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模塊三、酶的下游生產(chǎn)工藝酶制劑生產(chǎn)技術(shù)固定化生物技術(shù)

通過(guò)化學(xué)或物理的手段將酶或游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域內(nèi),使其保持活性并可反復(fù)利用。

引入學(xué)習(xí)情境十四酶的固定化工作任務(wù)(一)固定化技術(shù)和固定化酶概述工作任務(wù)(二)酶的固定化技術(shù)工作任務(wù)(三)固定化酶的特點(diǎn)工作任務(wù)(四)固定化酶的應(yīng)用水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶(固定化酶)固定化技術(shù)工作任務(wù)(一)固定化技術(shù)和固定化酶概述固定化酶(immobilizedenzyme)固定在載體上并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。固定化技術(shù)和固定化酶概述工作任務(wù)(一)固定化技術(shù)和固定化酶概固定化技術(shù)和固定化酶概述工作任務(wù)(一)固定化技術(shù)和固定化酶概固定化方法吸附法結(jié)合法網(wǎng)格型微囊型熱處理法交聯(lián)法包埋法固定化酶與游離酶相比,具有下列優(yōu)點(diǎn)

(l)極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開;

(2)可以在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)分批反應(yīng)和連續(xù)反應(yīng);

(3)在大多數(shù)情況下,能夠提高酶的穩(wěn)定性;

(4)酶反應(yīng)過(guò)程能夠加以嚴(yán)格控制;

(5)產(chǎn)物溶液中沒(méi)有酶的殘留,簡(jiǎn)化了提純工藝;

(6)較游離酶更適合于多酶反應(yīng);

(7)可以增加產(chǎn)物的收率,提高產(chǎn)物的質(zhì)量;

(8)酶的使用效率提高,成本降低。固定化技術(shù)和固定化酶概述工作任務(wù)(一)固定化技術(shù)和固定化酶概固定化酶操作的注意事項(xiàng)活性中心:保護(hù)酶的催化作用,并使酶的活性中心的氨基酸基團(tuán)固有的高級(jí)結(jié)構(gòu)不受到損害,在制備固定化酶時(shí),需要在非常嚴(yán)密的條件下進(jìn)行。功能基團(tuán):如游離的氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基等,當(dāng)這些功能基團(tuán)位于酶的活性中心時(shí),要求不參與酶的固定化結(jié)合酶的高級(jí)結(jié)構(gòu):要避免用高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等處理,而且有機(jī)溶劑、高濃度的鹽也會(huì)使酶變性、失活,因此,操作應(yīng)盡量在非常溫和的條件下進(jìn)行。固定化技術(shù)和固定化酶概述工作任務(wù)(一)固定化技術(shù)和固定化酶概課堂總結(jié)固定化技術(shù)和固定化酶概述模塊三、酶的下游生產(chǎn)工藝酶制劑生產(chǎn)技術(shù)固定化生物技術(shù)

通過(guò)化學(xué)或物理的手段將酶或游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域內(nèi),使其保持活性并可反復(fù)利用。

引入學(xué)習(xí)情境十四酶的固定化工作任務(wù)(一)固定化技術(shù)和固定化酶概述工作任務(wù)(二)酶的固定化技術(shù)工作任務(wù)(三)固定化酶的特點(diǎn)工作任務(wù)(四)固定化酶的應(yīng)用固定化酶的特性將酶或含酶菌體固定化制成固定化酶或固定化菌體以后,由于受到載體等的影響,酶的特性可能會(huì)有些變化。1、固定化酶的穩(wěn)定性一般比游離酶的穩(wěn)定性好。

貯存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性比游離酶大多數(shù)提高對(duì)熱穩(wěn)定性絕大多數(shù)提高對(duì)蛋白類分解酶的穩(wěn)定性提高對(duì)變性劑的耐受力升高工作任務(wù)(三)固定化酶的特性2、固定化酶的最適作用溫度一般與游離酶差不多,活化能也變化不大。3、固定化酶的底物特異性與游離酶比較可能有些不同,其變化與底物分子量的大小有一定關(guān)系。固定化酶底物特異性的改變,是由于載體的空間位阻作用引起。4、酶經(jīng)過(guò)固定化后,其作用的最適pH值往往會(huì)發(fā)生一些變化。這一點(diǎn)在使用固定化酶時(shí),必須引起注意。影響固定化酶最適pH值的因素主要有兩個(gè):一個(gè)是載體的帶電性質(zhì),載體帶負(fù)電荷,pH向堿性方向移動(dòng),載體帶正電荷,pH向酸性方向移動(dòng);另一個(gè)是酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的性質(zhì),催化反應(yīng)的產(chǎn)物為酸性時(shí),固定化酶的最適pH值比游離酶的pH值高;反之則低。固定化酶的特性工作任務(wù)(三)固定化酶的特性5、評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo):(1)固定化酶的比活:每(克)干固定化酶所具有的酶活力單位。或:?jiǎn)挝幻娣e(cm2)的酶活力單位表示(酶膜、酶管、酶板)。(2)操作半衰期:衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)。連續(xù)測(cè)活條件下固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的時(shí)間(t1/2)(3)相對(duì)酶活力:具有相同酶蛋白(或RNA)量的固定化酶活力與游離酶活力的比值稱為相對(duì)酶活力固定化酶的特性工作任務(wù)(三)固定化酶的特性課堂總結(jié)固定化酶的特點(diǎn)模塊三、酶的下游生產(chǎn)工藝酶制劑生產(chǎn)技術(shù)固定化生物技術(shù)

通過(guò)化學(xué)或物理的手段將酶或游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域內(nèi),使其保持活性并可反復(fù)利用。

引入學(xué)習(xí)情境十四酶的固定化工作任務(wù)(一)固定化技術(shù)和固定化酶概述工作任務(wù)(二)酶的固定化技術(shù)工作任務(wù)(三)固定化酶的特點(diǎn)工作任務(wù)(四)固定化酶的應(yīng)用吸附法

利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上,而使酶固定化的方法。常用的固體吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石等。固定化技術(shù)操作簡(jiǎn)便,條件溫和,不會(huì)引起酶變性失活,載體廉價(jià)易得,而且可反復(fù)使用。由于靠物理吸附作用,結(jié)合力較弱,酶與載體結(jié)合不牢固而容易脫落,所以使用受到一定的限制。

工作任務(wù)(二)固定化技術(shù)包埋法

將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中,使酶固定化的方法。固定化技術(shù)包埋法使用的多孔載體主要有:瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺、光交聯(lián)樹脂、聚酰胺、火棉膠等。工作任務(wù)(二)固定化技術(shù)根據(jù)載體材料和方法的不同,可分為:凝膠包埋法:將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內(nèi)部的微孔中,制成一定形狀的固定化酶或固定化含酶菌體。大多數(shù)為球狀或片狀,也可按需要制成其他形狀。常用的凝膠有瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠等天然凝膠以及聚丙烯酰胺凝膠、光交聯(lián)樹脂等合成凝膠。半透膜包埋法:將酶包埋在由各種高分子聚合物制成的小球內(nèi),制成固定化酶。常用于制備固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉膠膜等固定化技術(shù)工作任務(wù)(二)固定化技術(shù)(1)瓊脂凝膠包埋法將一定量的瓊脂加入到一定體積的水中,加熱使之溶解,然后冷卻至48~55°C,加入一定量的酶液,迅速攪拌均勻后,趁熱分散在預(yù)冷的甲苯或四氯乙烯溶液中,形成球狀固定化細(xì)胞膠粒,分離后洗凈備用。缺點(diǎn):機(jī)械強(qiáng)度較差,底物、產(chǎn)物擴(kuò)散困難,故使用受限制固定化技術(shù)工作任務(wù)(二)固定化技術(shù)(2)海藻酸鈣凝膠包埋法稱取一定量的海藻酸鈉,溶于水,配制成一定濃度的海藻酸鈉溶液,經(jīng)殺菌冷卻后,與一定體積的酶液或細(xì)胞混合均勻,然后用注射器或滴管將冷凝懸液滴到一定濃度的氯化鈣溶液中。優(yōu)點(diǎn):操作簡(jiǎn)便、條件溫和,對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害,通過(guò)改變海藻酸鈉的濃度可以改變凝膠的孔徑。使用時(shí)注意控制培養(yǎng)基中磷酸鹽的濃度,維持一定的鈣離子濃度。固定化技術(shù)

工作任務(wù)(二)固定化技術(shù)海藻酸鈣包埋法裝置將水溶性的海藻酸鈉配成水溶液,并把酶或細(xì)胞分散在其中,然后將其滴入凝固浴中(常用CaCl2

溶液),使海藻酸鈉中的Na+,部分被Ca2+所取代而形成由多價(jià)離子交聯(lián)的離子網(wǎng)絡(luò)凝膠。固定化技術(shù)

工作任務(wù)(二)固定化技術(shù)(3)角叉菜膠包埋法角叉菜,屬褐藻門,杉藻科,角叉菜屬,自然分布于大西洋沿岸和我國(guó)東南沿海以及青島、大連等海域,是中國(guó)的一種重要經(jīng)濟(jì)海藻。角叉菜不僅是卡拉膠生產(chǎn)的重要原藻,而且近年來(lái)越來(lái)越多地應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域,引起人們的廣泛關(guān)注。固定化技術(shù)

工作任務(wù)(二)固定化技術(shù)將一定量的角叉菜膠懸浮于一定體積的水中,加熱溶解。滅菌后冷卻到30-50°C,與一定量的酶液等混合均勻后,趁熱滴到預(yù)冷的氯化鉀溶液中,或者先滴到冷的植物油中,成型后再置于氯化鉀溶液中的到球狀固定化顆粒。優(yōu)點(diǎn):通透性能好,對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害。固定化技術(shù)

工作任務(wù)(二)固定化技術(shù)(4)明膠包埋法將一定量的明膠懸浮于一定體積的水中,加熱溶解。滅菌后冷卻到35°C以上,與一定量的酶液等混合均勻后制成所需形狀的膠粒。機(jī)械強(qiáng)度不夠可用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)。固定化技術(shù)

工作任務(wù)(二)固定化技術(shù)(5)聚丙烯酰胺凝膠包埋法先配置一定濃度的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺與一定量的酶液等混合均勻后加入一定量的過(guò)硫酸鈣和四甲基乙二胺,混合后讓其靜置聚合即可獲得。優(yōu)點(diǎn):機(jī)械強(qiáng)度高,可調(diào)節(jié)凝膠孔徑缺點(diǎn):丙烯酰胺單體有毒性固定化技術(shù)

工作任務(wù)(二)固定化技術(shù)(6)光交聯(lián)樹脂包埋法例:相對(duì)分子量為1000-3000的光交聯(lián)聚氨酯預(yù)聚物等,加入1%左右的光敏劑,加水配成一定濃度,加熱至50℃,然后與一定濃度的細(xì)胞懸浮液混合均勻,攤成一定厚度的薄層,用紫外照射3min,就可制得優(yōu)點(diǎn):強(qiáng)度高、使用時(shí)間長(zhǎng)固定化時(shí)間短固定化技術(shù)

工作任務(wù)(二)固定化技術(shù)(7)半透膜(微囊型)包埋法是將酶包埋在各種高分子聚合物制成的小球內(nèi),制成固定化酶。半透膜的孔徑只有幾?至幾十?,所以也稱為微囊化法。適用于底物和產(chǎn)物都是小分子物質(zhì)的固定化固定化技術(shù)

工作任務(wù)(二)固定化技術(shù)結(jié)合法

選擇適宜的載體,使之通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵與酶結(jié)合在一起的固定化方法。固定化技術(shù)

工作任務(wù)(二)固定化技術(shù)根據(jù)酶與載體結(jié)合的化學(xué)鍵不同,可分為:離子鍵結(jié)合法:通過(guò)離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法稱為離子鍵結(jié)合法。離子鍵結(jié)合法所使用的載體是某些不溶于水的離子交換劑。常用的有DEAE-纖維素、TEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等。共價(jià)鍵結(jié)合法:通過(guò)共價(jià)鍵將酶與載體結(jié)合的固定化方法稱為共價(jià)鍵結(jié)合法。共價(jià)鍵結(jié)合法所采用的載體主要有:纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質(zhì)、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。酶分子中可以形成共價(jià)鍵的基團(tuán)主要有:氨基、羧基、巰基、羥基、酚基和咪唑基等。要使載體與酶形成共價(jià)鍵,必須首先使載體活化,固定化技術(shù)

工作任務(wù)(二)固定化技術(shù)交聯(lián)法借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用,制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法。戊二醛有兩個(gè)醛基,這兩個(gè)醛基都可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng),形成席夫(Schiff)堿,而使酶或菌體蛋白交聯(lián),制成固定化酶或固定化菌體。常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。其中應(yīng)用最廣泛的是戊二醛。固定化技術(shù)

工作任務(wù)(二)固定化技術(shù)

交聯(lián)法制備的固定化酶或固定化菌體結(jié)合牢固,可以長(zhǎng)時(shí)間使用。但由于交聯(lián)反應(yīng)條件較激烈,酶分子的多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián),致使酶活力損失較大,而且制備成的固定化酶或固定化菌體的顆粒較小

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