陽性(懷孕)的193頭牛中,75d直腸檢查時發(fā)現(xiàn)其中的167頭已孕,而26頭為空懷,有返情表現(xiàn)的牛平均返情時間為49.5d,懷疑這26頭牛早期胚胎死亡或者流產。為了分析PAGELISA試劑盒檢測結果的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值和準確性,建立了2×2列聯(lián)表(見表2),并在表3中列出了以75d進行直腸觸診為標準,PAGELISA試劑盒的準確性。從表3可以得出,PAGELISA試劑盒妊娠診斷的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值和準確性分別為100%、75.5%、86.5%、100%和90.5%,Kappa為79.1%。PAGELSIA試劑盒和直腸觸診妊娠診斷結果符合率很高。Kappa(K)值適用于計數(shù)資料的一致性評測,由表2數(shù)據計算得來。Kappa值范圍在+1與-1之間。若Kappa值>0.6,表示一致性相當可靠。本研究結果表明:兩種妊檢方法的一致率Po=a+d/N=(167+80)/273=90.5%機遇一致率Pe=[(a+c)(a+b)/N+(b+d)(c+d)/N]/N=[(167×193)/273+(106×80)/273]/273=54.6%非機遇一致率=1-Pe=1-54.6%=45.4%實際一致率=Po?Pe=90.5%?54.6%=35.9%Kappa=Po?Pe1?Pe=35.945.4=0.791實際一致率=Ρo-Ρe=90.5%-54.6%=35.9%Κappa=Ρo-Ρe1-Ρe=35.945.4=0.791從以上Kappa值可以看出,兩種妊娠鑒別方法結果的一致有多大程度由非機遇所帶來,也即真正一致的程度。本試驗中Kappa為79.1%,表明PAGELSIA試劑盒和直腸觸診兩種妊娠診斷結果符合率很高,應用PAGELSIA試劑盒完全能夠用于奶牛早期妊娠診斷。3pagelisa試驗劑盒檢測結果IDEXX牛懷孕檢測試劑盒是根據酶聯(lián)免疫反應原理設計的、用于檢測懷孕早期存在于牛血清或EDTA血漿中的懷孕相關蛋白(PAGs),此類蛋白可以作為牛懷孕的標志。微孔板已經包被有懷孕相關蛋白抗體,將待檢樣品進行稀釋并孵育后,捕獲到的懷孕相關蛋白(PAG)可以與特異性的PAG抗體(檢測溶液)和辣根過氧化物酶標記物(酶標抗體)結合。未被結合的酶標抗體則被洗掉,隨后在孔內加入TMB底物溶液?？變热芤旱念伾顪\與樣品中PAG的含量成比例。最終結果通過酶標儀讀取并利用Xchek軟件進行陰陽性判讀。在本研究中,PAGELISA試劑盒檢測母牛妊娠診斷的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值和準確性分別為100%、75.5%、86.5%、100%和90.5%,與直腸檢查75d結果相同,表明該方法可用于母牛的早期妊娠診斷。Silva等評估PAG判斷妊娠狀況準確性試驗中得出,PAG檢測方法的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值和準確性分別為96.8%～98.9%、91.7%～97.3%、89.7%～93.8%、97.5%～99.5%和93.9%～97.8%,本研究與Silva等的研究一致,說明PAGELISA試劑盒檢測的敏感性和陰性預測值均很高,便于準確發(fā)現(xiàn)空懷牛,及時對其進行處理,及早再次配種,縮短配種間隔,達到減少空懷天數(shù)的目的。在本研究中,PAGELISA試劑盒檢測的特異性和陽性預測值分別為75.5%和86.5%,兩種方法的差異性可能因為評估時間不統(tǒng)一。Silva等的研究對試驗牛只采集血液進行PAG檢測后,立即應用B超進行妊娠診斷,所以兩種診斷方法符合度很高。在本試驗中,PAGELISA試劑盒在母牛配種后28d診斷妊娠狀況,而該奶牛場直腸檢查法在母牛妊娠75d時具有較高的準確性,因此選取了75d直腸檢查的方法來評價PAGELISA試劑盒檢測的準確性。在母牛早期妊娠診斷時,由于PAGELISA試劑盒檢測法和直腸檢查法兩種孕檢方法無法同時進行(間隔47d),因而無法對其特異性(直腸檢查空懷樣品中,PAGELISA試劑盒法檢測結果為陰性的比例)和陽性預測值(PAGELISA試劑盒檢測為已孕的牛只,確定為真實妊娠)進行客觀評價,因為PAGELISA試劑盒檢測至直腸檢查期間出現(xiàn)的胚胎死亡現(xiàn)象會干擾特異性和陽性預測值的評估。另外,本試驗牛場牛奶尿素偏高,尿素氮升高,也會造成奶牛子宮中尿素氮的沉積過量,從而導致奶牛的胚胎死亡。本次試驗結果未出現(xiàn)假陽性(PAG檢測陰性,直腸觸診為妊娠),這對牧場繁殖管理至關重要,使用PAGELISA試劑盒不會將已孕牛只診斷為空懷,而致使繁育人員錯誤的為已妊娠牛只進行發(fā)情處理,造成已妊娠奶牛的流產。4pagelisa試劑盒法的準確性和局限性早期妊娠診斷是通過及早發(fā)現(xiàn)空懷牛,并對其進行再處理和再次輸精的方式,直接縮短產犢間隔。目前常用的直腸觸診法通常是在配種后60～90d進行,與28d使用牛妊娠相關糖蛋白診斷相比,對于一些發(fā)情表現(xiàn)不明顯或者無發(fā)情表現(xiàn)的空懷牛就失去了14d甚至更多及早處理的時間。牛懷孕檢測試劑盒具有快速、準確、易于標準化等優(yōu)點,適用于規(guī)?；翀龅娜粘７敝彻ぷ?/p>