固相析出分離技術(shù)-鹽析法

沉淀法介紹鹽析概念一鹽析的原理二目錄一二鹽析的操作步驟三鹽析的注意事項四由于不同的蛋白質(zhì)溶解度.不同，沉淀時所需的離子強度也不相同,如果需要先除去些雜蛋白,然后在較高的飽和度下,沉淀目標蛋白質(zhì)，則可采用分段鹽析改變鹽的濃度，可將混合液中的蛋白質(zhì)分批鹽析分開。如半飽和硫酸銨可沉淀血漿球蛋白，飽和硫酸銨則可沉淀包括血漿清蛋白。一、分段鹽析二、鹽析用鹽量的確定--飽和度◆飽和度的概念:以硫酸銨為例:25°C時，硫酸銨的飽和溶解度是767g/L定義為100%飽和度?！裟繕说鞍踪|(zhì)的鹽析沉淀操作之前，所需的硫酸銨濃度或飽和濃度可通過實驗確定。◆對多數(shù)蛋白質(zhì)，當達到85%飽和度時，溶解度都小于0.1mg/L,通常為兼顧收率與純度，飽和度的操作范圍在40%--60%之間。1.分段鹽析的條件先需要進行小實驗探索，如：先進行0%-30%的硫酸銨沉淀，再進行30%-60%的硫酸銨沉淀，最后進行60%-80%的硫酸銨沉淀。2.每一段鹽析靜置之后都將離心取沉淀，透析并檢測活性。通過實驗結(jié)果可以看出哪一段鹽析出來的目的產(chǎn)物最多，相對來說雜質(zhì)就更少。3.比如實驗中的活性物質(zhì)主要在60%-80%這段出來，在以后的實驗中，就可以首先進行0%-60%的硫酸銨沉淀，這段沉淀物可以拋棄（去處大多數(shù)雜質(zhì)）；然后進行60%-80%的硫酸銨沉淀，這段沉淀出來是物質(zhì)是所需要的目的物質(zhì)含量比較高的物質(zhì)，將其收集進行下一步純化工作。三、分段鹽析操作步驟(1)加固體硫酸銨時，必須注意表中的溫度。(2)分段鹽析時，要考慮到每次分段后蛋白質(zhì)濃度的變化。(3)鹽析條件如pH、溫度和硫酸銨的純度都必須嚴格控制。(4)鹽析后-般要放置0.5~1h。(5)鹽析過程中，攪拌必須規(guī)則和溫和。(6)反應(yīng)至少應(yīng)在50mmol/L緩沖溶液中進行。四、操作注意事項鹽析法鹽析概念一鹽析的原理二目錄一二鹽析的注意事項三一、鹽析概念在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質(zhì)(酶)等生物大分子物質(zhì)在水溶液中的溶解度降低，產(chǎn)生沉淀的過程。鹽析是可逆的。而變性是不可逆的。早在1859年，中性鹽鹽析法就被用于從血液中分離蛋白質(zhì)，隨后又在尿蛋白、血漿蛋白等的分離和分級中使用，得到了比較滿意的結(jié)果。蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中，溶解度隨鹽濃度的增高而上升(鹽溶)但當鹽溶度增加到一定數(shù)值時，其溶解度有隨鹽濃度逐漸下降，直至蛋白，質(zhì)析出(鹽析)。鹽析的內(nèi)因是當鹽濃度達到--定程度時，水的活度降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面電荷中和，水化膜相繼破壞，蛋白質(zhì)分子聚集而析出沉淀。二、鹽析的原理常用的鹽析用鹽主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、磷酸二氫鈉等。實際應(yīng)用中以硫酸銨最為常用。因為硫酸銨具有:①離子強度大，鹽析能力強②溶解度大且受溫度的影響小③不易使蛋白質(zhì)變性④價格價廉三、鹽析常用鹽1.要有較強的鹽析效果2.要有足夠大的溶解度，且溶解度受溫的影響效果小3.不影響蛋白質(zhì)等生物大分子的活性4.來源豐富，價格低廉四、鹽析所用無機鹽的選擇原則鹽飽和度的影響:不同的蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同，鹽析時所需的飽和度也就不同。蛋白質(zhì)濃度的影響:--般常將蛋白質(zhì)濃度控制在2-3%為宜。pH的影響:進行鹽析時的pH，要選擇在被鹽析的蛋白質(zhì)的pl附近。溫度的影響:蛋白質(zhì)的鹽析一般在室溫下進行。五、鹽析影響因素(1)加入固體鹽法用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況;工業(yè)上常采用這種方法，加入速度不能太快，應(yīng)分批加入，并充分攪拌，使其完全溶解和防止局部濃度過高；(2)加入飽和溶液法用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況;它可防止局部過濃，但加量較多時，料液會被稀釋；(3)透析平衡法先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽