基因（基因工程課件）

基因概述CONTENTS目錄01基因?qū)W說的創(chuàng)立02基因與DNA分子的關系03基因的概念04基因的特點05基因的分類06基因的結構基因?qū)W說的創(chuàng)立遺傳因子（hereditaryfactor）概念孟德爾提出1857年到1864年，豌豆雜交試驗。雙因子雜交試驗子一代種子全是黃色圓形自交黃色圓形：黃色皺形：綠色圓形：綠色皺形9：3：3：1黃圓種子綠皺種子子一代種子全是圓形自交圓皺比3：1圓形種子皺形種子推想：每一性狀都由遺傳因子控制，這些因子從親代到子代，代代相傳；體細胞中：遺傳因子成對存在，一個來自父本，一個來自母本；配子中：成對的遺傳因子彼此分開，成單存在；雜交子一代體細胞中：成對的遺傳因子各自獨立存在。在形成配子時，彼此分離；令人遺憾的是，孟德爾的這些科學發(fā)現(xiàn)和見解湮沒了35年。1900年，荷蘭H.DeVries、德國C.Correns和奧地利E.Tschermak等植物學家，各自獨立地做了與孟德爾相似的實驗，得出了與孟德爾相似的結論。1909年，丹麥生物學家W.Johannsen根據(jù)希臘文“給予生命”之義，創(chuàng)造了（gene)一詞，并用這個術語來代替孟德爾的“遺傳因子”。美國著名的遺傳學家摩爾根（T.H.Morgan）對基因?qū)W說的建立做出了卓越的貢獻。1910年，摩爾根和他的助手，從紅眼的果蠅群體中發(fā)現(xiàn)了一只白眼的雄果蠅。正常果蠅都是紅眼（）野生型），白眼果蠅為突變型。1915年子一代全部紅眼果蠅自交有紅眼、有白眼所有白眼果蠅都是雄性白眼雄果蠅解釋：果蠅有4對染色體雌果蠅：1對很小呈粒狀，2對呈V形，1對呈棒狀的特征為XX染色體；雄果蠅：前3對同雌果蠅的完全一樣，但沒有1對棒狀的XX染色體，它是由1個棒狀的X染色體和一個J形的Y染色體取代，這一對叫做XY染色體。紅眼雌果蠅摩爾根推測：白眼：隱性性狀的基因（W）是位于X染色體上，而在Y染色體上沒有其等位基因。實驗：子一代紅眼雌果蠅（Ww），跟親本白眼雄果蠅（wY）回交，后代1/4是紅眼雌果蠅，1/4是白眼雄果蠅。證實：白眼隱性突變基因（w）確實位于X染色體上，這種現(xiàn)象為遺傳性狀的連鎖定律?；?qū)W說得到了普遍地承認但是，基因的結構特征是怎樣的？基因怎樣進行復制的？基因與DNA分子的關系實驗證明基因的化學本質(zhì)是DNA分子美國著名的微生物學家O.T.Avery和他的合作者C.M.Mleod及M.McCarty將S型（光滑、有毒）肺炎鏈球菌的DNA加到R型（粗糙、無毒）肺炎鏈球菌的培養(yǎng)物中，使R型轉(zhuǎn)變成S型，表現(xiàn)出具有毒力的莢膜的特性。說明，使細菌性狀發(fā)生變化的是DNA而不是蛋白質(zhì)或RNA分子。1952年，肯定了Avery的結論。美國冷泉港卡內(nèi)基遺傳學實驗室A.D.Hershey和他的學生M.Chase。用放射性同位素32P和35S,分別標記T2噬菌體DNA和外殼蛋白質(zhì)。雙標記的噬菌體感染大腸桿菌。結果：只有32P標記的DNA注入到寄主細胞內(nèi)，并且重新繁殖出子代噬菌體。實驗進一步表明：在噬菌體中的遺傳物質(zhì)也是DNA分子，而不是蛋白質(zhì)。證明了DNA是遺傳物質(zhì)和基因的載體研究表明：在生物界并非所有的基因都是由DNA構成的。某些動物病毒和植物病毒以及某些噬菌體。遺傳物質(zhì)是RNA而不是DNA。基因的概念控制性狀的基本遺傳單位。排列在染色體上，攜帶特定遺傳信息；具有一定結構；自我復制與信息傳遞的一段DNA或RNA序列?；虻母拍羁刂菩誀畹幕具z傳單位。排列在染色體上，攜帶特定遺傳信息；具有一定結構；自我復制與信息傳遞的一段DNA或RNA序列。基因的概念控制性狀的基本遺傳單位。排列在染色體上，攜帶特定遺傳信息；具有一定結構；自我復制與信息傳遞的一段DNA或RNA序列?；虻奶攸c基因決定性狀自我復制：半保留復制基因有相對的穩(wěn)定性基因會發(fā)生突變基因的分類按照重要程度分類看家基因：維持細胞基本功能的基因；必需基因：突變致死基因；按物種分類原核基因真核基因病毒基因按基因拷貝數(shù)分類單拷貝基因多拷貝基因按照功能分：結構基因：能夠翻譯的基因調(diào)控基因：調(diào)節(jié)結構基因表達調(diào)節(jié)基因、操縱基因、啟動基因只轉(zhuǎn)錄不翻譯的基因：rRNA基因、tTNA基因；基因的結構真核生物基因結構5’-UTR結構基因3’-UTR增強子轉(zhuǎn)錄起始位點啟動子外顯子終止子內(nèi)含子Poly-A結構基因：不連續(xù)，內(nèi)含子與外顯子交替排列。并非所有結構基因都包含內(nèi)含子。外顯子（exon)：結構基因中的編碼序列，在成熟mRNA中保留的片段。內(nèi)含子（intron)：結構基因中的非編碼序列，在mRNA成熟過程中被切除的部分。啟動子（promoter):位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游的一段DNA序列,是RNA聚合酶識別、結合和開始轉(zhuǎn)錄的位點。增強子：啟動子上游或下游的一段序列，增強啟動子轉(zhuǎn)錄，提高轉(zhuǎn)錄效率。終止子：阻礙RNA聚合酶移動，終止RNA轉(zhuǎn)錄的DNA序列。UTR:非翻譯區(qū)?；虻慕Y構原核生物基因結構調(diào)節(jié)基因半乳糖苷酶基因調(diào)節(jié)基因啟動子滲透酶基因轉(zhuǎn)乙酰酶基因結構基因啟動子阻遏蛋白結合位點原核生物基因的功能單位：操縱子，含有一個啟動子核多個結構基因。大腸桿菌乳糖操縱子由3個結構基因和一個操縱基因組成：調(diào)節(jié)基因lacI的表達產(chǎn)物（阻遏物（repressor)），與操縱基因結合，阻遏結構基因lacZ、lacY和lacA表達。β-半乳糖苷酶（β-galactosidase)、透性酶（permease)和乙酰基轉(zhuǎn)移酶（acetylase)的合成也就停止下來。當細胞中代謝產(chǎn)物乳糖（lactose)累積增多，與阻遏物結合，使阻遏物與操縱基因脫離，結構基因恢復轉(zhuǎn)錄，合成出參與乳糖代謝的3種酶蛋白。乳糖起到一種誘導物（inducer)的作用?；虻慕Y構病毒基因功能相關的基因排列在一起。基因結構不規(guī)則。有重疊基因。兩個或兩個以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成為兩個或兩個以上基因的組成部分。PCR擴增技術CONTENTS目錄01PCR擴增技術發(fā)明02PCR擴增技術原理03PCR反應五要素04DNA聚合酶05PCR的類型PCR擴增技術發(fā)明PCR（PolymeraseChainReaction）法，又稱為聚合酶鏈反應，是一種高效快速的體外DNA聚合程序。由1985年穆里斯（K.Mullis）發(fā)明，因此獲得了1993年的諾貝爾化學獎。

PCR法克隆目的基因前提：已知待擴增目的基因兩側(cè)序列，根據(jù)該序列合成反應必需的雙引物。PCR擴增技術原理包括三個步驟：

=>DNA模板變性(95℃)=>與DNA引物退火(45℃-55℃)=>引物延伸(72℃)30-35個循環(huán)變性退火延伸延伸PCR擴增技術的基本原理PCR反應五要素

模板：按照模板的序列合成新鏈。引物：結合在模板的3’端，在引文的3’端開始合成新鏈。dNTP：PCR合成原料。緩沖溶液：提供反應的液體環(huán)境。DNA聚合酶：合成新鏈。DNA聚合酶DNA聚合酶的種類依賴于DNA的DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ(全酶)DNA聚合酶Ⅰ大片段(klenow片段)耐熱DNA聚合酶(Taq

酶)依賴于RNA的DNA聚合酶:反轉(zhuǎn)錄酶不依賴于DNA的DNA聚合酶:末端轉(zhuǎn)移酶E.coliDNA聚合酶I（pol

I）

1.E.coli的DNA聚合酶系統(tǒng)PolI

polII

polIII

2.E.colipolI

在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個大小不同的片段小片段具5’→3’外切酶活性大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦稱為Klenow片段,pol

IK)DNaseI1.特點：具內(nèi)切酶活性，無序列特異型；作用于ds-DNA，產(chǎn)生5’-P低聚核苷酸;當酶濃度很低時，ds-DNA分子上形成切口。

2.用途

1)制備DNA探針

2)制備RNA樣品時,除去DNA分子

3)基因突變時產(chǎn)生切口大腸桿菌DNA聚合酶I基本用途5’→3’外切5’→3’聚合制備32P標記的探針DNA聚合酶I5’G-C-A-T-C-A-T-G-G-C-T-A-C-T-T-G-G-A-C3’3’C-G-T-A-G-T-A-C-C-G-A-T-G-A-A-C-C-T-G5’5’G-C-A-T-CA-T-G-G-C-TA-C-T-T-G-G-A-C3’3’C-G-T-A-G-T-A-C-C-G-A-T-G-A-A-C-C-T-G5’DNA聚合酶I4種dNTPppp32dA5’G-C-A-T-C-A-T-G-G-C-T-A-C-T-T-G-G-A-C3’3’C-G-T-A-G-T-A-C-C-G-A-T-G-A-A-C-C-T-G5’雙鏈DNA（基因）分子用一條單鏈作為模板信使RNA分子，以其為模板互補的單鏈DNA，以其為模板組成一個雙鏈cDNA分子cDNA短，比基因少了內(nèi)含子依賴于RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）轉(zhuǎn)錄并成熟合成cDNA依賴于RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）雙向外切DNA/RNA雜合鏈中的RNA鏈RNADNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶TaqDNA聚合酶1）來自水生棲熱菌Thermusaquaticus；2）良好的耐熱性；3）Mg2+依賴性；4）無校正功能。特點：最適反應溫度75℃對95℃高溫具良好穩(wěn)定性不存在3’→5’外切酶活性用途：PCRPCR的類型多重PCR定量PCR差異顯示PCR錨定PCRRT-PCR-----多重PCR: