基于高分離度快速液相-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的四逆湯化學(xué)成分分析

基于高分離度快速液相-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的四逆湯化學(xué)成分分析

中醫(yī)與復(fù)方的多因素評價(jià)是中醫(yī)現(xiàn)代化研究的重要組成部分之一。傳統(tǒng)方法主要采用色譜分離技術(shù)從中分離提取出單一化學(xué)成分,然后通過核磁共振(NMR)、質(zhì)譜(MS)等其它分析技術(shù)進(jìn)行鑒定。這種方法通常需要經(jīng)過復(fù)雜的分離、提取過程,比較費(fèi)時(shí),并且是針對某一類化合物的鑒定,難以完整、系統(tǒng)地體現(xiàn)中藥復(fù)方中多類成分的復(fù)雜性。近年來,液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)為中藥化學(xué)成分的分析鑒別提供了簡便準(zhǔn)確可靠的方法。高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜是一種新興且發(fā)展迅速的質(zhì)譜技術(shù),其具有檢測靈敏度高,測定化合物質(zhì)荷比精確,離子掃描范圍寬等優(yōu)點(diǎn),現(xiàn)已越來越多的用于中藥分析中。四逆湯是東漢張仲景所創(chuàng)名方,始載于《傷寒論》,由附子、干姜、炙甘草組成,具有保護(hù)心肌、改善心功能、防止缺血-再灌注的損傷等功效,是治療冠心病心絞痛的常用藥。研究顯示,附子的活性成分主要包含烏頭堿和次烏頭堿等烏頭堿類化合物,干姜的活性成分主要是6-姜酚等姜辣素類成分,炙甘草的活性成分主要包含甘草酸等三萜皂苷類和甘草黃酮類成分。目前對四逆湯中化學(xué)成分分析已有少量文獻(xiàn)報(bào)道,均采用傳統(tǒng)的植物化學(xué)的方法進(jìn)行分離提取。另外,采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)不經(jīng)過色譜柱直接對四逆湯氯仿部位中的烏頭堿進(jìn)行分析,檢測到苯甲酰單酯型、雙酯型和脂類生物堿等二萜生物堿。顯然,這些方法難以系統(tǒng)地體現(xiàn)中藥復(fù)方中多類成分的復(fù)雜性。本研究采用RRLC-TOF/MS技術(shù)對四逆湯中多成分進(jìn)行了鑒別,該法操作簡便、快速、準(zhǔn)確,對闡明四逆湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量控制、開發(fā)現(xiàn)代中藥新藥等具有重要意義。1分析方法和試劑安捷倫1200型液相色譜儀,包括在線脫氣機(jī),二元泵,高性能自動進(jìn)樣器;安捷倫G6220A飛行時(shí)間質(zhì)譜儀,配有標(biāo)準(zhǔn)電噴霧離子源(ESI),MassHunter色譜工作站和QualitativeAnalysis質(zhì)譜分析軟件;R201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申勝生物技術(shù)有限公司)。HPLC級乙腈(Merck,Germany);HPLC級甲酸(Tedia,USA);無水乙醇為分析醇(中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司);水為娃哈哈純凈水。次烏頭堿、異甘草素、6-姜酚、甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品均購自中國生物制品檢定所。附子、干姜、炙甘草藥材購自上海德康大藥房,經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室孫蓮娜副教授鑒定。2測試2.1層析條件和質(zhì)量分析2.1.1梯度洗脫時(shí)間色譜柱:資生堂CAPCELLPAKC18(50mm×2.0mm,2μm),流動相:A0.1%甲酸水溶液,B乙腈;梯度洗脫:0~5min(5%B~15%B),5~10min(15%B~22%B),10~22min(22%B~30%B),22~35min(30%B~40%B),35~40min(40%B~60%B),40~43min(60%B~65%B),43~45min(65%B);柱溫25℃,進(jìn)樣體積1μL,流速0.25mL/min。2.1.2實(shí)時(shí)質(zhì)量數(shù)校正電噴霧正離子模式;質(zhì)量掃描范圍m/z100~1200;毛細(xì)管電壓4000V;霧化氣壓力30psi;干燥氣流速8L/min;干燥氣溫度350℃;碎片電壓220V。選擇參比校準(zhǔn)液做實(shí)時(shí)質(zhì)量數(shù)校正。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用QualitativeAnalysis軟件處理。測定樣品之前,使用調(diào)諧液校準(zhǔn)質(zhì)量軸,以保證質(zhì)量精度誤差小于2ppm。2.2多糖提取、純化按四逆湯處方比例稱取附子粉末0.3g、干姜粉末0.2g、炙甘草粉末0.3g,加水80mL煮沸90min,四層紗布濾去藥渣,濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至4mL,取0.5mL濃縮液加1mL無水乙醇沉淀多糖,10800r/min離心5min,上清80℃水浴下氮?dú)獯蹈?殘?jiān)?.5mL甲醇復(fù)溶,經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾,濾液在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣分析。2.3逆湯藥材成分信息根據(jù)四逆湯各組方藥材的化學(xué)成分研究報(bào)道,收集了烏頭堿類、二苯基庚烷類、姜辣素類、三萜皂苷類、黃酮類化學(xué)成分共313個(gè),并通過安捷倫“formula-database-generator”軟件建立四逆湯各組方藥材中已知化學(xué)成分的數(shù)據(jù)庫。3結(jié)果與討論3.1色譜條件的選擇首先考察了甲醇-水和乙腈-水兩種體系,結(jié)果顯示乙腈的洗脫效果要優(yōu)于甲醇,故選擇乙腈作為有機(jī)相。在流動相體系中加入甲酸可有效抑制皂苷類和黃酮類等酸性化合物的拖尾,并增加烏頭堿類成分的質(zhì)譜響應(yīng),實(shí)驗(yàn)考察了甲酸的添加量對分離的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲酸濃度在0.1%時(shí)已經(jīng)足夠抑制酸類物質(zhì)的拖尾情況,并且大多數(shù)成分有不錯(cuò)的質(zhì)譜響應(yīng)。因此,最終采用0.1%甲酸水溶液作為水相。質(zhì)譜檢測分別比較了正、負(fù)離子兩種掃描模式,結(jié)果發(fā)現(xiàn)正模式下峰容量更大、質(zhì)譜響應(yīng)更強(qiáng),故實(shí)驗(yàn)最終選擇在正模式下進(jìn)行。四逆湯提取液RRLC-TOF/MS總離子流圖見圖1。3.2tof/ms測序結(jié)果及分析應(yīng)用QualitativeAnalysis質(zhì)譜分析軟件計(jì)算可能的分子組成(誤差<3ppm),結(jié)合四逆湯化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫,對四逆湯樣品溶液所得色譜圖上色譜峰進(jìn)行分析,初步推測了34個(gè)成分的分子組成。其中峰20、22、27和28通過標(biāo)準(zhǔn)品無偏差的確認(rèn)為異甘草素、次烏頭堿、甘草酸和6-姜酚。結(jié)果如表1所示。從表1中TOF/MS所測得的精確分子量和計(jì)算所得的理論值比較結(jié)果可知,實(shí)驗(yàn)測得的分子量準(zhǔn)確可信(誤差均小于3ppm)。在數(shù)據(jù)匹配的基礎(chǔ)上,還利用了峰物質(zhì)特征的同位素分布進(jìn)行驗(yàn)證。以16號峰Benzoylmesaconitine和27號峰Glycyrrhizicacid為例,我們采用QualitativeAnalysis軟件的“同位素匹配功能”分別對這兩種化合物離子的同位素峰進(jìn)行匹配,匹配結(jié)果見圖2。從圖中可以看出,這兩種離子理論上計(jì)算的(由方框表示)同位素峰強(qiáng)度比、出峰位置與實(shí)際測得的(由框內(nèi)的峰表示)結(jié)果吻合良好,更進(jìn)一步說明推導(dǎo)結(jié)果的準(zhǔn)確可信。3.3rlrc-tof/ms定性分布實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)四逆湯中含有多組同分異構(gòu)體,本文用對照品鑒別區(qū)分了部分同分異構(gòu)體。其余同分異構(gòu)體采用ACD/ChemSketch軟件計(jì)算化合物的親水親油系數(shù)logP值判斷出峰順序。以2號峰SenbusineA與4號峰SenbusineB為例,在RRLC-TOF/MS總離子流圖中,提取m/z為424.23的離子,結(jié)果見圖3。4號峰(SenbusineB)的提取離子色譜圖采用ACD/ChemSketch軟件計(jì)算SenbusineA和SenbusineB的logP值分別為-1.46和-1.16,表明SenbusineB的疏水更強(qiáng),在反相色譜柱中的保留時(shí)間則越長,確定這兩個(gè)化合物的出峰順序?yàn)镾enbusineA先于SenbusineB出峰,從而對異構(gòu)體的色譜峰進(jìn)行相應(yīng)歸屬。3.4復(fù)方配伍甘草藥材本研究采用RRLC-TOF/MS分析方法,從四逆湯中鑒定出了15個(gè)烏頭堿類、3個(gè)姜辣素類和9個(gè)三萜皂苷類與7個(gè)黃酮類成分,分別歸屬于附子、干姜和炙甘草3種藥材,該鑒定結(jié)果與其復(fù)方配伍基本吻合?，F(xiàn)代藥理研究表明,烏頭堿類成分具有強(qiáng)心、抗心律失常、抗炎等作用;姜辣素類成分具有抵制血小板聚集、清除自由基和增強(qiáng)心肌收縮力等作用;三萜皂苷類和黃酮類成分具有抗氧化、抗病毒、抗心律失常和腎上腺皮質(zhì)激素樣等作用。這些活性成分配伍之后,相互協(xié)調(diào)、相互促進(jìn),在體內(nèi)發(fā)揮著協(xié)同藥效作用,可使