博士研究生課程-核磁共振實(shí)驗(yàn)技術(shù)教學(xué)課件

核磁共振實(shí)驗(yàn)技術(shù)1一、NMR技術(shù)的起源與發(fā)展二、液體NMR譜儀的基本結(jié)構(gòu)和對(duì)樣品的要求三、NMR實(shí)驗(yàn)技術(shù)、方法、特點(diǎn)和選擇四、實(shí)驗(yàn)技術(shù)的新進(jìn)展及其應(yīng)用2核磁共振實(shí)驗(yàn)技術(shù)NMR技術(shù)的起源與發(fā)展（一）、核磁共振的起源1896年法國(guó)物理學(xué)家貝克勒爾發(fā)現(xiàn)，鈾和含鈾的礦物能夠發(fā)出看不見(jiàn)的射線，這種射線可以穿透黑紙使照相底片感光。1921年斯特恩－革拉赫實(shí)驗(yàn)（德國(guó)，銀原子），并通過(guò)它觀測(cè)到十分微弱的核磁矩。證實(shí)了原子在磁場(chǎng)中不能任意取向，原子磁矩在磁場(chǎng)中只能取2J+1個(gè)分立數(shù)值，J為總角動(dòng)量量子數(shù)。是第一次觀察到原子磁矩取向量子化的實(shí)驗(yàn)。1943年斯特恩NobelPrize物理。1924年奧地利學(xué)者Pauli提出了NMR的基本理論：原子核磁矩與自旋的概念。1937年拉瑟里尤(B.G.Lasarew)和舒伯尼科(L.W.Schubnikow)對(duì)固態(tài)氫開(kāi)展了研究，并用傳統(tǒng)的方法測(cè)出氫的核磁矩值，拉瑟里尤和舒伯尼科被認(rèn)為是最早發(fā)現(xiàn)核磁現(xiàn)象的人。1939年Isidor

IsaacRabi使氫分子先后通過(guò)不均勻磁場(chǎng)和均勻磁場(chǎng)，同時(shí)用一射頻信號(hào)照射均勻磁場(chǎng)中的分子束，在某一確定頻率處就會(huì)吸收射頻能量而發(fā)生細(xì)小但可測(cè)量的偏轉(zhuǎn)。核磁共振現(xiàn)象的首次觀察。1944年獲得NobelPrize物理。1946年斯坦福大學(xué)的布洛赫(FelixBloch)和哈佛大學(xué)的珀塞爾(EdwardPurcell)。在主磁場(chǎng)的垂直方向上對(duì)進(jìn)動(dòng)的原子核進(jìn)行激發(fā)可使其進(jìn)動(dòng)角度增大;停止激發(fā)后原子核又會(huì)恢復(fù)至激發(fā)前的狀態(tài)，并發(fā)射出與激發(fā)電磁波同頻率的射頻信號(hào)。這一現(xiàn)象被稱為核磁共振（技術(shù)的應(yīng)用）。1952年獲得NobelPrize物理學(xué)獎(jiǎng)。3NMR技術(shù)的起源與發(fā)展4（二）、現(xiàn)代核磁共振技術(shù)的發(fā)展1966年瑞士物理化學(xué)家RichardErnst研制出脈沖傅利葉技術(shù),大幅提高了靈敏度。脈沖傅利葉變換核磁共振譜、二維核磁共振譜。核磁譜學(xué)。1991年NobelPrize化學(xué)。2002瑞士科學(xué)家?guī)鞝柼?維特里希Wüthrich，多維NMR波譜學(xué)在測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的三維構(gòu)象。NobelPrize化學(xué)。2003年美國(guó)科學(xué)家Lauterbur和英國(guó)科學(xué)家Mansfield，磁共振成象(magneticresonanceimaging,MRI)技術(shù)領(lǐng)域的突破性成就,NobelPrize生理和醫(yī)學(xué)。5NMR技術(shù)的起源與發(fā)展（三）、核磁譜儀的發(fā)展1946-1952布洛赫便和珀塞爾一起研制出世界上第一臺(tái)核磁共振譜儀。1953年，第一臺(tái)商品譜儀問(wèn)世。美國(guó)Varian公司，30Hz,7000高斯，0.7特斯拉1964年，美國(guó)Varian公司，超導(dǎo)磁場(chǎng)核磁譜儀，200MHz,4.74特斯拉。1969年，美國(guó)Varian公司，第一臺(tái)傅里葉變換核磁譜儀，100MHz,2.35特斯拉。1977年，美國(guó)Damadian，第一臺(tái)人體核磁共振斷層成像儀（CT）1979年，德國(guó)Bruker公司，第一臺(tái)500MHz超導(dǎo)核磁譜儀。2000年，美國(guó)Varian公司，第一臺(tái)900MHz超導(dǎo)核磁譜儀。目前有8臺(tái)儀器：2臺(tái)600MHz、3臺(tái)500MHz、2臺(tái)400MHz、1臺(tái)300MHz(停用）。7NMR技術(shù)的起源與發(fā)展（三）、核磁譜儀的發(fā)展

從最初的NMR譜儀，經(jīng)歷了三次大的革命，不同類型的NMR波譜儀，可按不同的方式進(jìn)行分類：

1.按激發(fā)和接收方式可分為：連續(xù)波發(fā)射分時(shí)發(fā)射脈沖發(fā)射譜儀2.按磁體的性質(zhì)分為：永磁電磁超導(dǎo)磁體譜儀連續(xù)波永磁譜儀結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單操作，但由于靈敏度太低，80年代已淘汰了。70年代初發(fā)展了電磁體NMR譜儀使磁場(chǎng)強(qiáng)度一直加大，高時(shí)可達(dá)100兆，磁體重2.7噸，而且耗電量也很大。隨著超導(dǎo)技術(shù)、電子技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，脈沖傅里葉變換高分辨超導(dǎo)NMR儀在近二十年來(lái)發(fā)展很快。場(chǎng)強(qiáng)由88年的600兆，94年的750兆，98年的800兆至2000年10月900兆?，F(xiàn)在已有1000兆高場(chǎng)譜儀上市。8NMR技術(shù)的起源與發(fā)展（三）、核磁譜儀的發(fā)展從NMR實(shí)驗(yàn)技術(shù)看經(jīng)歷了四個(gè)過(guò)程:a、一維1H譜，連續(xù)波檢測(cè)小分子結(jié)構(gòu)。b、脈沖傅里葉變換實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)1H，13C和一些多核譜圖，如31P，15N等等（場(chǎng)強(qiáng)較高下完成）。c、二維、三維和多維譜的發(fā)展隨著超導(dǎo)磁體的引入，計(jì)算機(jī)及電子技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，使得二維和多維核磁共振技術(shù)在80年代末，90年代初發(fā)展很快，各種多脈沖實(shí)驗(yàn)層出不窮，NMR技術(shù)變得更完善，更多樣化和更具有針對(duì)性的分析研究樣品。d、梯度場(chǎng)的發(fā)展脈沖梯度場(chǎng)技術(shù)是90年代初用于NMR譜儀分析研究的，一經(jīng)應(yīng)用于NMR分析，其優(yōu)點(diǎn)很快的體現(xiàn)出來(lái)了，如利用梯度脈沖探頭可以在3分鐘之內(nèi)測(cè)試一個(gè)H-HCOSY。大家知道勻場(chǎng)是做好NMR譜圖的關(guān)鍵，也是每個(gè)NMR操作者的基本功，以前為了勻場(chǎng)有時(shí)需要幾十分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，現(xiàn)在只需40多秒。9NMR技術(shù)的起源與發(fā)展（四）、NMR技術(shù)的應(yīng)用迄今為止，比較完善的NMR技術(shù)廣泛的應(yīng)用于化學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)，藥理學(xué)，生物化學(xué)和藥物學(xué)等領(lǐng)域，應(yīng)用之廣是很難全面概括的，正因?yàn)槿绱耍?991年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院的NMR專家R.R.Ernst教授，這不僅是對(duì)Ernst教授為核磁共振的發(fā)展作出杰出貢獻(xiàn)的表彰，也是對(duì)核磁共振在化學(xué)領(lǐng)域和其它學(xué)科發(fā)揮重要作用的肯定。很少有一項(xiàng)技術(shù)多次獲得諾貝爾獎(jiǎng)，從該技術(shù)應(yīng)用分類，主要有以下幾類：a、醫(yī)學(xué)和醫(yī)學(xué)功能成像研究在醫(yī)院主要用于疾病的診斷（MRI）場(chǎng)強(qiáng)一般在100兆-200兆以內(nèi)。近年來(lái)，NMR成像的應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大，研究對(duì)象遍及人體，動(dòng)物、植物、礦物以及各種天然或人工合成材料，并逐漸形成了不同的分支學(xué)科，成像儀也逐漸發(fā)展成適合于不同用途和不同研究對(duì)象的各類專用成像系統(tǒng)，如功能成像所用場(chǎng)強(qiáng)最高的達(dá)到9個(gè)特斯拉(Ts)。b、固體NMR研究主要研究無(wú)機(jī)物、化工多聚物和高分子材料等方面的研究工作。c、液體核磁的應(yīng)用研究分子結(jié)構(gòu)和分子運(yùn)動(dòng)等現(xiàn)象，確定化合物結(jié)構(gòu)。藥物代謝產(chǎn)物和代謝組學(xué)的研究。10NMR技術(shù)的起源與發(fā)展

NMR發(fā)展的里程碑YearDevelopmentNature1970FTNMRInstrumental1975SuperconductingmagnetsInstrumental19802DNMRMethodological1985ProteinstructuredeterminationMethodological1990Isotopelabeling/multidimensionalNMRMethodological1990PulsedfieldgradientsInstrumental/Methodological1995NMRscreeningMethodological1997TROSYMethodological1998LC-NMR/LCMS-NMRInstrumental2000CryoprobesInstrumental11NMR技術(shù)的起源與發(fā)展三、核磁譜儀的發(fā)展

從儀器的種類上大致分為三類：1.液體核磁2.固體核磁3.核磁共振成像武漢牛津-中科二、液體NMR譜儀的基本結(jié)構(gòu)和對(duì)樣品的要求1314什么是核磁共振？電磁輻射躍遷及波譜技術(shù)波長(zhǎng)范圍電磁輻射光區(qū)光子能量/eV(電子伏)能級(jí)躍遷類型波譜技術(shù)高能輻射區(qū)10-4

~10-2nmγ射線區(qū)>2.5?105原子核內(nèi)部能級(jí)躍遷M?ssbauer10-2

~10

nmX射線區(qū)>2.5?105~1.2?102核內(nèi)層電子能級(jí)躍遷電子能譜中能輻射區(qū)100~400

nm紫外光區(qū)1.2?102~3.1核外層電子能級(jí)躍遷紫外光譜400~800nm可見(jiàn)光區(qū)3.1~1.7核外層電子能級(jí)躍遷可見(jiàn)光譜2.5~25μm紅外光區(qū)1.7~1.2?10-4分子振動(dòng)-轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)躍遷紅外光譜低能輻射區(qū)0.1~50cm微波區(qū)1.2?10-4~1.2?10-7電子自旋能級(jí)躍遷純轉(zhuǎn)動(dòng)光譜電子順磁共振譜50~500cm射頻區(qū)1.2?10-6~1.2?10-9核自旋能級(jí)躍遷核磁共振譜核磁實(shí)驗(yàn)室儀器的布局和注意事項(xiàng)16液體NMR譜儀的基本結(jié)構(gòu)液體核磁共振譜儀主要部件的功能19超導(dǎo)核磁共振譜儀磁體構(gòu)造Principlesofasuperconductingmagnet超導(dǎo)核磁共振譜儀磁體超導(dǎo)核磁共振譜儀磁體構(gòu)造不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下儀器分辨率的比較SensitivitiesDecasaccharid(zgpr,NS=64)800MHz600MHz400MHzSignal/Noiseratio(forH1(Man-4'))1680:11130:1594:1不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下儀器靈敏度的比較信噪比磁場(chǎng)強(qiáng)度與分辨率和靈敏度的關(guān)系分辨率核磁共振的基本原理：?E=γhB0/2π?E:原子核躍遷能量差；γ:旋磁比；h：普朗克常數(shù)；B0:磁場(chǎng)強(qiáng)度?E=h???=γB0/2πB0??,??同一質(zhì)子在不同頻率（400or600）的譜儀下有相同的化學(xué)位移化學(xué)位移δ(ppm)=?樣品－?TMS(TSP)(以Hz為單位

)/

B0（儀器的頻率,以Hz為單位）?樣品(400MHz)=δ樣品*B400MHz；?樣品(600MHz)=δ樣品*B600MHz?樣品(600MHz)>?樣品(400MHz),分辨率600MHz>V樣品400MHz,24？為什么磁場(chǎng)強(qiáng)度越強(qiáng)譜圖的分辨和靈敏度就越好1500Hz/300MHz=5ppm2000Hz/400MHz=5ppm2500Hz/500MHz=5ppm3000Hz/600MHz=5ppm儀器的兆周數(shù)譜儀的分辨率26磁場(chǎng)強(qiáng)度與分辨率和靈敏度的關(guān)系靈敏度核磁共振的基本原理：?E=γhB0

/2π?E:原子核躍遷能量差；γ:旋磁比；B0:磁場(chǎng)強(qiáng)度?E越大，原子核吸收和發(fā)射的能量就越大，特別是原子核自身發(fā)射的能量，其值越大檢測(cè)器越容易檢測(cè)到，因而靈敏度就越高。S/N∝m?γ3,m:原子核和數(shù)目（豐度）總之，磁體的磁場(chǎng)（B0）越強(qiáng)，NMR譜儀的分辨和靈敏度就越高。另外，γ越大的原子核其分辨和靈敏度也越高。例如：γ13C=6.728×107Rad?S-1?T-1γ1H=26.753×107Rad?S-1?T-1γ1H/γ13C≈4僅僅是γ，1H的靈敏度就是13C的43=64倍，同時(shí)1H的天然豐度是13C的100倍，因此1H的靈敏度是13C的6400倍，所以13C譜圖的獲得需要更長(zhǎng)時(shí)間的累加,1H幾分鐘。磁感應(yīng)的強(qiáng)度的表示方式是特斯拉T,or高斯Gs1Gs=10T；T:周期;Hz:頻率，1MHz=106Hz;T=1/Hz?H=γHB0/2π=26.753×107×B0/2×3.1427超導(dǎo)核磁共振譜儀磁體原子核基礎(chǔ)共振頻率?H（MHz）磁體強(qiáng)度B0（T）1H3007.041H4009.41H50011.71H60014.11H80018.8常見(jiàn)核磁共振譜儀器的分類（MHz）是以1H在不同磁體下的基礎(chǔ)共振頻率的兆周數(shù)進(jìn)行劃分的。？核磁共振譜儀是怎么劃分為300MHz、400MHz、500MHz、600MHz、800MHz的探頭

磁體的功能是產(chǎn)生一個(gè)恒定的磁場(chǎng)。探頭則置于靜磁場(chǎng)之中，用于激發(fā)檢測(cè)核并探測(cè)核磁共振信號(hào)。核磁共振技術(shù)的一個(gè)弱點(diǎn)就是其靈敏度最少比光譜低4個(gè)數(shù)量級(jí)，這主要是核磁共振的能量低，導(dǎo)致核磁場(chǎng)下上下兩個(gè)能級(jí)的布局?jǐn)?shù)差異過(guò)小所致（400兆核磁強(qiáng)度下上下兩個(gè)能級(jí)之間布居數(shù)（能量差）差為10萬(wàn)分之3）。提高檢測(cè)靈敏度一直是NMR所追求的目標(biāo)，磁場(chǎng)強(qiáng)度的增強(qiáng)是一個(gè)最有效的方法，?E=γhB0/2π。但是磁場(chǎng)強(qiáng)度增強(qiáng)的成本太高，因此相比之下，對(duì)探頭功能的開(kāi)發(fā)改造成為一個(gè)更加可行的方法。當(dāng)前市場(chǎng)上常見(jiàn)的探頭類型有雙核探頭,四核探頭,寬帶探頭,低頻探頭,低溫探頭,微量探頭,固體探頭,成像探頭等。通常一臺(tái)核磁共振波譜儀可以配備多個(gè)探頭，按照不同的測(cè)試目的,隨時(shí)進(jìn)行探頭更換。此外，根據(jù)雜核線圈和氫核線圈在探頭內(nèi)的位置不同，探頭還可以分為正向探頭（雜核在內(nèi)，碳譜靈敏度高）和反向探頭（氫核在內(nèi)，氫譜靈敏度高）。理論上,一臺(tái)核磁譜儀應(yīng)該同時(shí)配備正向與反向探頭,遇到進(jìn)行正向或反向?qū)嶒?yàn)時(shí)可以分別更換使用,從而得到最佳的檢測(cè)效果?，F(xiàn)在部分NMR生產(chǎn)商具有2合1探頭，其1H和13C靈敏度都很高。微量探頭：是超小型探頭,通過(guò)減少溶劑的體積而相應(yīng)增加樣品濃度，適用于樣品量小的情況，特別是適用于天然產(chǎn)物研究領(lǐng)域，1.7mm甚至1.0mm的超微量探頭技術(shù)也已經(jīng)漸漸成熟。

超低溫探頭：把低溫技術(shù)與先進(jìn)的射頻硬件設(shè)計(jì)結(jié)合起來(lái)，用低溫的氦氣來(lái)冷卻探頭檢測(cè)線圈到25K，前放電子線圈到70K附近，最大程度降低了檢測(cè)到的電子噪聲，探頭檢測(cè)靈敏度提高4倍以上。附加設(shè)備以及運(yùn)行時(shí)的花費(fèi)非常昂貴，一個(gè)探頭的價(jià)格可以購(gòu)買一臺(tái)普通的400兆液體核磁，同時(shí)一年的運(yùn)行維護(hù)費(fèi)不小于20萬(wàn)元人民幣。目前瑞士布魯克公司推出液氮冷卻低溫探頭，這樣也可以提高探頭氫的靈敏度2倍左右，雜核靈敏度2－3倍，同時(shí)購(gòu)買費(fèi)用和維護(hù)費(fèi)用也大為降低。目前這套低溫系統(tǒng)的報(bào)價(jià)在15萬(wàn)美元左右，一年的維護(hù)費(fèi)在10萬(wàn)人民幣左右。29超導(dǎo)核磁共振譜儀探頭的分類30HPPR

前放HPPR高性能前置功放HPPR是連接于Console和探頭之間，用于將射頻脈沖信號(hào)傳遞給探頭，其主要功能是放大樣品放射出的微弱信號(hào)。通常他被安置在磁體附近，以盡早的對(duì)接收的NMR信號(hào)進(jìn)行放大，減小信號(hào)在電纜中的衰減。32機(jī)柜機(jī)柜容納了現(xiàn)代NMR的大部分電子硬件：AQS（控制采樣系統(tǒng)）、VTU（溫控單元）、功放（激發(fā)樣品需要的振幅脈沖，包括選擇性功放，即質(zhì)子功放，專門用來(lái)放大1H或19F。還有寬帶功放，即X功放，放大雜核13C，31P）。機(jī)柜決定了NMR譜儀的品牌和型號(hào)。34機(jī)柜外圍輔助設(shè)施——供氣系統(tǒng)要求：提供的空氣溫度不能太高，必須除水作用：提供樣品的進(jìn)入和送出磁體冷卻探頭（發(fā)射線圈和勻場(chǎng)線圈）351、樣品要求人們往往把注意力集中在譜儀操作上，而忽視樣品準(zhǔn)備。作為樣品提供者來(lái)說(shuō)所關(guān)心的是得到一個(gè)信噪比好、分辨率高的譜圖。所以，花幾分鐘把樣品準(zhǔn)備好，可以節(jié)省幾小時(shí)的譜儀的操作時(shí)間，同樣，處理好的純樣品可以得到可靠，準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)（分離手段的應(yīng)用與純度非常重要）信息。樣品越純?cè)胶?無(wú)雜質(zhì)、水、溶劑和鹽）樣品量：5～15mg樣品能很好地溶于某種常用的有機(jī)溶劑常用氘代試劑：氯仿、丙酮、二甲基亞砜、甲醇、重水、吡啶樣品有足夠的穩(wěn)定性在采集1D、2D譜過(guò)程中不應(yīng)發(fā)生變化36液體核磁譜儀對(duì)測(cè)試樣品的要求1、樣品的要求與處理

①要得到高分辯的譜圖，樣品管必需清洗干凈、無(wú)殘留溶劑和雜質(zhì)，以免影響測(cè)試結(jié)果；溶液中絕不能有懸浮的灰塵和纖維，尤其是金屬。一般情況下用棉花和濾紙把樣品直接過(guò)濾到樣品管中。

Undissolvedmaterialcausinglossofmagnetic?eldhomogeneity過(guò)濾前過(guò)濾后②樣品溶劑的體積和樣品量的要求

樣品量的多少應(yīng)考慮：磁場(chǎng)強(qiáng)度；探頭種類；測(cè)試哪種譜；樣品純度；樣品分子量……2、氘代試劑的選擇

選擇溶劑首先要考慮溶解性；要避免溶劑峰遮蓋譜峰；含活潑氫溶劑妨礙樣品中活潑氫觀察，在無(wú)活潑氫有機(jī)溶劑中觀察活潑氫，再用D2O交換確證；樣品是否需要回收；氘代試劑的價(jià)格。的價(jià)格。

常用氘代溶劑化學(xué)位移值

43溶劑1H譜

峰型13C-譜

峰型

CDCL37.26

單峰77

三重峰

DMSO-d62.493.3（殘余水）五重峰39.5

七重峰

(CD3)2CO2.042.8（殘余水）

五重峰29.8206

七重峰

CD3OD3.254.78

五重峰49

七重峰

D2O4.8

單峰\

需加TSP-d4

C5D5N7.19;7.55;8.71

三個(gè)單峰149.9;135.5;123.5三重峰

C6D67.16

單峰128

單峰

CD2CL25.31.5

單峰53

單峰

CD3CN2.0

單峰1.3118.2

單峰

①

CDCL3：價(jià)格低廉，樣品易于回收，殘留的氯仿峰易于辨認(rèn)，最為常用；非質(zhì)子性溶劑，不適用含鹽類化合物。②DMSO:溶解力強(qiáng)，對(duì)雜環(huán)類、鹽類化合物均適用；黏度大，分辨率低；易吸水；難以回收。③CD3OD：極性溶劑，適用于鹽類尤其是極性化合物；易吸水；

-OH,-NH，-CONH2

信號(hào)交換掉。④C6D6:磁各向異性，會(huì)對(duì)樣品分子的不同部位產(chǎn)生不同的屏蔽作用。由此可以使樣品的1HNMR譜發(fā)生較大的變化，有時(shí)，可以使重疊的峰組分開(kāi)。當(dāng)用CDCl3做溶劑時(shí)，異丙基的兩個(gè)甲基以及另一個(gè)甲基的峰重疊非常嚴(yán)重，不能區(qū)分。如改用C6D6作溶劑，則三個(gè)甲基可以獲得較好的分離。⑤混合溶劑：重現(xiàn)性差，位移發(fā)生改變。CDCL3：7.26，隨著加入DMSO，可位移至8.38⑥同一化合物在不同氘代溶劑中化學(xué)位移不同HD2ODMSO-d6C5D5N3-a1.981.772.513-b1.911.572.3372.402.042.8412,13,141.49,1.55,1.761.37,1.42,1.611.77,1.94,2.36目的：是用來(lái)鎖場(chǎng)，保證測(cè)試樣品周圍的磁場(chǎng)不會(huì)由于其漂移或者受外界信號(hào)干擾而改變。在NMR實(shí)驗(yàn)中需要測(cè)定樣品放射出信號(hào)的頻率精確值，而這些信號(hào)的頻率由磁場(chǎng)的強(qiáng)度決定，?=γB0

/2π。如果場(chǎng)強(qiáng)改變，放射信號(hào)的頻率也跟著改變。因此，必須使磁場(chǎng)強(qiáng)度總是精確維持在相同的強(qiáng)度下，這被稱為鎖場(chǎng)。在HPPR中有一個(gè)單獨(dú)的模塊負(fù)責(zé)發(fā)射和接收鎖場(chǎng)信號(hào)，在特定的磁體中氘信號(hào)頻率的精確值是已知的，那么樣品中的氘原子放射出的信號(hào)的頻率就應(yīng)該也是相同的頻率，如果信號(hào)發(fā)生了偏差就說(shuō)明場(chǎng)強(qiáng)發(fā)生了改變（漂移），于是在磁體勻場(chǎng)系統(tǒng)中某個(gè)線圈中的電流就會(huì)發(fā)生改變，以糾正磁場(chǎng)的這種偏差，從而使場(chǎng)強(qiáng)回到正確數(shù)值。由于在這個(gè)過(guò)程中氘的信號(hào)頻率每秒鐘被測(cè)量上千次，從而保證場(chǎng)強(qiáng)保持不變。47溶劑的選擇？我們檢測(cè)的是樣品的1H核為什么要用氘代（2H）試劑48三、實(shí)驗(yàn)技術(shù)、方法、特點(diǎn)和選擇1.1核磁共振氫譜核磁共振氫譜的分析大體上可以分為以下三個(gè)步驟：①看峰的位置（即化學(xué)位移）和峰的面積（即氫原子數(shù)目）：應(yīng)用化學(xué)位移的知識(shí)，結(jié)合譜峰面積，可以確定（或大致確定）化合物中含氫官能團(tuán)的種類。②看峰的形狀（即各個(gè)峰的偶合裂分情況）：應(yīng)用n+1規(guī)律或二級(jí)偶合裂分的知識(shí)，可確定（或大致確定）分子中基團(tuán)和基團(tuán)間的相互關(guān)系，區(qū)分出自旋體系的種類。③計(jì)算偶合常數(shù)：應(yīng)用偶合常數(shù)的知識(shí)，可以確定分子的立體構(gòu)型等。1.213C-譜以單脈沖檢測(cè)高頻振蕩的13C信號(hào)，對(duì)1H質(zhì)子全去偶，得到碳譜。優(yōu)點(diǎn)：a、信息量大，碳原子構(gòu)成了有機(jī)化合物的骨架，掌握有關(guān)碳原子的信息在結(jié)構(gòu)鑒定中有重要意義，從這一角度看，碳譜的重要性大于氫譜。例如：六取代苯環(huán)、乙烯四取代飽和碳原子的取代等，從氫譜上是不能得到直接信息的。

b、分辨好。常見(jiàn)有機(jī)化合物氫譜的δ值很少超過(guò)10ppm，而碳譜的變化范圍可超過(guò)200ppm，由于碳譜的化學(xué)位移變化范圍比1H譜大十多倍，化合物結(jié)構(gòu)上的細(xì)微變化可望在碳譜上得到反映。這是氫譜不能比的。49三、實(shí)驗(yàn)技術(shù)、方法、特點(diǎn)和選擇1.213C-譜缺點(diǎn)：靈敏度小。自然界中的碳元素大部分是自旋比為零的12C（~98.9%），13C為1.1%，加上旋磁比只是1H的1/4。核的NMR信號(hào)強(qiáng)度有一公式可以反應(yīng)13C的靈敏度。S/N∝m?γ3,m:原子核和數(shù)目（豐度），γ是旋磁比。13C與1H比較。13C總的觀測(cè)靈敏度只有大約1H的1/6400，通常的實(shí)驗(yàn)條件下，若不進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的累加測(cè)定13C譜至少需要數(shù)十毫克樣品。但是隨著譜儀的進(jìn)步，靈敏度提高，用量減少，13C發(fā)揮越來(lái)越大的作用。檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)。13C譜通常記錄的是質(zhì)子去偶譜，把質(zhì)子偶合引起的多重線合并為一條線，加上NOE效應(yīng)可將靈敏度提高一個(gè)數(shù)量級(jí)，但丟失了所有C-H偶合信息。50三、實(shí)驗(yàn)技術(shù)、方法、特點(diǎn)和選擇5113C譜圖1.3DEPT實(shí)驗(yàn)（DistortionlessEnhancementbyPolarizationTransfer）為了得到既提高靈敏度又使強(qiáng)度不畸變的譜，發(fā)展了一種巧妙的極化傳遞方法，稱作DEPT方法。碳的多重線具有正常的強(qiáng)度比和理想的相位。在發(fā)展期能明顯減少由橫向馳豫而損失的磁化量。利用光譜編輯法能得到區(qū)分CH，CH2和CH3信號(hào)做DEPT譜，但這樣需要分別進(jìn)行三次測(cè)試（即45°，90°，135°）。不同雜化類型碳的1JCHSP3:125HZ,SP2:165HZ,SP:250HZ

1JCH=140Hz52三、實(shí)驗(yàn)技術(shù)、方法、特點(diǎn)和選擇1.4NOE差譜和NOESY1D譜測(cè)試NOE譜在研究分子中核或基團(tuán)空間排列的信息有著非常重要的地位。NOE是核的馳豫問(wèn)題，是結(jié)構(gòu)化學(xué)中一個(gè)很重要的物理現(xiàn)象。產(chǎn)生NOE原因是:由于兩個(gè)質(zhì)子(Ha,Hb)的空間位置很近，達(dá)到飽和的Hb通過(guò)橫向弛豫將能量傳給Ha，于是Ha吸收的能量增多，共振信號(hào)增大?？臻g距離相近是發(fā)生NOE效應(yīng)的充分條件，與兩核之間相隔的化學(xué)鍵數(shù)目無(wú)關(guān)。NOE的大小與兩核間距離的6次方成反比，一般超過(guò)5?就觀察不到了。因此，NOE對(duì)于研究空間結(jié)構(gòu)十分有用，是立體化學(xué)研究的重要手段。54三、實(shí)驗(yàn)技術(shù)、方法、特點(diǎn)和選擇1.4NOE差譜和NOESY1D譜

具體操作：當(dāng)以某種方式干擾一個(gè)躍遷譜線時(shí)，與此核有偶極一偶極作用的另一個(gè)核的躍遷譜線強(qiáng)度發(fā)生了變化，叫做NOE效應(yīng)。它不取決于標(biāo)量偶合是反映偶極間的直接磁性偶合作用。通過(guò)NOE的研究，人們可獲得偶極一偶極偶合信息，最終與核間距分子運(yùn)動(dòng)和分子的立體結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)。具體譜圖的實(shí)現(xiàn)為:

①作一個(gè)H譜②選擇照射點(diǎn)③選擇對(duì)照點(diǎn)④用程序進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間累加。注意：樣品的處理：除氣（氧氣）（通氮?dú)猓?，過(guò)濾，保持儀器穩(wěn)定性，勻場(chǎng)要好等。用整形脈沖也可進(jìn)行NOESY1D譜實(shí)驗(yàn)，靈敏度和選擇性比NOE差譜好。用途：立體空間結(jié)構(gòu)，構(gòu)型分析55三、實(shí)驗(yàn)技術(shù)、方法、特點(diǎn)和選擇NOESY1D譜inCDCl357NOESY1D譜inCDCl32、二維譜圖（2D-NMR）1971年比利時(shí)科學(xué)家J.Jeener首次提出二維譜的思路1974年-1975年，R.R.Ernst對(duì)二維核磁共振波譜從理論到實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了仔細(xì)的研究。1976年，R.R.Ernst用密度算符對(duì)2DNMR原理進(jìn)行了理論闡述。1976年以后，2D-NMR技術(shù)得到了非常迅速的發(fā)展。1979年，2D-NMR技術(shù)應(yīng)用與蛋白質(zhì)的研究，2D-NMR技術(shù)已經(jīng)成為研究復(fù)雜有機(jī)化合物和生物大分子不可缺少的工具。所有2DNMR實(shí)驗(yàn)可用以下術(shù)語(yǔ)描述：準(zhǔn)備期（D1）-發(fā)展期（t1）-混合期（τm）-檢測(cè)期（t2）準(zhǔn)備期是為了使磁化矢量達(dá)到適當(dāng)?shù)某跏紶顟B(tài)而設(shè)置的，接著在發(fā)展期控制磁化矢量的運(yùn)動(dòng)，然后在檢測(cè)期檢測(cè)信號(hào)，并反復(fù)循環(huán)累加，逐次改變t1增量，再反復(fù)累加，最后將所得數(shù)據(jù)S（t1t2）對(duì)t1和t2進(jìn)行FT變換，即可得到二維譜。58592DNMR譜基本可以分為兩大類：a、J-分解譜：發(fā)展期被π脈沖分裂開(kāi)，或叫“回波序列”?；瘜W(xué)位移（δ）在后半個(gè)發(fā)展期為進(jìn)動(dòng)，聚焦或有效翻轉(zhuǎn)，而只保留J偶合的進(jìn)動(dòng)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果是FID僅僅受J偶合調(diào)制。F2域?yàn)棣男畔?，F(xiàn)1域?yàn)镴偶合信息?，F(xiàn)一般不多用，除了進(jìn)行J值的研究。b、化學(xué)位移相關(guān)譜：發(fā)展期基本上用于與進(jìn)動(dòng)（常常同時(shí)伴有J偶合），混合期確定了要研究的相互作用的類型，即有相互作用（通過(guò)成鍵或空間）的自旋之間產(chǎn)生磁化轉(zhuǎn)移，來(lái)完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)。所有2DNMR都關(guān)連著一系列的正交檢波，脈沖序列和有關(guān)參數(shù)設(shè)置，在這里就不多描述了。下面介紹一下常見(jiàn)二維譜的特點(diǎn)和解決問(wèn)題。1、H-HCOSY（H-Hcorrelationspectroscopy）COSY譜是最重要的二維技術(shù)之一，由于發(fā)展早，也比較成熟，譜中二維座標(biāo)都表示1H的化學(xué)位移。COSY譜圖中有兩類譜峰，一類為對(duì)角峰，這是那些在t1和t2期間具有相同頻率的組分，第二脈沖期間沒(méi)有進(jìn)行磁化轉(zhuǎn)移，對(duì)角線呈現(xiàn)出正常的AX系統(tǒng)一維譜，這類峰代表化學(xué)位移。另一類是交叉峰，又分為兩類，靠近對(duì)角線的峰是同核多重峰的一部分，遠(yuǎn)離對(duì)角線的是具有共同偶合常數(shù)的不同種核的多重峰。特點(diǎn)：很容易識(shí)別1H與1H的偶合關(guān)系。但得不到具體偶合常數(shù)。通?？吹降氖恰皩?duì)稱”化操作譜，比較漂亮，要學(xué)會(huì)排除假峰。

2、Related

COSY譜

脈沖序列同COSY，主要是在90PW中引入D2的延遲時(shí)間，著重于遠(yuǎn)程偶合的檢測(cè)，靈敏度小，有可能檢測(cè)到4JH-H～5JH-H間的偶合（0.1～0.5Hz）。602DNMR61H-HCOSYRelatedCOSY623、相敏COSY（DQFCOSY）對(duì)復(fù)雜分子如三萜皂甙和多肽，多糖等化學(xué)結(jié)構(gòu)的COSY譜，對(duì)角線峰相位與交叉峰正好相差90度，為色散線形，所以普通COSY分辨很差，無(wú)法細(xì)分比較密的1H-1H相關(guān)峰。最常采用的雙量子濾波相敏COSY(DQFCOSY)大大改進(jìn)了相敏COSY譜，對(duì)角線峰和交叉峰均能調(diào)節(jié)到純吸收形。雙量子濾波使靈敏度降低二倍，t1噪音也較大，但通過(guò)溫控和長(zhǎng)時(shí)間累加。多肽，多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)確定主要是靠DQF-COSY來(lái)完成。4、TOCSY(TotalCorrelationSpectroscopY)orHOHAHA(HomonuclearHartman-HahnSpectroscopy)也稱H-H全相關(guān)譜TOCSY在解譜上與H-HCOSY沒(méi)有任何區(qū)別，沿對(duì)角峰對(duì)稱分布著質(zhì)子之間的相關(guān)信號(hào)。但不同在于，COSY的相關(guān)峰需要質(zhì)子間有直接的耦合作用，但TOCSY中的相干峰來(lái)源于接力相干轉(zhuǎn)移，簡(jiǎn)而言之在參數(shù)設(shè)置合適的情況下，TOCSY能比COSY反應(yīng)相隔更多鍵的質(zhì)子之間的關(guān)系，前提是這些質(zhì)子必須在同一自旋體系下。TOCSY譜就是通過(guò)特殊的脈沖序列，實(shí)現(xiàn)從一個(gè)氫核的譜峰出發(fā)，可以找到與它處于同一偶合體系的所有氫核的相關(guān)峰。6364DQCOSY65TOCSY66COSYTOCSY不同的混合時(shí)間給出不同接力程度的TOCSY譜當(dāng)混合時(shí)間很小時(shí)，TOCSY譜相當(dāng)于COSY譜67COSY、RLCOSY、TOCSY的聯(lián)系和區(qū)別TOCSYRLCOSYCOSY2DGradientTOCSY,混合時(shí)間10ms682DGradientTOCSY,混合時(shí)間20ms692DGradientTOCSY,混合時(shí)間50ms70COSY和TOCSY譜比較（1）COSY交叉峰中主動(dòng)偶合的磁化矢量是反相組分，小J偶合信息可能被抵消，而TOCSY實(shí)驗(yàn)的主動(dòng)偶合是同相組分，提高了小J偶合的檢測(cè)靈敏度。（2）TOCSY譜的特征是提供COSY和同核接力相干轉(zhuǎn)移信息，接力轉(zhuǎn)移步數(shù)由自旋鎖定混合脈沖長(zhǎng)度控制，因此，可以不同的τm參數(shù)得到不同偶合相關(guān)信息，在2D譜線橫截面等高圖上可以觀察到一個(gè)完整的自旋體系，簡(jiǎn)化譜線歸屬。71TOCSY1D725、NOESY實(shí)驗(yàn)（NuclearOverhauserEffectSpectroscopy二維NOE譜）NOE主要用來(lái)確定兩種質(zhì)子在分子立體空間結(jié)構(gòu)中是否距離相近。要求兩種質(zhì)子的空間距離小于5?.當(dāng)H-HCOSY解析遇到困難（如二面角為90°）時(shí)，NOESY?？商峁┯杏玫男畔?。NOE和空間因素有關(guān)系，和相隔的化學(xué)鍵數(shù)無(wú)關(guān)，所以在分析NOE譜圖時(shí)候，一定要能畫(huà)出結(jié)構(gòu)的立體構(gòu)型以便解析。對(duì)于混合時(shí)間的設(shè)定，mix是一個(gè)混合時(shí)間。生物大分子可以設(shè)置為100-200ms，也有的設(shè)置成300-500ms，小分子的要大一些.對(duì)于小分子其混合時(shí)間一般為0.75-1.25s。73NOESY用于多肽序列的歸屬746、ROESY實(shí)驗(yàn)(Rotating-framenuclearOverhauserEffectSpectroscopy旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系NOE譜）由于實(shí)驗(yàn)室坐標(biāo)系中的交叉弛豫速率在小分子為正，在大分子為負(fù)，在中間大小的分子如小肽接近零，因此小肽的NOE交叉峰非常弱乃至消失,這時(shí)可以用ROESY得到距離信息。75NOESY和ROESY的區(qū)別：ROESY是旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系的NOESY譜，都提供通過(guò)空間作用的核自旋相關(guān)信息，但兩者有區(qū)別：（1）NOESY和ROESY的交叉峰都取決于相關(guān)自旋間存在交叉馳豫，但NOE是縱向交叉馳豫（Longitudinalcrossrelaxation）而ROESY是橫向交叉馳豫（trasbversecrossrelaxation）。（2）檢測(cè)靈敏度的差異。NOE和ROE交叉峰強(qiáng)度與對(duì)角線峰強(qiáng)比值與相關(guān)時(shí)間τm有關(guān)。NOESY交叉峰在分子量大和小兩個(gè)極端，靈敏度很大。而ROESY交叉峰在不同分子量的分子中變化不大。NOESY

適合分子量

1000

以下,

或

3000

以上的化合物，ROESY

適合分子量

1000-3000

之間的化合物。（3）NOESY相關(guān)峰為反相組分，而ROESY相關(guān)峰為同相組分，可以檢測(cè)小的相互作用。有相信號(hào)點(diǎn)(交叉峰)距離對(duì)角峰近的可以考慮使用ROESY。（4）對(duì)較復(fù)雜的化合物，其分子旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間與譜儀的角拉莫頻率之積接近或達(dá)到1，此時(shí)NOESY強(qiáng)度接近0，此時(shí)改用ROESY可得到更多的NOESY信號(hào)。但此方法易產(chǎn)生假信號(hào)，需注意鑒別。76NOESY和COSY的區(qū)別？777、C-HHETCOR（HeteronuclearcorrelationSpectroscopy），HMQC（heteronuclearmultiplequantumcorrelationspectroscopy）和HSQC(HeteronuclearSingleQuantumCoherence實(shí)驗(yàn)。是基本異核位移相關(guān)實(shí)驗(yàn)，同COSY圖譜一樣，很重要，在解決結(jié)構(gòu)問(wèn)題時(shí)，首先要考慮的實(shí)驗(yàn)。C-H相關(guān)譜能提供C與H的化學(xué)位移相關(guān)信息（1JC-H）在做C-H相關(guān)譜時(shí)，首先考慮1H，13C譜數(shù)據(jù)，不能解決問(wèn)題時(shí)再考慮做C-H相關(guān)譜。缺點(diǎn)是靈敏度太低。傳統(tǒng)的異核相關(guān)譜都是激發(fā)13C核觀察同1H核的關(guān)系，由于13C靈敏度低，要求樣品量大，特別是遠(yuǎn)程相關(guān)譜有各種因素的干擾，難以取得滿意的結(jié)果。80年代末發(fā)展了1H檢測(cè)的異核相關(guān)譜，又稱反轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)（Reverse或Inverse）質(zhì)子的極化轉(zhuǎn)移使異核位移相關(guān)實(shí)驗(yàn)比常規(guī)的異核F1觀察靈敏得多。見(jiàn)比較圖。實(shí)現(xiàn)此種實(shí)驗(yàn)需要硬件和軟件的支持，如a、反相探頭，1H線圈在內(nèi)，13C線圈在外，b、濾波器，c、軟件、反轉(zhuǎn)極化轉(zhuǎn)板脈沖序列，當(dāng)前的譜儀都可以做到。Inverse實(shí)驗(yàn)是通過(guò)極化轉(zhuǎn)移和多量子濾波通過(guò)1H檢測(cè)間接地得到X核與1H的關(guān)聯(lián)，它最突出的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，但也有列外，如對(duì)一些質(zhì)子峰強(qiáng)度差太大的化合物就不實(shí)用。7879C-HHETCOR80HMQC8、COLOC譜和HMBC實(shí)驗(yàn)（correlationVialong-rangecouplingsandheteronuclearmultiplebondcorrelationspectroscopy）遠(yuǎn)程化學(xué)位移相關(guān)譜提供兩健或大于兩鍵的C-H偶合信息。是建立C-C間關(guān)聯(lián)，甚至躍過(guò)氧，氮或其它原子的官能團(tuán)或者是片段關(guān)聯(lián)的有效方法。成為推導(dǎo)結(jié)構(gòu)，歸屬同碳質(zhì)子，確定1H取向等立體結(jié)構(gòu)分析以及解決那些由屏敝效應(yīng)難以解釋的季碳?xì)w屬問(wèn)題的強(qiáng)有力工具。同C-H相關(guān)一樣，COLOC的缺點(diǎn)是：①1JC-H峰得不到有效的壓制；②靈敏度通常用樣量20～30mg，累加14-18小時(shí)。HMBC實(shí)驗(yàn)可以完全解決以上缺點(diǎn)?，F(xiàn)在已經(jīng)淘汰了COLOC實(shí)驗(yàn)方法。81擴(kuò)散序譜是一種利用脈沖梯度場(chǎng)核磁共振對(duì)溶液中具有不同擴(kuò)散系數(shù)(D)的成分進(jìn)行虛擬分離的一種核磁共振技術(shù)。其根據(jù)的基本原則是Stokes-Einstein公式:D=KT/6πηrsk為波耳茲曼常數(shù)，T為溫度，η為溶劑粘度，rs為溶質(zhì)分子的熱力學(xué)半徑。這種方法可以用于：混合物分析、藥物活性篩選、絡(luò)合平衡研究和NMR信號(hào)編輯等方面。AngewChemIntEd.2005,44,520-554。829、擴(kuò)散序譜(DiffusionOrderedSpectroscopy,DOSY)DOSY831D1HSpectraand2DDOSY

ofamixtureofthreeaminoacid1Dspectraextractedfromthe2DDOSYspectrumHSQC-TOCSY當(dāng)我們還在為TOCSY的接力傳遞贊嘆不已時(shí)，一種被稱為HSQC-TOCSY的二維實(shí)驗(yàn)已然將這一系列又推進(jìn)了一步。與TOCSY相比，HSQC-TOCSY能夠在C的維度將原先重疊的信號(hào)分開(kāi)(相較于H,C的譜寬范圍很大)，在應(yīng)對(duì)大分子化合物時(shí)，這一技術(shù)有著相當(dāng)實(shí)用的功效。圖中與C直接相連的H經(jīng)過(guò)TOCSY接力傳遞，將整個(gè)自旋體系內(nèi)的質(zhì)子與C關(guān)聯(lián)了起來(lái)。而這一傳遞被沒(méi)有與H相連的C及雜原子(N)所阻斷。84TOCSY中H2與H10,H11的遠(yuǎn)程耦合由于后者化學(xué)位移的相近而無(wú)法區(qū)分，但在HSQC-TOCSY中C10與C11在碳譜上完全分開(kāi)，使得相應(yīng)的信號(hào)不再重疊而變得清晰可辨。在應(yīng)對(duì)復(fù)雜結(jié)構(gòu)的化合物時(shí)，這一技術(shù)會(huì)顯得更為重要。85需要注意的是，HSQC-TOCSY實(shí)驗(yàn)中除了TOCSY信號(hào)外，HSQC信號(hào)以及少量的HMBC信號(hào)會(huì)干擾譜圖的解析。為了排除這部分的干擾，需要結(jié)合HSQC實(shí)驗(yàn)做出判斷。86當(dāng)混合時(shí)間（Mixingtime）很短時(shí)，HSQC－TOCSY譜就相當(dāng)于HSQC－COSY譜C-H偶合實(shí)驗(yàn)

JHMBC與HSQC-HECADE為解決部分化合物結(jié)構(gòu)的絕對(duì)構(gòu)型問(wèn)題，新建立了能夠反映C-H偶合信息的實(shí)驗(yàn)：J-HMBC與HSQC-HECADE實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)夠給出C-H多鍵偶合常數(shù)的信息，這一實(shí)驗(yàn)在判定結(jié)構(gòu)(如順?lè)串悩?gòu)的C-H偶合值差別較大)及優(yōu)化HMBC參數(shù)方面有著重要的作用。J2BC的譜圖與HMBC有相似的地方，但不同在于原先在HMBC上的C-H相關(guān)點(diǎn)沿碳維裂分成了兩個(gè)，兩點(diǎn)間的距離除以放大因子即為CH遠(yuǎn)程偶合常數(shù)。該偶合常數(shù)的大小通過(guò)與文獻(xiàn)中報(bào)道的絕對(duì)構(gòu)型數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，從而確定化合物的絕對(duì)構(gòu)型。

HSQC-HECADEJ-HMBC13C-13CCOSY相關(guān)實(shí)驗(yàn)由于13C-13CCOSY相關(guān)實(shí)驗(yàn)對(duì)核磁譜儀的13C靈敏度要求較高長(zhǎng)期以來(lái)核磁室沒(méi)有對(duì)該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行開(kāi)發(fā)。目前，600兆的核磁譜儀配備了液氦低溫探頭極大地提高了13C檢測(cè)靈敏度，現(xiàn)已經(jīng)成功建立了該實(shí)驗(yàn)并完成了一新化合物的測(cè)試工作。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)可明確得到13C-13C的連接關(guān)系（其它核也可以如硅），從而確定有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)的最終形式。該實(shí)驗(yàn)譜圖的對(duì)角線方程是Ω1=2*Ω2，相關(guān)信號(hào)沿著這一對(duì)角線對(duì)稱分布——在本實(shí)驗(yàn)中直接相連的碳出現(xiàn)在同一橫行的紅色對(duì)角線兩邊四、實(shí)驗(yàn)技術(shù)的新進(jìn)展1、譜儀向高場(chǎng)發(fā)展核磁譜儀場(chǎng)強(qiáng)的不斷升高，從某種程度上增加了NMR的靈敏度和分辨率。如每隔幾年都有很大的變化87年有了600兆，90年～91年700兆，94年有了第一臺(tái)750兆，98年800兆，2000年10月第一臺(tái)900兆獲得NMR譜圖。912、實(shí)驗(yàn)方法的最新進(jìn)展由譜儀硬件的發(fā)展，用多通道譜儀可以成功的實(shí)現(xiàn)三維譜和C、H、N相關(guān)譜，使研究大分子的分子量做到10萬(wàn)以上。如感興趣可以查一下文獻(xiàn)。3、探頭的改進(jìn)探頭線圈材料的改進(jìn)提高了測(cè)試樣品的靈敏度，如反式H-X多核探頭，十多年前1H的信噪比為450：1，而現(xiàn)在的信噪比可達(dá)850：1以上，幾乎提高了一倍，從提高靈敏度設(shè)計(jì)為思路，近幾年來(lái)的Nano探頭和超低溫探頭發(fā)展最快。1）魔角旋轉(zhuǎn)探頭（Nano探頭）在固體中自旋之間的耦合較強(qiáng)，共振譜較寬，掩蓋了其他精細(xì)的譜線結(jié)構(gòu)，耦合能大小與核的相對(duì)位置在磁場(chǎng)中的取向有關(guān)，其因子是(3cos2β-1)，如果有一種方法使β=θ=54.440（魔角），則3cosβ-1=0，相互作用減小，達(dá)到了窄化譜線的目的。魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù)就是通過(guò)樣品的旋轉(zhuǎn)來(lái)達(dá)到減小線寬因子相互作用的，當(dāng)樣品高速旋轉(zhuǎn)時(shí)β與θ的差別就會(huì)平均掉。9293超微量探頭的結(jié)構(gòu)原理

NanoNMRProbe內(nèi)腔長(zhǎng)28mm，魔角（54.7°），轉(zhuǎn)速在1.5~2.0kHz之間，為保持長(zhǎng)期穩(wěn)定性，帶有2H鎖線圈，并有變溫功能，探頭種類有直接檢測(cè)用的1H和13C{1H}和間接檢測(cè)用的1H{13C}探頭，樣品體積最大為40μL，可取得線形好，靈敏度高和分辨率最佳的譜圖，若樣品量很少，溶劑量可相應(yīng)減少，保持樣品有一定濃度，溶劑雜質(zhì)及偽峰不會(huì)增加，還可提高動(dòng)態(tài)范圍，只要氘代試劑的量能保證場(chǎng)一頻聯(lián)鎖，即使樣品溶液體積未充滿整個(gè)樣品管（40μl），也不會(huì)使勻場(chǎng)變壞，或使譜線變寬，確保取得高質(zhì)量的譜圖。94NanoNMRProbe的應(yīng)用95微量樣品的測(cè)定比較樣品量不同的薄荷醇,分別為為40μg、4μg和400ng，溶于CD2CL2中,采樣次數(shù)分別為4次,400次和32240次

組合化學(xué)中的應(yīng)用組合化學(xué)是近二十年發(fā)展起來(lái)的一種快速合成與篩選大量化合物的新方法，其在發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化藥物先導(dǎo)化合物的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。組合化學(xué)包括了組合合成、群集篩選和對(duì)感興趣化合物結(jié)構(gòu)解析的三大步驟。因而有“平行”合成技術(shù)、“混-分”合成技術(shù)、編碼-解碼技術(shù)、“一珠一化合物”技術(shù)、“位置掃描”技術(shù)、天然寡聚物的生物組合合成及篩選技術(shù)、“動(dòng)態(tài)化學(xué)庫(kù)”技術(shù)、“多樣性”導(dǎo)向的組合合成技術(shù)、“Microarray”技術(shù)、組合配基裝配、“非天然”天然組合化學(xué)庫(kù)合成技術(shù)等等。在多種合成方法中，“一珠一化合物”技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)是化學(xué)庫(kù)的空間可分離性，亦即化學(xué)庫(kù)中所有的化合物同時(shí)并存且相互獨(dú)立，因而，這種樹(shù)脂珠-化學(xué)庫(kù)的方式可直接用于固相篩選法。96利用該技術(shù)在短時(shí)間內(nèi)迅速合成并篩選的化合物可以達(dá)到幾千萬(wàn)這樣的天文數(shù)字，大大加快了發(fā)現(xiàn)藥物先導(dǎo)化合物的步伐。但是在產(chǎn)物分析中，由于樹(shù)脂引起磁場(chǎng)的不均勻，常規(guī)的NMR技術(shù)受到了限制。較早的做法是將反應(yīng)的中間體或最終產(chǎn)物從樹(shù)脂上切落下來(lái)，再利用常規(guī)方法進(jìn)行分析和鑒定。這種方法費(fèi)時(shí)，費(fèi)樣，而且經(jīng)常破壞化合物的結(jié)構(gòu)，得出錯(cuò)誤的信息。九十年代初發(fā)展的高分辨魔角核磁共振技術(shù)(Highresolutionmagicanglespinning(HR/MAS)NMR)可以克服樹(shù)脂引起的磁場(chǎng)不均勻性,得到最高靈敏度和最小線寬的NMR譜圖。該技術(shù)不破壞樣品，可靈敏、直接地提供偶聯(lián)在樹(shù)脂上化合物的結(jié)構(gòu)信息。97

組合化學(xué)中的應(yīng)用頂部譜圖：用常規(guī)5mm液體高分辨探頭91．1mg干樹(shù)脂，掃描一次。中部譜圖：用常規(guī)5rnm固體CP／MAS探頭，樹(shù)脂樣品為20.2mg．轉(zhuǎn)速為3.8kHz，掃描8次底部譜圖：用Nano探頭，樹(shù)脂用量?jī)H為5.4mg，魔角轉(zhuǎn)速為2kHz，掃描8次98目前，廣泛用于監(jiān)測(cè)固相合成反應(yīng)；指導(dǎo)反應(yīng)條件的優(yōu)化;鑒定固載在單一樹(shù)脂珠上化合物的結(jié)構(gòu)；以及分析樹(shù)脂上固載化合物的構(gòu)象等等。高分辨魔角核磁共振是組合化學(xué)中有用的分析工具，可以跟蹤固相有機(jī)合成反應(yīng)，快速直接地提供連在樹(shù)脂上的化合物的結(jié)構(gòu)信息，指導(dǎo)反應(yīng)條件的優(yōu)化，它能直接簡(jiǎn)便地定量反應(yīng)的產(chǎn)率，而這種分析方法恰恰在常規(guī)NMR中難以實(shí)現(xiàn)。991002）3mm，1.7mm微量探頭原理是提高樣品濃度解決靈敏度問(wèn)題?？商岣哽`敏度2倍左右。3）超低溫探頭（液氦）利用高溫超導(dǎo)薄膜材料而制成的超導(dǎo)低溫探頭，當(dāng)樣品溫度由溫控單元維持時(shí)，采用閉環(huán)或開(kāi)環(huán)制冷系統(tǒng)使超導(dǎo)線圈冷到25K，消除了實(shí)驗(yàn)譜圖的電噪聲，提高了檢測(cè)靈敏度。是常規(guī)探頭的四倍。相對(duì)常規(guī)5mm探頭而言，其潛在靈敏度可以提高8～10倍。國(guó)內(nèi)已有此類探頭使用，500兆信噪比可達(dá)到3500：1?？蛇_(dá)到800兆水平。

101低溫探頭指標(biāo)：1024).液氮低溫探頭

CryoProbeProdigyDesign?Probe:“CryoProbe”?RFcoiltemperature~85K(insteadof25KfornormalCRP)?Preamptemperature~85K?Coolingwithliquidnitrogen?LN2supply:100Lper12days?LN2refill~15min103CryoProbeProdigyFeatures

BBOBB:31P…..15N[2H-stop]1H:tuneable19FS/Ngain15N-31P:factor~2to3(vs.RT)factor3(vs.OneNMRprobe)S/Ngain1H:factor~2(vs.RT)XObserve&Inversedetectioninfullautomation1044).液氮低溫探頭液相色4、液相色譜-核磁共振聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展HPLC特點(diǎn)：復(fù)雜混合物成分物質(zhì)分離、分析缺點(diǎn)：結(jié)構(gòu)信息十分有限NMR特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)分析缺點(diǎn)：?jiǎn)我怀煞郑?HPLCNMR實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜混合物成分的結(jié)構(gòu)分析體內(nèi)藥物代謝產(chǎn)物分析藥物質(zhì)量控制研究微生物代謝產(chǎn)物分析中草藥成分分析1）、LC-NMR發(fā)展概況HPLC和NMR聯(lián)用技術(shù)的研究開(kāi)始于70年代末，但是這種構(gòu)想在當(dāng)時(shí)沒(méi)有得到充分的發(fā)揮，主要有以下幾方面的限制：①、NMR譜儀靈敏度低；②、HPLC流動(dòng)相溶劑峰壓制效果差；③、流動(dòng)檢測(cè)池和探頭沒(méi)有商品化。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，存在的這些障礙逐漸得到克服和解決，LC-NMR聯(lián)用技術(shù)已取得了很大的突破，進(jìn)入90年代后，由于高場(chǎng)譜儀的發(fā)展與應(yīng)用，已為L(zhǎng)C-NMR聯(lián)用提供了有力的技術(shù)支持。使之在藥物化學(xué)、藥物代謝、組合化學(xué)等領(lǐng)域有很突出的表現(xiàn)。106技術(shù)特點(diǎn)在線獲得結(jié)構(gòu)信息（1H、1H-1H

COSY數(shù)據(jù)）液相流動(dòng)相是氘代溶劑不可濃縮靈敏度低樣品不可回收LC-NMR技術(shù)

工作形式Stop-flowContinuous-flowLoop-storage

2）、LC-NMR聯(lián)用系統(tǒng)結(jié)構(gòu)①、LC-NMR系統(tǒng)用于HPLC控制的計(jì)算機(jī)、進(jìn)樣器、泵、柱子和檢測(cè)器、LC-NMR探頭、流動(dòng)液池、NMR譜儀。②、LC-NMR配套技術(shù)整形脈沖、脈沖梯度場(chǎng)（整形脈沖壓溶劑峰、NMR梯度實(shí)驗(yàn)，梯度勻場(chǎng)）數(shù)字濾波技術(shù)和自動(dòng)化軟件，大容量工作站等。

1083）、LC-NMR的操作模式和技術(shù)到目前，應(yīng)用LC-NMR檢測(cè)有五種模式：連續(xù)流動(dòng)，停止流動(dòng)，分時(shí)止流，收集分析和選擇UV檢測(cè)激發(fā)NMR采樣的自動(dòng)檢測(cè)。

連續(xù)流動(dòng)：一般只適用于1H和19F測(cè)試。在洗脫過(guò)程中，溶劑組成不斷變化，給峰壓制造成一定的困難。一般先采用預(yù)實(shí)驗(yàn)，將不同時(shí)間出峰情況記錄好，有一定的分離條件后，再測(cè)一些感興趣峰的NMR譜。

停止流動(dòng)模式：即使溶液停留于檢測(cè)池中進(jìn)行測(cè)試，當(dāng)所需要組分的保留時(shí)間已知，或者HPLC-NMR采用靈敏的在線檢測(cè)器時(shí)，可以采用這種方法。在停止流動(dòng)的模式下，檢測(cè)NMR1H譜或二維譜。

收集分析：色譜洗脫峰被預(yù)先收集到每個(gè)樣品池中樣品收集品，然后進(jìn)行離線的NMR檢測(cè)。

分時(shí)止流：按一定的時(shí)間間隔暫停流動(dòng)相來(lái)檢測(cè)NMR譜。這種方法在被檢組分沒(méi)有UV發(fā)色