牛傳染性鼻支氣管炎滅活疫苗安全性和免疫保護(hù)效果研究

牛傳染性鼻支氣管炎滅活疫苗安全性和免疫保護(hù)效果研究

牛感染（ibr）是由牛感染的由鼻支氣管炎病毒引起的急性、客觀性和接觸性傳染病。主要表現(xiàn)為高燒、呼吸困難、鼻塞、鼻塞和上呼吸道炎癥。還可能導(dǎo)致奶牛和母乳喂養(yǎng)、成人工業(yè)化炎癥、尿失禁和母乳喂養(yǎng)預(yù)測(cè)的腦炎。結(jié)膜炎和角膜炎,繼發(fā)性的細(xì)菌感染能導(dǎo)致更嚴(yán)重的呼吸道疾病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將本病列為B類疾病,也是我國(guó)進(jìn)境動(dòng)物的必檢疾病之一。1955年在美國(guó)科羅拉多州的育肥肉牛中最早發(fā)現(xiàn)該病,1956年Madin等首次從患病牛分離出IBRV。我國(guó)于1980年從新西蘭進(jìn)口牛中分離到該病毒。隨后在國(guó)內(nèi)部分省區(qū)的農(nóng)牧場(chǎng)及奶牛場(chǎng)進(jìn)行的血清學(xué)調(diào)查結(jié)果表明,北京、廣東、廣西、河南、河北、新疆、山東、四川等地的黑白花乳牛、本地黃牛和水牛中都有IBRV感染。由于沒有很好的免疫防護(hù)措施,本病呈上升趨勢(shì),對(duì)牛群的肥育、產(chǎn)奶和繁殖影響極大,給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重危害。疫苗接種是本病最重要的預(yù)防和控制措施,其中滅活疫苗因在使用過程中具有較好的安全性,在種公牛、母牛和經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的奶牛群中得到廣泛應(yīng)用。本課題組于2008年從田間分離到1株IBRV,并對(duì)其進(jìn)行了全面的鑒定,命名為IBRVLN01/08株,將該病毒經(jīng)MDBK細(xì)胞連續(xù)傳代后,病毒生長(zhǎng)特性趨于穩(wěn)定,經(jīng)增殖培養(yǎng)條件的優(yōu)化,得到較高效價(jià)的病毒培養(yǎng)液。本研究以分離鑒定的IBRVLN01/08株為毒種,以206佐劑為制苗佐劑制備滅活疫苗,提高了疫苗的免疫效果。1材料和方法1.1細(xì)胞和病毒牛腎(MDBK)細(xì)胞、牛傳染性鼻氣管炎病毒LN01/08株,均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所保存和供應(yīng)。1.2主試劑DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、新生牛血清、馬血清均購自HyClone公司;BEI購自Fluka公司;206佐劑購自法國(guó)賽比克公司。1.3立地條件提供方式1月齡左右犢牛,6～8月齡牛,后備母牛,懷孕1～3個(gè)月、4～6個(gè)月和7～8個(gè)月的母牛均由吉林省輝南縣養(yǎng)牛場(chǎng)提供。試驗(yàn)前對(duì)試驗(yàn)牛進(jìn)行采血,經(jīng)中和抗體檢測(cè),抗IBRV中和抗體陰性。1.4mdbk細(xì)胞毒性檢測(cè)待轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)的MDBK細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后,棄瓶?jī)?nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)液(含60mL/L新生牛血清的DMEM),按照1∶100的病毒感染量[MOI,病毒粒子數(shù)(lgTCID50)/細(xì)胞數(shù)]接種病毒,并補(bǔ)足維持液(含20mL/L馬血清的DMEM),37℃恒溫轉(zhuǎn)瓶機(jī)上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)32～48h,同時(shí)設(shè)未接種IBRV的MDBK細(xì)胞作為對(duì)照。當(dāng)接種IBRV轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)約90%以上的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE),而對(duì)照細(xì)胞仍正常時(shí),取出有CPE的轉(zhuǎn)瓶,置-20℃冰柜中凍融1次,收獲病毒液。1.5mtdbk細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)取制備的病毒液,使用含20mL/L馬血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行10倍系列稀釋,取10-5、10-6、10-7和10-8四個(gè)稀釋度,分別接種于96孔板MDBK細(xì)胞中,每個(gè)稀釋度接種8個(gè)孔,每孔0.1mL,同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照,37℃50mL/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4d,觀察CPE,使用SpearmanKarber公式計(jì)算TCID50。1.6mdbk細(xì)胞的滅活取制備的病毒液,加入終濃度為3mmol/L的二乙烯亞胺(binaryethylenimine,BEI)溶液,置于磁力攪拌器上連續(xù)攪拌,在37℃條件下進(jìn)行滅活。滅活36h后取2份25mL病毒液,分別接種MDBK細(xì)胞進(jìn)行滅活檢驗(yàn),并經(jīng)MDBK細(xì)胞盲傳2代,每代均培養(yǎng)30～72h,觀察CPE。同時(shí)設(shè)陽性病毒對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照。1.7水相法加入水相將油相(206佐劑)加入無菌容器內(nèi),開動(dòng)勻漿機(jī)以120r/min攪拌,同時(shí)徐徐加入水相(滅活的病毒液),油相與水相的比例為54∶46。水相加完后繼續(xù)攪拌10min,并進(jìn)行質(zhì)量控制。而后進(jìn)行分裝,分裝后抽樣進(jìn)行物理性狀和無菌檢驗(yàn)。同時(shí)將MDBK細(xì)胞液與206佐劑混合乳化制備對(duì)照疫苗。1.8疫苗安全試驗(yàn)1.8.1動(dòng)物體溫測(cè)定取制備的1批滅活疫苗,接種1月齡左右犢牛5頭,每頭牛頸部肌肉接種4mL(2頭份)。同時(shí)設(shè)3頭牛作為對(duì)照,每頭牛頸部肌肉接種對(duì)照疫苗4mL。疫苗接種后連續(xù)14d測(cè)量動(dòng)物體溫,觀察有無臨床可見異常。疫苗接種后第21天進(jìn)行二次免疫,二次免疫使用的疫苗、劑量及疫苗接種后觀測(cè)同首免。1.8.2動(dòng)物飼養(yǎng)和接種取制備的3批滅活疫苗,分別接種6～8月齡牛各5頭,每頭牛接種4mL(2頭份)。同時(shí)設(shè)3頭牛作為對(duì)照,每頭牛接種對(duì)照疫苗4mL。疫苗接種后連續(xù)14d測(cè)量動(dòng)物體溫,觀察有無臨床可見異常。疫苗首免后第21天進(jìn)行二次免疫,二次免疫使用疫苗、劑量及疫苗接種后觀測(cè)同首免。1.8.3牛和牛二次免疫應(yīng)用制備的1批滅活疫苗分別頸部肌肉注射后備母牛及懷孕1～3個(gè)月、4～6個(gè)月和7～8個(gè)月母牛各3頭,每頭牛4mL(含2頭份),同時(shí)各懷孕階段設(shè)對(duì)照母牛3頭,每頭接種對(duì)照疫苗4mL。疫苗接種后第21天進(jìn)行二次免疫,二次免疫使用疫苗及劑量同首免。疫苗接種后連續(xù)觀察至犢牛出生后1個(gè)月,觀察懷孕牛是否有流產(chǎn)、產(chǎn)死胎及弱胎現(xiàn)象。1.9免疫和接種疫苗將試驗(yàn)牛分成3組,分別接種3個(gè)不同批次的滅活疫苗,每組各接種5頭牛。首免后第21天進(jìn)行二次免疫,同時(shí)設(shè)5頭不接種疫苗的對(duì)照。疫苗接種后每周采血檢測(cè)其中和抗體效價(jià)。疫苗二次免疫后第21天,所有動(dòng)物使用IBR強(qiáng)毒攻擊,每頭牛鼻內(nèi)噴霧接種4mL強(qiáng)毒(106.4TCID50/mL)。攻毒后連續(xù)14d觀察各組牛的臨床癥狀并記錄直腸溫度,統(tǒng)計(jì)每組的攻毒保護(hù)率。2結(jié)果2.1角形、圓形、排他對(duì)比在接種病毒前,MDBK細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)良好,呈多角形、圓形等多重形態(tài),接種IBRV后第24小時(shí),可見細(xì)胞表現(xiàn)明顯的IBRV特有的病變特征,即細(xì)胞圓縮、拉網(wǎng)、聚集成葡萄串樣(見圖1)。2.2ctid50病毒溶液的測(cè)定經(jīng)測(cè)定,收獲的3批病毒液病毒含量分別為1×108.5、1×108.8和1×108.6TCID50/mL,符合要求。2.3mdbk細(xì)胞盲傳制苗用的病毒液經(jīng)終濃度為3mmol/L的BEI溶液滅活后,經(jīng)MDBK細(xì)胞盲傳2代均無可見CPE出現(xiàn),陰性對(duì)照無CPE出現(xiàn),陽性對(duì)照出現(xiàn)典型IBRVCPE。2.4物理性狀檢驗(yàn)制備的3批疫苗均為淡粉白色略帶黏滯性的均勻乳狀液;呈雙相油乳劑;3000r/min離心15min,均無水相析出;用1mL吸管分別吸取3批疫苗1mL,令其垂直自然流出,流出0.4mL所需的時(shí)間均在8s以內(nèi),說明3批疫苗物理性狀檢驗(yàn)均合格。且這3批疫苗經(jīng)培養(yǎng)基檢測(cè)均無菌落生長(zhǎng)。2.5疫苗安全試驗(yàn)2.5.11個(gè)月內(nèi)的喂養(yǎng)牛安全試驗(yàn)1月齡左右犢牛接種2頭份滅活疫苗,首免和二次免疫后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體溫均正常,無任何臨床異常表現(xiàn),注射部位吸收良好,無紅腫等不良反應(yīng)。2.5.2不良反應(yīng)發(fā)生情況6～8月齡牛分別接種2頭份3個(gè)批次的滅活疫苗,首免和二免后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體溫均正常,無任何臨床異常表現(xiàn),注射部位吸收良好,無紅腫等不良反應(yīng)。2.5.3接種2頭份滅活疫苗總臨床異常表現(xiàn)后備母牛及懷孕1～3個(gè)月、4～6個(gè)月和7～8個(gè)月的母牛接種2頭份滅活疫苗后無任何臨床異常表現(xiàn),無流產(chǎn)、產(chǎn)死胎及弱胎現(xiàn)象,犢牛出生后至1個(gè)月均健活。2.6兩組臨床癥狀的比較試驗(yàn)牛從接種疫苗后第14天開始產(chǎn)生中和抗體,二免后中和抗體水平明顯升高(見表1)。3批疫苗接種、攻毒后,第2組的5頭牛體溫均正常,未表現(xiàn)任何臨床癥狀,攻毒保護(hù)率為100%(5/5)。第1組和第3組各有1頭牛體溫升高,并表現(xiàn)輕微臨床癥狀,攻毒保護(hù)率均為80%(4/5)。對(duì)照組5頭牛體溫全部升高并表現(xiàn)明顯臨床癥狀,對(duì)照組發(fā)病率為100%(5/5)(見圖2、3,表2)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的臨床癥狀分值主要依據(jù)鼻黏膜病變、流鼻液及淚液程度而定,為各癥狀分值的累加值(鼻黏膜龜裂、有血紅色莢膜為3分,鼻黏膜出現(xiàn)白色潰瘍斑為2分,鼻黏膜紅腫為1分,鼻黏膜正常為0分;鼻液黏稠膿性為3分,鼻液清澈帶有少量膿性物質(zhì)為2分,水樣鼻液為1分,鼻液正常為0分;眼部大量流淚為2分,少量流淚為1分,正常為0分)。疫苗接種組攻毒后排毒動(dòng)物數(shù)明顯少于對(duì)照組,且排毒時(shí)間較短(見表2)。3滅活疫苗的佐劑選擇自20世紀(jì)50年代在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)牛傳染性鼻氣管炎病以來,該病給世界養(yǎng)牛業(yè)帶來了極大的損失。對(duì)于IBR的控制,一些國(guó)家采取了檢驗(yàn)和撲殺政策,但由于耗資巨大,對(duì)于擁有大量牛群且經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)的國(guó)家是不現(xiàn)實(shí)的,因此接種疫苗成為多數(shù)國(guó)家控制和預(yù)防本病的主要措施。目前所使用的疫苗主要有兩種,弱毒疫苗和滅活疫苗。弱毒疫苗具有產(chǎn)生免疫效應(yīng)快、免疫期持久等優(yōu)點(diǎn),Todd等報(bào)道了一種經(jīng)兔腎細(xì)胞連續(xù)繼代獲得的無毒疫苗,采用鼻腔接種途徑,接種牛無任何不良反應(yīng),7～10d后開始出現(xiàn)抗體,40～72h鼻分泌物中出現(xiàn)大量干擾素,持續(xù)10d,且不引起流產(chǎn)。但歐洲的一些國(guó)家曾用過不同的弱毒疫苗,這些疫苗能產(chǎn)生快速的保護(hù)免疫力,其廣泛使用降低了本病的發(fā)病率,減少了經(jīng)濟(jì)損失。但也有很多弊端,如有不少報(bào)道因疫苗株減毒較差而引起流產(chǎn),因而弱毒疫苗不能用于懷孕動(dòng)物。滅活疫苗具有較好的安全性,相對(duì)于弱毒疫苗產(chǎn)生免疫效應(yīng)慢,且免疫期短,但有研究表明,可通過選擇不同的佐劑和免疫增強(qiáng)劑有效提高疫苗的免疫效果,也可采取多次免疫以保證對(duì)牛群的長(zhǎng)期保護(hù)。因此,滅活疫苗在種公牛、后備母牛、懷孕母牛以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的奶牛群中應(yīng)用范圍較廣。目前,病毒滅活多使用甲醛作為滅活劑,其作用原理是通過對(duì)蛋白和核酸的烷化作用使病毒失活,喪失感染性,存在副作用大和抗原性破壞嚴(yán)重的缺點(diǎn)。本研究采用BEI作為病毒滅活劑,其作用原理是破壞微生物核酸,而不影響其蛋白質(zhì)成分,從而保證了病毒的抗原性不變。本研究使用終濃度為3mmol/L的BEI溶液滅活I(lǐng)BRV,滅活后第36小時(shí)后取樣,使用MDBK細(xì)胞盲傳2代進(jìn)行滅活檢驗(yàn),結(jié)果滅活病毒液盲傳2代無IBRV特異性CPE出現(xiàn),證明該病毒滅活徹底,且滅活病毒液接種MDBK細(xì)胞后,MDBK細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)與對(duì)照相比無明顯差異,說明BEI對(duì)細(xì)胞的損傷程度較輕,進(jìn)一步證明用BEI作為滅活劑對(duì)動(dòng)物的副作用小。同時(shí)經(jīng)MDBK細(xì)胞盲傳2代進(jìn)行滅活檢驗(yàn),證實(shí)了病毒液滅活完全和疫苗的安全性。佐劑的選擇是關(guān)系到滅活疫苗質(zhì)量的重要因素。目前用于畜禽疫苗研制的佐劑主要有礦物油佐劑和弗氏佐劑等,這些佐劑在增強(qiáng)疫苗免疫效果方面發(fā)揮了重要作用,但通常副反應(yīng)較大。近年來,有研究報(bào)道了一些新型佐劑,如細(xì)胞因子佐劑和納米佐劑等,這些佐劑在提高細(xì)胞免疫反應(yīng)和降低副反應(yīng)方面具有較好的效果,但將其作為商品化制苗佐劑進(jìn)行應(yīng)用,還需進(jìn)一步研究。本研究使用新型商品化206佐劑作為疫苗生產(chǎn)佐劑,該佐劑具有副作用小、免疫效應(yīng)產(chǎn)生早等特點(diǎn)。將該佐劑與滅活的IBR病毒液乳化制備了3批疫苗,疫苗安全性試驗(yàn)結(jié)果表明,1月齡犢牛、6～8月齡犢牛和母牛接種2頭份滅活疫苗后,無局部和全身反應(yīng),母牛接種疫苗后所產(chǎn)犢牛均健康,無流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎現(xiàn)象,說明疫苗對(duì)牛安全,使用范圍廣。疫苗效力試驗(yàn)結(jié)果表明,疫苗接種后第14天即可產(chǎn)生中和抗體,第21天二免后中和抗體水平明顯升高,二免后第21天攻毒,疫苗接種組的攻毒保護(hù)率均達(dá)80%