植物鉀吸收與轉運蛋白的關系

植物鉀吸收與轉運蛋白的關系

植物的長期發(fā)展通過改變k的濃度（1）來獲得k營養(yǎng)。尤其是Epstein等的開創(chuàng)性工作,他假定K+吸收可以用經典的酶動力學描述。并將K+吸收分為2個機制:機制Ⅰ指K+吸收服從Michaelis-Menten動力學,并在低外部K+濃度(0.001~0.2mmol/L)下起作用(高親和力);機制Ⅱ在高的外部K+濃度(1~10mmol/L,低親和力)。高親和力吸收為主動機制,因為吸收是逆K+電化學勢梯度,可能與K+∶H+或K+∶Na+的協同運輸相關,低親和力吸收為經由K+選擇性通道的被動運輸。K+運輸的生理學和生物物理學的研究極大地增加了我們對植物K+營養(yǎng)的理解。然而在一個復雜的器官中(如根)嘗試闡明單個K+運輸體的運輸機制卻有種種限制。隨著分子生物學理論與技術的發(fā)展,對編碼K+通道、相關亞基和高親和力轉運體的K+運輸基因的克隆和特性鑒定,給研究K+營養(yǎng)開創(chuàng)了一個嶄新領域。1k通道和低親和力k的吸收1.1離子通道與膜電壓K+內向通道K+in具有2項主要功能:1)為低親和力K+吸收提供一條途徑,吸收由H+泵建立的膜電壓驅動;2)調節(jié)膜傳導性和感受細胞內外K+濃度梯度而影響膜電壓的控制。Wegner等的研究認為,有2個外向離子通道負責木質部的裝載卸載及長距離信號。根的營養(yǎng)吸收在到達地上部前需要運輸到木質部。木質部薄壁細胞包含3個陽離子通道:KORC為K+外向整流通道;NORC為非選擇性外向整流陽離子通道;KIRC為K+內向整流通道。KORC調節(jié)K+從木質部薄壁細胞釋放到導管中;NORC除了作為鹽分釋放到木質部的通道外,還負責電信號和水信號的傳導;KIRC調節(jié)K+從木質部到周圍薄壁細胞的重新吸收。1.2植物k+通道基因迄今已從多種植物或同種植物的不同組織器官中分離到多種K+通道基因。它們具有不同的特性和作用。根和莖中皮層、根毛及木質部、韌皮部的K+通道特別與K+吸收運輸相關聯。植物中第一個鑒定的K+運輸基因為KAT1和AKT1。它們用來自擬南芥各種組織的cDNA庫,通過缺乏K+運輸體的酵母突變體功能互補的方法克隆得到。KAT1和AKT1cDNAs恢復了酵母突變體在低鉀(KAT1為200μmol/L)中生長的能力。KAT1基因編碼K+通道的功能也可以從KAT1在非洲爪蟾屬光滑卵母細胞上的表達得到證實。用KAT1的mRNA注射的卵母細胞表現出較大的內向K+電流。KAT1對K+具有高度的選擇性。對表達KAT1的酵母細胞的膜片鉗分析表明KAT1為超極化激活的內向K+通道。擬南芥中克隆的AKT1基因能夠彌補酵母突變體的K+運輸能力。AKT1編碼的蛋白運輸K+的能力也在轉移互補酵母到無鉀介質的試驗中得到證實。根中低親和力K+吸收被認為通過K+內向整流通道進行。通過膜片鉗分析和Km值判斷,在玉米和擬南芥的根皮層,小麥根表皮中有這類通道存在,使K+沿著一個方向向內的K+電化學勢梯度進入根內。KAT1被認為是提供一種低親和力K吸收進入保衛(wèi)細胞的途徑,因而在氣孔開放和關閉中伴演著重要角色。類似的K+通道基因KST1從馬鈴薯中克隆出來。KST1mRNA原位雜交表明其主要位于保衛(wèi)細胞,因此可能是KAT1在馬鈴薯中的一個功能性同源體。與KAT1不同,AKT1主要在根中表達,特別是在成熟根表皮、皮層和內皮層,這些部位有較大的K+內流發(fā)生。AKT1負責從土壤中通過頂端根細胞以低親和力方式吸收K+。實驗還表明,野生苗可從10μmol/L那樣稀的外部溶液中經由AKT1被動吸收K+。從擬南芥中分離出與先前識別的KAT1和AKT1基因高度同源的cDNA(AKT2)。AKT2在葉組織中而不是在根組織中高度表達。擬南芥中K+通道功能的多樣性可能是由于多個編碼K+通道的基因存在。LKT1從蕃茄根毛特化的cDNA庫中克隆出來RNA印跡分析表明,LKT1的mRNA在根毛中強烈表達。LKT1通道是AKT家族的一個成員。ZMK1和ZMK2是從玉米胚芽鞘中分離的K+通道基因。它們分別在皮層和脈管系統表達。兩者在卵母細胞中的表達表明,ZMK1通過外部酸化激活K+內向整流通道,而ZMK2依電壓獨立性及質子禁止性通道方式調節(jié)K+電流。AKT3為從擬南芥cDNA庫中分離出的K+通道基因,它主要在韌皮組織表達。用卵母細胞中的異源表達和電壓鉗分別研究其生理學功能和電特性,發(fā)現它只受膜勢的微弱調節(jié)。外部酸化通過減少單通道傳導性而減少了宏觀電流。AKT3通道可能參與了韌皮部裝載卸載過程中的K+運輸。通過RNA凝膠分析和PCR技術,從擬南芥中鑒定的2個基因AKT2和AKT3在源和庫的韌皮組織中均有存在。植物脅迫激素ABA能增加AKT2轉錄的數量,顯示AKT2對于干旱可能有某些反應。Buschmann等從K+饑餓的小麥(Triticumaestivum)根中分離出TaAKT1cDNA。具有與擬南芥AKT1氨基酸順序76%的相似性,并具有植物內向整流K+通道的結構特征。因為有5個錨蛋白重復序列是植物內向整流K+通道AKT子家族獨有的特征,所以稱小麥中這個基因為TaAKT1。K+饑餓誘導TaAKT1的表達增加,膜片鉗分析也表明K+饑餓的小麥根中K+in電流增加。因此,TaAKT1通道介導小麥根中誘導的K+內向電流。植物K+通道類型的差異表現在它們的電壓、Ca2+和pH依賴性方面。這些特性主要由通道孔區(qū)表現出來。Hoth將KST1(內向整流、酸性激活)與AKT3(弱電壓依賴性、質子阻塞)相拼接,AKT3的第216-287氨基酸與KST1的217-289氨基酸同源區(qū)相交換,結果所嫁接的基因對外部pH和Ca2+調節(jié)的電壓依賴性整流特性由孔區(qū)決定。Dietrich等研究了不同物種之間離子通道的差異,比較了馬鈴薯、煙草和大豆的保衛(wèi)細胞鉀離子通道陽離子選擇性和動力學。指出這些通道具有的共同特征包括電壓依賴性、選擇性和單通道傳導性;它們在超極化時激活。馬鈴薯中通道密度比其它2種高,但其激活和失活動力學較其它2種慢。在不同的單價陽離子之間,這些通道對K+具有高度的選擇性。外部Ca2+濃度≥1mmol/L時阻塞大豆保衛(wèi)細胞內向整流通道,但對于其它2種植物保衛(wèi)細胞離子通道只在Ca2+更高濃度和更負的膜勢才有影響。正如對于Ca2+敏感性的差異一樣,3個物種中的原生質體對于外部pH改變的反應也顯著不同。然而質子既不改變大豆中通道的開放頻率也不改變其動力學參數。另外2種中質子卻強烈影響電壓依賴性。這些方面的差異反映了氣孔特性方面的物種變異。這給在研究K+從土壤中吸收及體內運輸相關的K+通道方面的基因型差異以啟發(fā)。2高親和力旋轉體和高親和力k吸收機制2.1k+吸收轉運體高親和力K+吸收基因的克隆標志著植物K+營養(yǎng)研究的巨大突破。HKT1也通過酵母CY162菌株功能性互補克隆得到,所用材料為K+饑餓的小麥根中分離的cDNA庫。所推斷的氨基酸順序可預測一個58.9KD的蛋白,具有12個跨膜域。HKT1在酵母細胞中表達的K+吸收動力學表明它是一個高親和力轉運體。在非洲爪蟾屬卵母細胞中的異源表達表明,HKT1mRNA在外部存在K+時引起較大的內向電流。HKT1mRNA的定位表明,它均勻地分布在整個根皮層,它可能作為一個根原生質膜高親和力轉運體。HKT1也在莖和葉的維管組織中低豐度表達。Fairbairn從桉樹中分離出2個cDNAs,轉運體基因EcHKT1和EcHKT2,它們在葉、莖和根中表達。這些編碼K+轉運體的多肽與小麥HKT1同源,具有重要的生理學功能。擬南芥根毛的延長需要特殊的K+轉運。根毛在根部生毛細胞上突發(fā)后,尖端開始生長和出現極化的細胞質組織,TRH1調節(jié)擬南芥根中K+的運輸以及特化K+運輸,這種特化運輸對根毛延長是必需的。從擬南芥和大麥中又發(fā)現新的植物K+吸收轉運體基因家族ATKT、HAK1,AtKUP。ATKUP1和ATKUP2能夠補充K運輸缺陷的E.coli三倍突變體。充分表達AtKUP1的轉基因擬南芥懸浮細胞在外部微摩爾濃度時Rb+吸收增加,并具有一確定的Km,表明AtKUP1在體內表現一個高親和力鉀吸收行為。RNA凝膠印跡分析表明,AtKUP家族中各成員有獨特的表達方式,其中AtKUP3轉錄水平在K饑餓條件下受到強烈誘導。人們推測植物包含多個K轉運體執(zhí)行高親和力吸收,而AtKUP家族可能是重要成員,負責高和低親和力K營養(yǎng)并吸收進入各種類型植物細胞中。Fu稱AtKUP1為擬南芥中雙親和鉀離子轉運體。當從擬南芥中分離得到的功能性K+運輸體的cDNA在一酵母突變體中表達時,AtKUP1在低和高K+范圍都強烈地增加K+吸收能力。動力學分析表明,AtKUP1調節(jié)的K+吸收顯示“雙相”模式,類似于在植物根中觀察到的。從高親和階段到低親和的轉變發(fā)生在100~200μmol/L外部K+濃度點。AtKUP1調節(jié)的K+吸收被K+通道阻塞劑TEA、Cs+和Ba2+禁止。AtKUP1主要在根中表達,它可能從土壤中吸收K+。因此擬南芥根中AtKUP1基因產物可能在廣泛變化的土壤K+濃度情況下充當K+轉運體的角色。2.2植物高親水運輸的機制擬南芥高親和力K+吸收的力能學強烈地暗示這是一個逆著K+電化學勢梯度的主動過程。有人設想這種高親和力K+轉運體可能是類似于E.Coli中的K+-ATP酶。也許這個轉運體是一個由H+-ATP酶提供能量的K+∶H+協同運輸系統。但也可能以K+∶Na+共同轉運形式。Maathuis和Sanders運用膜片鉗分析研究擬南芥根原生質膜中高親和力鉀吸收機制,發(fā)現在0~400μmol/L內,K+吸收與ATP或Na+相耦合,外界pH降低刺激K+的吸收,顯示K+內流與質子運輸相關聯,K+運輸從質子電化學勢梯度中獲得能量,并認為K+∶H+運輸比率為1∶1。Schaehtman和Schroeder對酵母的研究認為HKT1調節(jié)86Rb+吸收的速率可通過降低外部pH(從8到6~7)而增加。這些結果與植物高親和力K+運輸以K+∶H+協同運輸的結論相吻合。然而Rubio等的研究認為高親和力轉運機制遠未解決。他認為HKT1調節(jié)的K+內流受微摩爾水平的Na+刺激。明顯的表現是在卵母細胞中HKT1在缺乏Na+時不能調節(jié)K+的吸收而且HKT1調節(jié)的運輸不受外部pH改變的影響。他認為HKT1以K+∶Na+協同運輸的形式參與K+的吸收。高親和K+吸收通過K+/Na+耦合機制獲得所需的能量在水藻中觀察到。通過有無Na+存在時Rb+流和K+電生理學運輸試驗,證明陸生植物K+的吸收與Na+不具有生理學相關性或者Na+禁止高親和K+吸收;然而在某些水生被子植物和水藻中這種第二運輸獲取能量機制起著重要作用。3k+運輸基因早期的K+吸收模型認為在微摩爾范圍K+濃度時,K+吸收進入根為協同運輸;高濃度即毫摩爾濃度時為通道運輸。這種兩段論模式容易使人誤解為低濃度下只有高親和力系統運作而高濃度時只有低親和系統運作。第二個方面是吸收動力學的飽和與線性組份之異議;第三個方面是復雜的吸收動力學是由一單一運輸體還是多個運輸體導致或者二者均有表現。在低親和力KAT1,AKT1和高親和力HKT1的K+運輸基因尚未克隆和定性之前,人們就普遍認為K+復雜的吸收動力學是由于植物中存在不同的K+轉運體。同時也有人認為復雜的K+吸收動力學也可能是改變一個單一的運輸體的性質所引起的。K+運輸基因的分子研究很難清楚地區(qū)分多個轉運體與單個轉運體吸收動力學。Chilcott等(1995)詳細地分析了非洲爪蟾屬卵母細胞中KAT1調節(jié)的K+運輸,表明通過一單個運輸蛋白能夠產生復雜的運輸動力學。此動力學過程可分解為一個可飽和的組分和一個線性一級組分。表達KAT1的酵母突變體CY162的單向K+(86Rb+)內流示蹤也產生了復雜的濃度依賴性K+運輸動力學。酵母中KAT1的K+內流動力學在高的K+濃度時并不很好地與Michaelis-Menten動力學參數相吻合,K+濃度超過1mmol/L時內流動力學也有線性組分。在根的研究中,確切的生理學證據表明可飽和組分和線性組分是由于不同的轉運體造成的。然而,InmaculadaGarrido等人所做的試驗并沒有觀察到任何線性組分的存在。2個K+運輸系統均可達到飽和,即2個系統均服從Michaelis-Menten飽和動力學。同時,試驗還豐富了經典的雙系統論。研究了從微摩爾到毫摩爾濃度外界K+情況下向日葵苗根K+吸收的時間歷程:當H+外排系統所創(chuàng)造的驅動力(△pHi,o)還不足以允許系統I和系統II正常運作時,沒有K+吸收;此后,當△pHi,o增加到一定值,高親和力系統I先開始運作,并且不依賴于外界K+濃度大小;當系統I達到最大速率進入飽和吸收并且外界K+濃度足夠滿足(一般認為在1mmol/L以上)系統II的運作時,系統II才開始,而且外界K+濃度越高開始得越早。當連續(xù)的H+外流造成pHo下降且△pHi,o增加,系統II也能在低于1mmol/L時吸收K+。因此,在任何外界K+濃度,2個系統要開始工作必須要先由H+外排系統建立的△pHi,o達到一定值。當外界K+濃度和△pHi,o能夠激勵系統II運作時,吸收是雙相可飽和模式。4k+運輸體基因雖然克隆得到了低親和力KAT1、AKT1、KST1、AKT2和高親和力HKT1的K+運輸體基因,但這些運輸體怎樣調節(jié)細胞K+水平卻不很清楚。4.1k-k吸收系統的調整4.1.1深度k+咀嚼和高親水的轉運蛋白合成K+對它本身的吸收行為表現為饑餓誘導和反饋抑制。K+饑餓時高親和力K+吸收系統會導致K+吸收進入根的K+增加。同時由于不斷增加的內部K+濃度所引起的反饋抑制也在植物和酵母中存在。對于大麥和玉米苗在低鉀濃度范圍(1~100μmol/L)的大量研究表明,一旦幼苗K+饑餓,吸收動力學參數(Km和Vmax)即改變。當生長在充足的K+條件下的大麥苗饑餓24h(短期),K+運輸Km立即減小4倍,表明高親和力K+運輸體對K+親和力增加。如果饑餓延長至7d(長期),K+吸收的Vmax漸增。短期K+饑餓使得高親和力系統的生化控制系統發(fā)揮作用,引起K+轉運體活性的增加;而在深度的K+饑餓下,會有更多的轉運蛋白合成,導致K+吸收Vmax的增加。幾乎沒有生理學證據支持短期K+饑餓期間有新的高親和力轉運體合成。首先因為K+饑餓引起的吸收反應似乎太快(在處理的22min內),其次是,吸收速率的增加在缺乏DNA、RNA或蛋白合成的情況下也會發(fā)生。在深度K+饑餓情況下轉運體的合成是可能的。Glass進一步闡明了根高親和力轉運系統控制K+水平的機制。他認為在大麥根中,隨著內部K+濃度的不斷增加,K+吸收的Km增加,而且這種向較低親和力系統遷移的趨勢表明K+轉運蛋白通過變構控制K+吸收。他的這一模型認為,隨細胞質K+增加,K+逐漸結合在K+轉運體的面向細胞質面的4個變構位點上,當所有4個位點都完全被K+占據時,引起構造改變,減少了轉運體對K+的親和力。Tie-BangWang等研究了控制K+供應給大麥和小麥根對于HKT1轉錄水平的影響。他觀察到在無K+介質中頭4h有HKT1表達的快速上調現象。并且根中HKT1表達的增加領先于根或莖中K+濃度可檢測的改變。Northernblots定量分析證實無K+后4hHKT1表達水平已增加到1.5~2倍。HKT1的表達直到12h還繼續(xù)增加,到24hHKT1mRNA的表達與12h峰值相比稍微下降。大麥HAK1cDNA在酵母中的表達和AtKUP1基因在擬南芥中的表達表明它們調節(jié)高親和力Rb+吸收。HAK1和AtKUP3mRNA水平也因K+供應的撤消而增加,顯示這些基因成員可在K+供應被剝奪時引起K+內流增加。高親和力轉運系統在微摩爾范圍內K+吸收有明顯的Km值,而且高親和力K+吸收速率對植物K+狀態(tài)極為敏感,當根中K+含量增加時,K+吸收的Vmax值下降而Km值增加。相反,當外部K+供應受到干擾時,高親和K+吸收快速上調。高親和力K+吸收在分子水平的明顯的復雜性,使得研究各個運輸因子受K+誘導的時間歷程顯得非常重要。以便確定植物不同時間和發(fā)育階段各個基因的相對重要性。4.1.2k+通道活性對植物光合過程的調節(jié)有人認為低親和力轉運系統似乎對植物K+狀態(tài)不甚敏感。低親和力系統在大麥、黑麥草和玉米中對K+狀態(tài)不敏感,在向日葵和擬南芥中K+吸收和K+通道活性因K+饑餓而輕微增加。在油菜中,供應不同濃度K+時,AKT1基因有明顯的高水平表達,當撤去K+時沒有改變AKT1的表達水平。AKT1在油菜中可能是結構性地表達。Maathuis和Sanders研究了擬南芥根中低親和力單通道活性,K+從高到低的改變導致內向整流通道活性的增加。進一步的試驗發(fā)現,無論短期或長期K+饑餓,AKT1基因的表達都沒有增加。也就是說,因應K+濃度的改變,是通道活性而不是基因表達受到調節(jié)。植物K+通道活性調節(jié)的分子機制可由哺乳動物K+通道β亞基的克隆得到啟示,即K+通道β亞基可以通過阻塞通道孔而引起通道失活。從植物中克隆到的β亞基同源體暗示這種哺乳動物中發(fā)生的通道調節(jié)方式也可能發(fā)生在植物中。油菜中的AKT1基因水平未受外部K+濃度的影響,使人認為AKT1是一個K+吸收的結構性組分。但是,K+饑餓的小麥苗中時間依賴性內向整流K+通道電流的數值和發(fā)生頻率增加,原因是K+從介質中撤去后根中編碼K+通道的TaAKT1mRNA水平上調,TaAKT1表達增加。AKT1在酵母中的表達及在擬南芥根中的自然表達已證明,AKT1能調節(jié)微摩爾范圍的高親和力K+吸收,這些和小麥根中TaAKT1mRNA及K+in的饑餓誘導都說明K+in通道有可能既是結構性的也是可誘導的。4.2植物k+通道活性的調節(jié)水脅迫并不顯著影響玉米根皮層的內向或外向整流K+傳導性。但水脅迫顯著減少了根中柱細胞的外向電流而對內向電流很少影響。水脅迫導致的進入中柱的K+減少表明K+通道活性的調整是對水脅迫時能夠在干旱土壤中生存的一種重要的適應方式。因為K+在根中的積累能維持水勢,有利于水的吸收和根生長所需的細胞膨壓。ABA可以2種方式調節(jié)K+通道:1)通道表達或(和)通道蛋白整合入原生質膜;2)調節(jié)通道活性。ABA也減少根中柱細胞外向電流。因此植物適應環(huán)境脅迫機制中,K+通道的調節(jié)或許是物質傳導和信號傳導調節(jié)的重要途徑。其它激素、光和化學物質如Al3+、Ca2+都可以不同方式調節(jié)K+通道。YongweiCao等研究了表達水平導致的K+通道KAT1的調整。他提出幾個假定來解釋K+通道不同表達水平帶來的生物物理特性的差異。過分表達使得轉錄后修飾反應如RNA編輯、磷酸化、通道-通道反應達到飽和。ATP和其它細胞因子調節(jié)KAT1激活。通道分子可以在高聚集密度下相互作用。通道的群生在原生質膜上形成一個極性位點,這種極性位點在植物運輸過程中是需要的。KAT1可能發(fā)生轉錄后修飾或顯著的結構改變,即使較小的結構改變也能夠較大地影響植物K+通道的單通道傳導性參數。研究短期和長期KAT1、AKT1及HKT1等基因表達的調節(jié)和K+運輸活性,弄清調節(jié)K+吸收的變構模型,從植物中克隆β亞基等工作為我們研究K+通道活性的的調節(jié)打開了新視野。有助于理解K+通道和高親和力K+運輸體在K+獲取和植物營養(yǎng)中的作用。5跨原生質膜的k-s-pcr特性植物原生質膜質子泵ATP酶(H+-ATP酶)通過從細胞中泵出質子,因而創(chuàng)造一個跨原生質膜的pH差和電勢差。第二運載體則依賴這種由H+-ATP酶創(chuàng)建的質子驅動力。5.1第4種是活性植物原生質膜的k+-atp酶直接運輸和轉化作用較早所研究的原生質膜H+-ATP酶的一個關鍵特性就是K+的特殊刺激。因此這個酶被稱為“K+-刺激的ATP酶”,早期研究認為K+的刺激反映酶對陽離子的實際運輸。ATP酶活性的K+刺激表明它與K+吸收有某些相關。在大麥、小麥、燕麥和玉米的一項研究中,膜組分中ATP酶活性的K+刺激與K+吸收進入其根的速率相關。燕麥和玉米的研究還表明,原生質膜ATP酶活性的K+刺激的復雜動力學過程與K+吸收進入根組織的動力學過程相似。植物原生質膜H+-ATP酶的反應機制動力學研究表明,K+刺激ATP水解活性可能與2個單獨反應步驟有關。K+加速了E1P(酶的磷酸化形式)到E2P的轉化及無機磷Pi從E2P中的釋放。ATP酶水解活性的K+刺激與K+運輸關系及K+在酶反應機制中的作用使人認為:K+是被植物原生質膜H+-ATP酶直接運輸,類似于動物細胞胃液H+,K+-ATP酶;并認為K+將與質子相交換,從細胞外到細胞質,而且這個運輸過程將與K+對Pi的釋放和E1P到E2P的轉化相結合。然而,原生質膜H+-ATP酶充當H+/K+交換泵的概念被其它的觀察所質疑。ATP水解活性的鉀離子刺激與動物細胞中直接運輸此離子的ATP酶相比時顯得相對微弱。原生質膜H+-ATP酶的活性或質子轉運不需要鉀的必須參與。因此Donald等認為,植物原生質膜H+-ATP酶只充當基本的質子泵,而所觀察到的K+對于酶的反應表示這個陽離子作為一種效應劑在起作用。用原位含H+-ATP酶的膜囊泡很難區(qū)分K+的刺激是直接的還是間接的。非直接刺激來自2方面:K+通道和H+/K+運輸體因運輸K+而消耗膜勢和pH梯度,從而刺激H+-ATP酶;由于K+的屏蔽作用,減少了膜上負電荷與陰離子Mg-ATP之間的靜電斥力,導致酶活性增加。然而在控制條件下,在純化的H+-ATPase制劑中能觀察到K+的直接刺激。Shu-ITu等研究玉米根液泡膜和原生質膜質子運輸H+-ATPase催化ATP水解和質子運輸的耦合情況。結果表明,ATP水解與H+運輸并非直接耦聯:1)酶催化的ATP水解與H+運輸的溫度反應不同。在10℃至45℃,2種酶均增加ATP水解的速率,然而質子運輸在20℃至30℃時保持恒定,至40℃時探測不到質子運輸;2)原生質膜H+-ATP酶催化的ATP水解受釩酸鹽抑制劑的影響遠大于質子運輸所受的影響。液泡膜H+-ATP酶介導的質子運輸對硝酸鹽的敏感性比ATP水解對硝酸鹽的敏感性大得多,在某硝酸鹽濃度質子運輸受抑制80%而ATP水解幾乎不受影響。5.2h+-atp酶和k+的非直接激活InmaculadaGarrido等對向日葵苗的根研究從以下幾個方面證實H+外排系統與K+吸收系統并非直接耦合:1)在微摩爾到毫摩爾濃度K+范圍,H+外流量相似,而K+吸收動力學曲線卻有大的改變。表明H+外排系統和K+吸收系統并非直接耦合;2)K+吸收在各濃度都表現延遲H+外排60min;3)纈氨霉素和DCCD對這2個系統的影響也證實二者非直接耦聯。纈氨霉素為K+載體,它引起的大量突然的K+外流并沒導致H+外流的立刻改變,DCCD抑制原生質膜H+-ATP酶的H+運輸,它對H+外流的抑制并沒有造成K+內流的突然停止。關于H+-ATP酶和K+的關系,曾經提出幾個假設:1)K+能夠直接由原生質膜H+-ATP酶本身運輸,類似動物細胞中H+,K+-ATP酶;2)H+-ATP酶為K+運輸提供驅動力,這是通過其它載體的第二運輸過程,其中H+-ATP酶保持活性或其介導的H+運輸顯然并不需要K+的存在;3)K+通過與H+-ATP酶密切相關的特殊通道運輸。人們傾向認為上述2)和3)可能為正確途徑。運輸方式依賴于外部K+濃度。H+-ATP酶水解ATP與運輸質子的非直接耦聯以及H+外排與K+內流的非直接耦聯,表明H+-ATP酶對于K+吸收的影響是間接的。研究證明,原生質膜H+-ATP酶沒有通過使ATP水解與K+吸收化學上直接聯系起來。這個酶給細胞通過第二機制吸收K+提供了驅動力,如K+通道、H+/K+協同運輸體。但通過其它ATP酶的直接的K+運輸(如K+