基因工程原理與技術(shù)（第四版）課件 第7、10章 酵母基因工程2X、基因工程相關(guān)技術(shù)

第七章

酵母基因工程第二節(jié)常見的酵母基因表達(dá)系統(tǒng)本章內(nèi)容第一節(jié)酵母基因工程表達(dá)體系第四節(jié)酵母基因工程應(yīng)用舉例---利用重組酵母

生產(chǎn)乙肝疫苗第三節(jié)影響外源基因表達(dá)的因素酵母菌的分類學(xué)特征

酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無性繁殖的單細(xì)胞真核生物，分屬于子囊菌綱、擔(dān)子菌綱、半知菌類，共由56個(gè)屬和500多個(gè)種組成。酵母菌是比較成熟的真核生物表達(dá)系統(tǒng)。第一節(jié)酵母基因表達(dá)體系----宿主系統(tǒng)作為宿主細(xì)胞的酵母需滿足的基本要求①安全無毒，沒有致病性。②遺傳背景清楚，容易進(jìn)行遺傳操作。③外源DNA容易導(dǎo)入宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化效率高。④培養(yǎng)條件簡單，容易進(jìn)行高密度發(fā)酵。⑤有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌能力。⑥有類似高等真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾加工能力。酵母菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢全基因組測序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡便能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中具有原核細(xì)菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡單、成本低廉不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，美國FDA認(rèn)定為安全的基因工程受體系統(tǒng)酵母菌是最簡單的真核模式生物常用的酵母宿主菌目前已廣泛用于外源基因表達(dá)和研究的酵母菌包括：釀酒酵母屬如釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）克魯維酵亞母屬如乳酸克魯維酵母（Kluyveromyceslactis）畢赤酵母屬如巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）裂殖酵母屬如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）其中釀酒酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究最為詳盡，但巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因最理想。

假絲酵母屬產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇

釀酒酵母的基因表達(dá)系統(tǒng)最為成熟，包括轉(zhuǎn)錄活性較高的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脫氫釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)酶基因ADH所屬的啟動(dòng)子，多種重組外源蛋白獲得成功表達(dá)。

釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的最大問題在于其超糖基化能力，往往使得有些重組蛋白（如人血清白蛋白等）與受體細(xì)胞緊密結(jié)合，而不能大量分泌。這一缺陷可用非釀酒酵母型的表達(dá)系統(tǒng)來彌補(bǔ)。

乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒pKD1已被廣泛用作重組異源蛋白生產(chǎn)的高效表達(dá)穩(wěn)定性載體，即便在無選擇壓力的條件下，也乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)能穩(wěn)定遺傳40代以上。

乳酸克魯維酵母表達(dá)分泌型和非分泌型的重組蛋白，性能均優(yōu)于釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)?！笆濉逼胀ǜ叩冉逃龂壹?jí)規(guī)劃教材

巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)菌，能在甲醇培養(yǎng)基中生巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)長，甲醇可高效誘導(dǎo)甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達(dá)。表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)勢：生長迅速、強(qiáng)啟動(dòng)子（乙醇氧化酶基因AOX1）、可誘導(dǎo)表達(dá)

由于巴斯德畢赤酵母沒有合適的自主復(fù)制型載體，所以外源基因序列一般整合入受體的染色體DNA上。其外源基因20余種具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重組蛋白在該系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。的高效表達(dá)在很大程度上取決于整合拷貝數(shù)的多寡。目前已有“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材

多型漢遜酵母也是一種甲基營養(yǎng)菌。其自主復(fù)制序列多型漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)HARS已被克隆，并用于構(gòu)建克隆表達(dá)載體，HARS質(zhì)粒能高頻自發(fā)地整合在受體的染色體DNA上（可連續(xù)整合100多

目前，包括乙型肝炎表面抗原在內(nèi)的數(shù)種外源蛋白在該個(gè)拷貝，因此重組多型漢遜酵母的構(gòu)建也是采取整合的策略。系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)?！笆濉逼胀ǜ叩冉逃龂壹?jí)規(guī)劃教材釀酒酵母中的2m環(huán)狀質(zhì)粒同源重組REP1RAFSTBoriREP2FLPIRIRAB環(huán)狀質(zhì)粒，拷貝數(shù)達(dá)50至100個(gè)。IRs反向重復(fù)序列，600bp，重組FLP編碼產(chǎn)物驅(qū)動(dòng)IRs的同源重組REP編碼產(chǎn)物控制質(zhì)粒的穩(wěn)定性STBREP的結(jié)合位點(diǎn)接合酵母屬中的pSR1和pSB1，以及克魯維酵母屬中的pKD1等均與2m質(zhì)粒類似。第一節(jié)酵母基因工程表達(dá)體系

--------載體“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材第一節(jié)酵母基因工程表達(dá)體系

--------載體酵母質(zhì)粒載體既可以在大腸桿菌復(fù)制與擴(kuò)增、又可以在酵母系統(tǒng)中復(fù)制與擴(kuò)增，故此類載體又稱為穿梭載體（shuttlevector）。酵母菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體是由來自酵母的部分核酸序列和細(xì)菌的部分核酸序列所組成，其原核部分主要包括可以在大腸桿菌中復(fù)制的起點(diǎn)序列(Ori)和特定的抗生素抗性基因序列。酵母部分包括酵母轉(zhuǎn)化子的篩選組分，主要是與宿主互補(bǔ)的營養(yǎng)缺陷型基因序列(如：HIS4基因序列)或特定的抗生素抗性基因序列(如：抗Zeoein的基因序列)，以及編碼特定蛋白的基因啟動(dòng)子和終止子序列。

“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材第一節(jié)

酵母基因工程表達(dá)體系

-------載體1．酵母載體的基本結(jié)構(gòu)

DNA復(fù)制起始區(qū)：2μ質(zhì)粒的復(fù)制起始區(qū)及酵母基因組的自主復(fù)制序列（autonomouslyreplicatingsequence，ARS）

篩選標(biāo)記：營養(yǎng)缺陷型篩選或者抗性篩選

整合介導(dǎo)區(qū)

有絲分裂穩(wěn)定區(qū)

表達(dá)盒：

啟動(dòng)子，基因（分泌信號(hào)序列），終止子“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材2酵母載體的種類酵母整合型質(zhì)粒YIp：缺乏酵母的復(fù)制起始位點(diǎn)，不能在酵母中自主復(fù)制，含有酵母的篩選標(biāo)記ura3基因。具有整合介導(dǎo)區(qū)，所以，它只有整合到酵母染色體中才能穩(wěn)定(a)。酵母克隆表達(dá)載體根據(jù)其在酵母中復(fù)制形式來分類。分為下列五類：酵母載體按照用途不同可分為克隆載體和表達(dá)載體兩類“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材含有酵母菌染色體DNA同源序列的YIp質(zhì)粒的構(gòu)建

在大腸桿菌質(zhì)粒上組裝酵母菌染色體DNA特定序列和標(biāo)記基因，構(gòu)建出來的質(zhì)粒稱為YIp。目的基因表達(dá)盒通常插在染色體DNA特定序列中，這樣目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色體DNA區(qū)域?！笆濉逼胀ǜ叩冉逃龂壹?jí)規(guī)劃教材酵母附加體質(zhì)粒YEp：含有釀酒酵母2m質(zhì)粒DNA復(fù)制有關(guān)的序列，該載體在酵母細(xì)胞中穩(wěn)定，拷貝數(shù)可達(dá)60-100。轉(zhuǎn)化效率高（b）。

酵母復(fù)制型質(zhì)粒YRp：含有來源于酵母的DNA復(fù)制起始區(qū)(ARS)，能在酵母染色體外自主復(fù)制的一種自主復(fù)制型載體，雖然其轉(zhuǎn)化效率高，在宿主的拷貝數(shù)可以達(dá)上百個(gè)（c）。

“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材

ARS為酵母菌中的自主復(fù)制序列，0.8-1.5kb，染色體上每30-40kb就有一個(gè)ARS元件。

以ARS為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為YRp

上述兩類質(zhì)粒在釀酒酵母中的拷貝數(shù)最高可達(dá)200個(gè)，

以2m質(zhì)粒上的復(fù)制元件為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為YEp但培養(yǎng)幾代后，質(zhì)粒的丟失率高達(dá)50%-70%，主要是由于分配不均勻所致。“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材2酵母載體的種類酵母著絲粒質(zhì)粒YCp：含有酵母染色體著絲粒的DNA片段，這種載體在細(xì)胞分裂過程中，在母細(xì)胞和子細(xì)胞之間平均分配，表現(xiàn)出高度的穩(wěn)定性(d)。

CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配有關(guān)的序列,將CENDNA插入含ARS的質(zhì)粒中，獲得的新載體稱為YCp.YCp質(zhì)粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性，但拷貝數(shù)只有1-5個(gè)。酵母人工染色體YAC：酵母人工染色體(yeastartificialchromosome，YAC)是一類酵母穿梭載體。YAC具有自主復(fù)制序列（ARS）、著絲粒序列（CEN）和端粒序列（TEL），克隆位點(diǎn)以及可在細(xì)菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因。

YAC載體在宿主細(xì)胞中以線性雙鏈DNA存在，具有高度的遺傳穩(wěn)定性。YAC還具有酵母菌染色體的一些特點(diǎn)?？山邮?00-1000kb的外源DNA片段。

“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材主要結(jié)構(gòu)：

①兩個(gè)可在酵母菌中利用的選擇基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因)；②酵母菌著絲粒序列(centromere4,CEN4)；③一個(gè)自主復(fù)制序列(ARS1)；④兩個(gè)來自嗜熱四膜蟲(Tetrahymennathermophilp)的末端重復(fù)序列(TEL)，以保持重組YAC為線狀結(jié)構(gòu)；⑤在兩個(gè)末端序列中間，有一段填充序列(stuff,HIS3)，以便pYAC4在細(xì)菌細(xì)胞中穩(wěn)定擴(kuò)增；⑥Ampr抗性及細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn)；⑦一個(gè)EcoRⅠ克隆位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于酵母菌Sup4tRNA基因內(nèi)。

“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材酵母菌的轉(zhuǎn)化方法用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材酵母菌轉(zhuǎn)化方法原生質(zhì)球法：酶解酵母細(xì)胞壁，產(chǎn)生原生質(zhì)球，原生質(zhì)體在Ca2+和PEG的存在下，具有穿透性，并允許DNA進(jìn)入，然后使原生質(zhì)球再生新的細(xì)胞壁?？梢詫?shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子可達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的1-2%。Li+鹽轉(zhuǎn)化方法：釀酒酵母的完整細(xì)胞經(jīng)堿金屬離子（如Li+等）處理后，在PEG存在下和熱休克之后可高效吸收質(zhì)粒DNA。醋酸鋰對(duì)釀酒酵母有效，對(duì)畢赤酵母無效，畢赤酵母轉(zhuǎn)化一般用氯化鋰有效優(yōu)點(diǎn)：吸收線型DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA（相差80倍）“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材酵母菌轉(zhuǎn)化方法電擊轉(zhuǎn)化法：原理是通過利用高壓電脈沖作用，造成細(xì)胞膜的不穩(wěn)定，形成電穿孔，形成可逆的瞬間通道，不僅有利于離子和水進(jìn)入細(xì)胞，也有利于外源DNA等大分子進(jìn)入優(yōu)點(diǎn)：不依賴于受體細(xì)胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件；適用范圍廣；轉(zhuǎn)化率高（達(dá)105/mgDNA）。PEG轉(zhuǎn)化法：PEG1000“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化特點(diǎn)單、雙鏈DNA均可轉(zhuǎn)化，但單鏈的轉(zhuǎn)化率是雙鏈的10-30倍單鏈質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后，能轉(zhuǎn)化為雙鏈并復(fù)制（含有復(fù)制子）或同源整合入染色體（不含復(fù)制子）克隆在YIp上的外源基因，會(huì)發(fā)生高頻同源整合，整合子占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的50-80%“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因

營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA等

但對(duì)于多倍體酵母來說，篩選營養(yǎng)缺陷型的受體非常困難營養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)基因“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因其編碼產(chǎn)物只要是毒性物質(zhì)的抗性蛋白顯性標(biāo)記基因aph

氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶抗G418

cat

氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶抗氯霉素dhfr

二氫葉酸還原酶抗氨甲喋呤和磺胺cup1

銅離子螯合物耐受銅離子suc2

蔗糖轉(zhuǎn)化酶耐受高濃度蔗糖ilv2

乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草劑標(biāo)記基因編碼產(chǎn)物遺傳表型“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材第二節(jié)常見的酵母基因表達(dá)系統(tǒng)一、釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)1，啟動(dòng)子

組成型表達(dá)的啟動(dòng)子：磷酸甘油酸激酶（PGKl）啟動(dòng)子、甘油醛磷酸脫氫酶（GAPDH或GAPl）啟動(dòng)子可控性啟動(dòng)子：半乳糖啟動(dòng)子（GAL）、酸性磷酸酶啟動(dòng)子（PHO）、乙醇脫氫酶（ADH2）啟動(dòng)子、Cu2+螯合蛋白啟動(dòng)子（CUPI）以及交配a型阻遏系統(tǒng)（MATa/a）

“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材酵母菌啟動(dòng)子的可控性pho4TS-PHO5啟動(dòng)子：釀酒酵母PHO5啟動(dòng)子在培養(yǎng)基中游離磷酸鹽耗盡時(shí)才能打開PHO4基因編碼產(chǎn)物是PHO5啟動(dòng)子的正調(diào)控因子因此，裝在pho4TS-PHO5啟動(dòng)子下游的外源基因在35℃時(shí)關(guān)閉23℃誘導(dǎo)表達(dá)溫度控制型啟動(dòng)子PHO4溫度敏感型突變基因pho4TS的編碼產(chǎn)物在35℃時(shí)失活“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材酵母菌啟動(dòng)子的可控性a–a

型啟動(dòng)子釀酒酵母有a和a兩種單倍體，分別由MATa和MATa兩個(gè)等位基因決定。a1因子決定a細(xì)胞特征表達(dá)a2因子阻遏a細(xì)胞特征表達(dá)a1-a2阻遏a細(xì)胞特征表達(dá)編碼a2因子的基因突變型hmla2-102能產(chǎn)生a2變體，它能滅活a1，同時(shí)阻遏a型溫度控制型啟動(dòng)子a型啟動(dòng)子hmla2-102MATaa1Sir3-8TSa

型啟動(dòng)子

受體細(xì)胞基因組

重組質(zhì)粒a型啟動(dòng)子hmla2-102MATaa1Sir3-8TSa

型啟動(dòng)子a2a125℃35℃（–）“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材酵母菌啟動(dòng)子的可控性釀酒酵母超誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80基因基底水平表達(dá)GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖誘導(dǎo)時(shí)，GAL4高效表達(dá)，GAL1、GAL1、GAL10超高效表達(dá)GAL10Promoter的半乳糖利用酶系由GAL1

GAL7和

GAL10基因編碼“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材雜合啟動(dòng)子：將釀酒酵母的乙醇脫氫酶Ⅱ基因（ADH2）所屬啟動(dòng)子的上游調(diào)控區(qū)與甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）所屬啟動(dòng)子的下游基本區(qū)重組在一起，構(gòu)建出ADH2-GADPH型雜合啟動(dòng)子“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材釀酒酵母表達(dá)載體目前已建立的釀酒酵母表達(dá)載體有（1）酵母附加體質(zhì)粒(YEp)（見右圖）；（2）酵母復(fù)制型質(zhì)粒(YRp)；（3）酵母著絲粒質(zhì)粒(YCp)；（4）酵母整合型質(zhì)粒(YIp)；（5）酵母人工染色體(YAC)。前三類統(tǒng)稱為游離自主復(fù)制型質(zhì)粒載體。含有來自酵母基因組的復(fù)制起始區(qū)ARS或者酵母天然質(zhì)粒2m復(fù)制起點(diǎn)序列，能夠自主復(fù)制，通常為多拷貝數(shù)“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材釀酒酵母宿主

有些蛋白酶缺陷有利于重組異源蛋白的穩(wěn)定表達(dá)。如pep4-3突變株中蛋白酶的活性顯著降低，對(duì)外源基因表達(dá)產(chǎn)物的降解作用較小。

“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材提高重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的突變宿主菌能導(dǎo)致釀酒酵母中重組蛋白產(chǎn)量提高或質(zhì)量改善的突變類型ssc1

改善重組蛋白分泌鈣離子依賴型的ATP酶ssc2

提高重組蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)錄后加工rgr1

提高重組蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平ose1

提高重組蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平ssc11

改善重組蛋白分泌羧肽酶Yrho-

提高重組蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平突變類型生物效應(yīng)作用位點(diǎn)“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材釀酒酵母宿主

為了減少目的蛋白的過度糖基化，目前已從野生型的釀酒酵母中分離出許多類型的糖基化途徑突變株，如甘露聚糖合成缺陷型的mnn突變株、天門冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷的alg突變株以及外側(cè)糖鏈缺陷型的och突變株等。在這些突變株中，具有重要實(shí)用價(jià)值的是mnn9、och1、och2、alg1和alg2，因?yàn)樗鼈儾荒茉诋愒吹鞍椎奶扉T冬酰胺側(cè)鏈上延長甘露多聚糖長鏈。

“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材抑制超糖基化作用的突變宿主菌能抑制超糖基化的突變類型mnn

甘露糖生物合成缺陷型alg天冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷型och外側(cè)糖鏈添加缺陷型突變類型生物效應(yīng)

許多真核生物的蛋白質(zhì)在其天冬酰胺側(cè)鏈上接有寡糖基團(tuán)，它們常常影響蛋白質(zhì)的生物活性。整個(gè)糖單位由糖基核心和外側(cè)糖鏈兩部分組成。

酵母菌普遍擁有蛋白質(zhì)的糖基化系統(tǒng)，但野生型釀酒酵母對(duì)異源蛋白的糖基化反應(yīng)很難控制，呈超糖基化傾向，因此超糖基化缺陷株非常重要?！笆濉逼胀ǜ叩冉逃龂壹?jí)規(guī)劃教材減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解作用蛋白酶體LysHOOCUbiquitin76aa

ubiquitinligaseE3

LysubiquitinligaseE3

Lys靶蛋白靶蛋白靶蛋白“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌酵母菌泛素依賴型蛋白降解系統(tǒng)的編碼基因酵母菌有四個(gè)泛素編碼基因：UBI1

編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）對(duì)數(shù)生長期表達(dá)穩(wěn)定期關(guān)閉UBI2

編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）對(duì)數(shù)生長期表達(dá)穩(wěn)定期關(guān)閉UBI3

編碼泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76）對(duì)數(shù)生長期表達(dá)穩(wěn)定期關(guān)閉UBI4

編碼泛素五聚體對(duì)數(shù)生長期關(guān)閉穩(wěn)定期表達(dá)酵母菌有七個(gè)泛素連接酶基因：UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌泛素降解途徑衰減的釀酒酵母釀酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表達(dá)，UBI4-突變株能UBI4缺陷型：外源基因表達(dá)理想的受體正常生長，但細(xì)胞內(nèi)游離泛素分子的濃度比野生株要低得多，UBA1缺陷型：減少蛋白降解UBA1編碼泛素激活酶E1，UBA1突變株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介導(dǎo)的蛋白降解Ubc4-ubc5雙突變型：減少蛋白降解七個(gè)泛素連接酶基因的突變對(duì)衰減蛋白降解作用同樣有效“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材二、畢赤酵母（Pichiapastoris）表達(dá)系統(tǒng)

1.啟動(dòng)子

（1）AOX1和AOX2啟動(dòng)子（2）三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldeyde3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）啟動(dòng)子（3）甲醛脫氫酶（formaldehydedehydrogenase,FLD）啟動(dòng)子“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材2畢赤酵母表達(dá)載體類型胞內(nèi)表達(dá)載體pPICZA,B,C分泌型表達(dá)載體pPICZaA,B,C“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材畢赤酵母表達(dá)載體上無酵母復(fù)制起點(diǎn)，它是靠AOX1或HIS4基因的位置同源重組整合入酵母染色體DNA中，并隨酵母的生長傳代穩(wěn)定地存在。整合的方式可以是單交換插入，亦可雙交換插入，一般來說前一種方式更容易發(fā)生。3載體的整合方式依據(jù)具體整合位點(diǎn)及相應(yīng)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子的類型可分為三種情況：“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材5’AOX1和3’AOX1與染色體發(fā)生同源重組，使受體染色體帶有一個(gè)拷貝的外源基因。這種情況有功能的AOX1基因被替換而丟失后，只能利用弱的AOX2基因啟動(dòng)合成AOX，就產(chǎn)生His+MutS表型(methanolutilizationslow)，在含甲醇的培養(yǎng)基中生長緩慢。此時(shí)，甲醇利用率很低，但它表達(dá)外源基因的效率高染色體HIS4基因與載體的HIS4基因發(fā)生置換，使得一個(gè)或多個(gè)表達(dá)單位插入在his4位點(diǎn)，產(chǎn)生的表型也是His+Mut+染色體AOX1區(qū)與載體質(zhì)粒的AOX1區(qū)發(fā)生單位點(diǎn)互交換，外源基因的表達(dá)單位插入在基因區(qū)AOX1基因的上游或下游，這一過程可重復(fù)發(fā)生，使得更多拷貝的表達(dá)單位插入基因組中。這種情況AOX1基因仍然有活性，在含甲醇的培養(yǎng)基中生長正常，產(chǎn)生的表型是His+Mut+。

“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材在畢赤酵母中有3種方法可以得到多拷貝表達(dá)菌株。第一種方法直接構(gòu)建含高拷貝外源基因的表達(dá)載體，在體外利用同尾酶向載體中多次插入首尾相連的表達(dá)盒。此法的優(yōu)點(diǎn)是一次整合，即可有多個(gè)表達(dá)盒插入染色體。但體外基因操作較繁瑣。第二種方法是利用含有kanr基因的載體。細(xì)菌來源的卡那霉素抗性基因在酵母中賦予宿主抵抗真核抗生素G418。G418的抗性水平大致與載體的拷貝數(shù)相關(guān)。提高抗生素G418的濃度可以得到含高拷貝表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化菌株。第三種方法是用含有Zeocin抗性標(biāo)記基因Shble的載體來構(gòu)建多拷貝菌株。來源于細(xì)菌的Shble在酵母中賦予宿主對(duì)抗生素zeocin的抵抗能力，通過提高zeocin濃度可篩選出含高拷貝表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化菌株。然而與G418篩選相似，大多數(shù)能抵抗高水平zeocin的轉(zhuǎn)化子并不含有多載體拷貝。

“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材4宿主常用的畢赤酵母受體菌株有：組氨酸缺陷型GSl15和SMD1168，腺嘌呤缺陷型PMAD11，PMAD16，其中SMD1168為蛋白酶缺陷型，以其作為宿主表達(dá)蛋白可以降低表達(dá)產(chǎn)物的降解。這些表達(dá)宿主都是由野生品系NRRL-Y11430衍生來的。最常用的受體菌是Cregg在1985年建立的GS115，它含有一個(gè)組氨醇脫氫酶缺陷型基因His4，可接受含His4的載體而具有His+表型來篩選轉(zhuǎn)化子。根據(jù)對(duì)甲醇利用的情況，畢赤酵母可劃分為三種表型。菌株含有AOX1和AOX2基因，在含甲醇的培養(yǎng)基中生長速率與野生型類似，稱為甲醇利用正表型（Mut+），如GS115；當(dāng)AOX1被其他基因取代，則需依賴AOX2，但其甲醛代謝速度慢，稱為甲醇利用慢表型（Muts），如KM71。當(dāng)AOX基因全部缺失，則不能利用甲醇，稱為甲醇利用負(fù)表型（Mut-），如MC100-3。后兩者胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白質(zhì)有時(shí)優(yōu)于野生株，且需甲醇較少。此外為增加分泌蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，避免被宿主蛋白酶降解，可使用蛋白酶缺陷型菌株，如SMD1168(his4,prb1)。“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材第三節(jié)影響外源基因表達(dá)的因素外源基因穩(wěn)態(tài)mRNA的濃度優(yōu)化翻譯起始區(qū)前后mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高外源基因mRNA的翻譯活性酵母菌對(duì)密碼子的偏愛性在釀酒酵母中，高豐度的蛋白質(zhì)（如甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脫氫酶ADH）中96%以上的氨基酸是由25個(gè)密碼子編碼的一、轉(zhuǎn)錄水平控制二、表達(dá)載體的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性三、其他因素“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材優(yōu)化工程菌發(fā)酵工藝避免表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的降解，選擇或改造宿主，如：采用二倍體宿主、采用釀酒酵母以外的酵母菌作為宿主第三節(jié)影響外源基因表達(dá)的因素“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材

利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗第四節(jié)酵母基因工程應(yīng)用實(shí)例

由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一種嚴(yán)重的傳染病，每年約有200萬病人死亡，并有3億人成為HBV攜帶者，其中相當(dāng)一部分人可能轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌患者。目前對(duì)乙型肝炎病毒還沒有一種有效的治療藥物，因此高純度乙型疫苗的生產(chǎn)對(duì)預(yù)防病毒感染具有重大的社會(huì)效益，而利用重組酵母大規(guī)模生產(chǎn)乙型疫苗為其廣泛應(yīng)用提供了可靠的保證?！笆濉逼胀ǜ叩冉逃龂壹?jí)規(guī)劃教材

利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

乙肝病毒是一種蛋白包裹型的雙鏈DNA病毒，病毒顆粒呈乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)球面狀，直徑為42nm，基因組僅為3.2kb。病毒顆粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白是表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化和非糖基化兩種形式。顆粒內(nèi)的蛋白包括核心抗原（HBcAg）、

此外，被乙肝病毒感染的人肝臟還能合成并釋放大量的22病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。nm的空殼亞病毒顆粒，其免疫原性是各種未裝配的包裝蛋白的1000倍。包裝蛋白共有三種轉(zhuǎn)膜糖蛋白：S、M、L多肽?！笆濉逼胀ǜ叩冉逃龂壹?jí)規(guī)劃教材乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因ATGATGATGTAA108aa55aa226aapreS1preS2SS多肽226aaM多肽281aaL多肽399aa“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

乙肝病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)基中并不能繁殖，因此第一代的傳統(tǒng)乙肝疫苗的制備乙肝疫苗是從病毒攜帶者的肝細(xì)胞膜上提取出來的。這種來源的疫苗具有較高的免疫原性，但由于原材料的限制難以大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母

20世紀(jì)80年代開始選擇釀酒酵母表達(dá)重組HBsAg，主要工作包括將S多肽的編碼置于ADH1啟動(dòng)子控制下，轉(zhuǎn)化子能表達(dá)出具有免疫活性的重組蛋白，它在細(xì)胞提取物中以球形脂蛋白顆粒的形式存在，平均顆粒直徑為22nm，其結(jié)構(gòu)和形態(tài)均與慢性乙肝病毒攜帶者血清中的病毒顆粒相同。

目前，由釀酒酵母生產(chǎn)的重組HBsAg顆粒的最終產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞總蛋白量的1%-2%。

進(jìn)一步的研究表明，M多肽和L多肽對(duì)S型疫苗具有顯著的增效作用，由三者（或兩者）構(gòu)成的復(fù)合型乙肝疫苗還可以誘導(dǎo)那些對(duì)S抗原缺乏響應(yīng)的人群的免疫反應(yīng)。“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母整合型重組巴斯德畢赤酵母的構(gòu)建PARS2BglII5’AOX1HBsAgPHIS43’AOX1BglIIpBSAG15111kbBglII5’AOX1HBsAgPHIS43’AOX1his+的轉(zhuǎn)化子重組分子轉(zhuǎn)化his-的受體細(xì)胞染色體DNA“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母

由于巴斯德畢赤酵母染色體DNA上還擁有第二個(gè)乙醇氧化酶基因AOX2，所以整合型重組菌仍能在含有甲醇的培養(yǎng)基上生長。

重組菌首先在含有甘油的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待甘油耗盡后，加入甲醇誘導(dǎo)HBsAg表達(dá)，最終S蛋白的產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞可溶性蛋白總量的3%

在大規(guī)模的生產(chǎn)過程中，巴斯德畢赤酵母工程菌在一個(gè)240L的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，最終可獲得90克22nm的HBsAg顆粒，足夠制成900萬份乙肝疫苗。“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材

小結(jié)

酵母基因工程，是根據(jù)酵母密碼子偏好從頭設(shè)計(jì)后化學(xué)合成或者PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段與載體DNA，經(jīng)過體外酶切、連接和重組，然后采取適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化方法，將重組后的帶有外源基因的載體DNA導(dǎo)入酵母細(xì)胞，并使其在酵母細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，以達(dá)到預(yù)期的改變受體酵母細(xì)胞遺傳特性或者獲得基因工程表達(dá)產(chǎn)物的目的。主要研究內(nèi)容包括目的基因克隆，確定合適的酵母基因工程受體菌與載體系統(tǒng)，采用相應(yīng)轉(zhuǎn)化方法以及轉(zhuǎn)化子的篩選與表型鑒定，重組基因工程酵母中目標(biāo)蛋白的誘導(dǎo)和表達(dá)?！笆濉逼胀ǜ叩冉逃龂壹?jí)規(guī)劃教材

利用酵母表達(dá)外源蛋白既可以在胞內(nèi)，也可以分泌到胞外。釀酒酵母和畢赤酵母已成為高等真核生物基因的優(yōu)良宿主系統(tǒng)。針對(duì)不同的表達(dá)宿主菌開發(fā)了相應(yīng)的表達(dá)載體。釀酒酵母表達(dá)載體有基于酵母基因組的復(fù)制起始區(qū)ARS或者酵母天然質(zhì)粒2m復(fù)制起點(diǎn)序構(gòu)建的游離自主復(fù)制型質(zhì)粒載體，也有整合型載體。但是由于畢赤酵母表達(dá)載體上無酵母復(fù)制起點(diǎn)，它是靠同源重組將外源基因表達(dá)序列整合入受體細(xì)胞的染色體DNA上，構(gòu)建穩(wěn)定的畢赤酵母工程菌。

“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材

酵母菌基因轉(zhuǎn)移方法有：原生質(zhì)球法、電擊轉(zhuǎn)化法、PEG方法和Li+鹽轉(zhuǎn)化方法。篩選方法主要是：營養(yǎng)缺陷型篩選和抗生素抗性篩選。

將來表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展的方向是采用自克隆技術(shù)構(gòu)建的食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)。宿主為食品級(jí)微生物，載體采用食品級(jí)選擇標(biāo)記，既不能有抗生素標(biāo)記存在。通常以缺陷型菌株作為受體菌，載體上攜帶有受體菌所缺陷的基因與受體菌互補(bǔ)，作為選擇標(biāo)記?！笆濉逼胀ǜ叩冉逃龂壹?jí)規(guī)劃教材思考題1，對(duì)作為表達(dá)目標(biāo)蛋白宿主的酵母細(xì)胞有什么基本要求？2，什么叫穿梭載體？指出酵母穿梭表達(dá)載體pYES2每個(gè)元件的功能。3，畢赤酵母中三種表型Mut+，Muts，Mut-分別代表什么含義，各種表型是怎么產(chǎn)生的？4釀酒酵母和畢赤酵母表達(dá)載體中常用的啟動(dòng)子有哪些？哪些是誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子？哪些是組成型的啟動(dòng)子？5，比較釀酒酵母和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)。6，提高外源基因在酵母中的表達(dá)水平，考慮從哪些方面入手？

“十二五”普通高等教育國家級(jí)規(guī)劃教材第十章

基因工程相關(guān)技術(shù)

第一節(jié)核酸分子雜交技術(shù)第二節(jié)芯片技術(shù)第三節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)與酵母雙雜交第四節(jié)基因敲除技術(shù)第五節(jié)生物信息學(xué)本章內(nèi)容第一節(jié)核酸分子雜交技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)是根據(jù)核酸變性和復(fù)性的性質(zhì)，應(yīng)用核酸探針檢測靶基因或靶序列的技術(shù)方法，是分子生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一。具有靈敏度高、快捷、簡便易行等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于基因克隆的篩選、酶切圖譜的制作、基因序列的定量和定性分析以及基因突變的檢測等。一、核酸雜交的原理利用具有同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下退火，可按堿基互補(bǔ)原則形成雙鏈，如果這兩條鏈的來源不同，則形成雜交分子，形成的雜交分子的穩(wěn)定性與兩條鏈的互補(bǔ)性（親緣關(guān)系）密切相互。因此，DNA/RNA的雜交可以用來檢測特定生物有機(jī)體之間是否存在著親緣關(guān)系，而核酸分子雜交更重要的是可以用來檢測核酸片段中某一特定基因的位置。一、核酸雜交的原理核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)通常包括兩步：第一，將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上，這個(gè)過程特稱為核酸印跡（nucleicacidblotting）轉(zhuǎn)移。主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點(diǎn)和狹線印跡法（dotandslotblotting）、菌落和噬菌斑印跡法（colonyandplaqueblotting）；第二，將具有核酸印跡的濾膜與帶有放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交。所以有時(shí)也稱這類核酸分子雜交為印跡雜交。二、核酸探針的制備核酸分子探針:是指特定的已知核酸片段，能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，因此可以用于待測核酸樣品中特定基因順序的探測。要實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸探針分子的有效探測，必須將探針分子用一定的示蹤物（即標(biāo)記物）進(jìn)行標(biāo)記。

1.探針的種類及其選擇根據(jù)核酸分子探針的來源及其性質(zhì)可以分為基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針及人工合成的寡核苷酸探針等幾類。探針的選擇應(yīng)給予足夠的重視并遵循如下原則：探針應(yīng)具有高度特異性、來源要盡量方便、探針的序列結(jié)構(gòu)應(yīng)不受標(biāo)記物的影響等。1.探針的種類及其選擇(1)基因組DNA探針?？寺』母鞣N基因片段是最廣泛采用的核酸探針，幾乎所有的基因片段都可被克隆到質(zhì)?；蚴删w載體中，為獲得大量高純度的DNA探針提供了方便。近年來發(fā)展起來的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)也為DNA探針提供了另一方便的來源。(2)cDNA探針。cDNA中不存在內(nèi)含子及其他高度重復(fù)序列或非編碼序列，是一種較為理想的核酸探針，但cDNA探針不易獲得，限制了它的廣泛應(yīng)用。另外，要注意cDNA中的poly(dT)可能產(chǎn)生的非特異性雜交問題。1.探針的種類及其選擇(3)RNA探針。mRNA作為核酸分子雜交的探針是較為理想的，因?yàn)椋孩賀NA/RNA和RNA/DNA雜交體的穩(wěn)定性較DNA/DNA雜交體的穩(wěn)定性高，因此雜交反應(yīng)可以在更為嚴(yán)格的條件下進(jìn)行(如雜交溫度可提高10℃左右)，因而雜交的特異性更高。②單鏈RNA分子不存在互補(bǔ)雙鏈的競爭性結(jié)合，與待測核酸序列雜交的效率較高。③RNA中不存在高度重復(fù)序列，非特異性雜交也比較少。④雜交后可用RNase將未雜交的探針消化掉，從而使本底降低。1.探針的種類及其選擇(3)RNA探針。mRNA作為核酸分子雜交的探針是較為理想的。另外，RNA極易被環(huán)境中大量存在的核酸酶降解，很難操作，這也是限制其廣泛應(yīng)用的重要原因之一。1.探針的種類及其選擇(4)寡核苷酸探針。近年來，隨著DNA合成儀的問世及其使用的逐步推廣，越來越多的研究者更熱衷于采用人工合成的寡聚核苷酸片段作為分子雜交的探針，其優(yōu)點(diǎn)是可根據(jù)需要隨心所欲地合成相應(yīng)的序列，避免了天然核酸探針中存在的高度重復(fù)序列所帶來的不利影響；大多數(shù)寡核苷酸探針長度只有5~30bp，即使有一個(gè)堿基不配對(duì)也會(huì)顯著影響其熔解溫度(Tm)，因此特別適合于基因點(diǎn)突變分析；另外，由于探針序列的復(fù)雜性降低，雜交所需時(shí)間也較短。2.各種標(biāo)記物及其選擇一種理想的探針標(biāo)記物，應(yīng)具備以下幾種特性：①標(biāo)記前后探針的基本結(jié)構(gòu)不變，標(biāo)記物不影響探針的化學(xué)性質(zhì)、雜交特異性、Tm值等；②可以通過采取一定措施達(dá)到較高的靈敏度（如延長曝光時(shí)間或用增感屏來增加訊號(hào)的強(qiáng)度）；③特異性強(qiáng)、本底低，重復(fù)性好，并且操作簡單、省時(shí)；④穩(wěn)定、安全、經(jīng)濟(jì)、無污染。2.各種標(biāo)記物及其選擇目前用于分子雜交的探針標(biāo)記物已有20多種，可分為放射性和非放射性兩大類。1.放射性核素

放射性核素的靈敏度極高，可檢測到10－4~10－18g的物質(zhì)，但存在以下缺點(diǎn)：①容易造成放射性污染；②當(dāng)標(biāo)記活性極高時(shí)，放射線會(huì)造成核酸分子結(jié)構(gòu)的破壞；③多數(shù)放射性核素的半衰期都比較短，必須隨用隨標(biāo)記，標(biāo)記后立即使用，不能長期存放（3H與14C除外）。2.各種標(biāo)記物及其選擇目前用于分子雜交的探針標(biāo)記物已有20多種，可分為放射性和非放射性兩大類。2.非放射性標(biāo)記物生物素（biotin）、地高辛配基（digoxigenin）、熒光素等多數(shù)非放射性標(biāo)記探針的敏感性較差，但穩(wěn)定性好、分辨力高、檢測所需的時(shí)間短，尤其是操作過程中不需要放射性防護(hù)設(shè)備，在安全方面大大優(yōu)于放射性標(biāo)記探針。3.探針的標(biāo)記方法放射性標(biāo)記分為體內(nèi)標(biāo)記法及體外標(biāo)記法兩種，而基因工程中常用體外標(biāo)記。體外標(biāo)記法又分為化學(xué)法和酶法兩種?；瘜W(xué)法是通過標(biāo)記物的活性基團(tuán)與核酸分子中的某種基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記物直接與核酸分子相連。酶法標(biāo)記是先將標(biāo)記物標(biāo)記在核苷酸上，然后在通過酶促聚合反應(yīng)使帶有標(biāo)記的核苷酸摻入到核酸序列中，產(chǎn)生標(biāo)記核酸探針。3.探針的標(biāo)記方法常用的酶法標(biāo)記有切口平移法（nicktranslation）和隨機(jī)引物法（randompriming），這兩種方法均為均一標(biāo)記。此外還有一種是利用多核苷酸激酶的末端標(biāo)記法，為不均勻標(biāo)記。1.切口平移法2.隨機(jī)引物法隨機(jī)引物法優(yōu)點(diǎn)：①模板的純度不需很高即可標(biāo)記；②反應(yīng)比較穩(wěn)定，可通過延長反應(yīng)時(shí)間來增加探針產(chǎn)量；③標(biāo)記探針的比活較高，可達(dá)到4×109cpm/μg；④該法可以在低熔點(diǎn)的瓊脂糖中進(jìn)行。5’-端標(biāo)記，標(biāo)記物常用[γ-32P]ATP。T4多聚核苷酸激酶5’-末端標(biāo)記法3’-末端標(biāo)記可使用末端轉(zhuǎn)移酶，[α-32P]dNTP加到寡核苷酸的3’-末端，可以加上單個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物，多個(gè)標(biāo)記物的加入可以提高探針的比活。3’-末端標(biāo)記法4.非放射性標(biāo)記探針的檢出目前大多數(shù)非放射性探針的制備都是采用分子雜交與酶反應(yīng)結(jié)合的策略，雜交信號(hào)的檢出依賴于酶反應(yīng)，其中酶直接標(biāo)記的探針可直接通過酶反應(yīng)檢測。三、核酸雜交種類與方法（1）固相雜交，也稱為膜上印跡雜交，包括Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、斑點(diǎn)雜交及狹縫印跡雜交。（2）細(xì)胞原位雜交，標(biāo)記已知序列的核酸，與細(xì)胞或組織切片中的核酸進(jìn)行雜交，并對(duì)其進(jìn)行檢測的方法。（3）液相雜交。1.固相雜交（膜上印跡雜交）膜上印跡雜交是指將待測核酸序列片段結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相中標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交的過程，是目前最常用的一種核酸分子雜交方法。這種膜上印跡雜交的技術(shù)也稱印跡技術(shù)。根據(jù)核酸分子的種類不同，印跡技術(shù)（或方法）分為Southern印跡和Northern印跡。根據(jù)核酸轉(zhuǎn)移方式的不同也有不同的印跡方法：①斑點(diǎn)或狹縫印跡法；②虹吸轉(zhuǎn)移印跡方法；③電轉(zhuǎn)移印跡方法；④真空轉(zhuǎn)移印跡方法。印跡雜交實(shí)驗(yàn)中，選擇有效的轉(zhuǎn)移方法和良好的固相支持物此項(xiàng)技術(shù)成敗的關(guān)鍵。固相支持物種類很多，一種良好的固相支持物應(yīng)具備以下幾個(gè)特點(diǎn)：①具有較強(qiáng)的結(jié)合核酸分子的能力；②與核酸分子結(jié)合后，應(yīng)不影響與探針分子的雜交反應(yīng)；③與核酸分子的結(jié)合穩(wěn)定牢固，能經(jīng)受雜交、洗膜等操作而不致于脫落或脫落極少；④非特異性吸附少，在洗膜條件下能將非特異性吸附在其表面的探針分子洗脫掉；⑤具有良好的機(jī)械性能，如柔軟性好、韌性強(qiáng)等，以便于操作。（1）固相支持物的選擇（1）原理

Southern印跡是由Southern于1975年發(fā)明建立，是指將電泳分離的DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過程。（2）Southern印跡雜交（2）Southern印跡雜交Northern印跡雜交是細(xì)胞總RNA或mRNA與DNA探針的雜交的印跡過程。（1）Northern印跡雜交的原理：提取植物總RNA或mRNA，用變性凝膠電泳分離，不同的RNA分子將按分子量大小依次排布在凝膠上，原位轉(zhuǎn)移至固相膜，在適宜的離子強(qiáng)度及溫度條件下，探針與膜上的同源序列雜交形成RNA-DNA雜交雙鏈，通過探針的標(biāo)記性質(zhì)可以檢出雜交體。根據(jù)雜交體在膜上的位置可進(jìn)一步分析雜交RNA的大小。若經(jīng)過上述雜交操作膜上沒有出現(xiàn)雜交帶，說明外源基因雖然已整合到植物染色體上，但在該取材部位及生理狀態(tài)下并未有效表達(dá)。（3）Northern印跡雜交（2）Northern印跡雜交程序基本程序與Southern印跡雜交一樣，只是電泳分離有較大差別，Southern印跡雜交是用普通瓊脂糖凝膠分離DNA分子，而Northern印跡雜交則是用變性凝膠電泳來分離RNA分子。RNA電泳時(shí)必須注意兩個(gè)問題：①防止單鏈RNA形成高級(jí)結(jié)構(gòu)，所以必須采用變性凝膠；②電泳過程中始終要有效抑制RNA酶的作用。斑點(diǎn)雜交是將被檢標(biāo)本點(diǎn)到膜上，烘烤固定。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析。一張膜上可同時(shí)檢測多個(gè)樣品，為使點(diǎn)樣準(zhǔn)確方便，市售有多種多管吸印儀，在負(fù)壓下就會(huì)流到膜上呈斑點(diǎn)狀或狹縫狀。反復(fù)沖洗進(jìn)樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本，這時(shí)的膜就可以進(jìn)行雜交。（4）斑點(diǎn)雜交2.菌落原位雜交菌落原位雜交是DNA探針與菌落DNA的雜交，于1975年，由M.Grunsyein和D.Hogness提出。具體做法是把菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，使溶菌變性的DNA與濾膜原位結(jié)合，因?yàn)樯L在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑是按照原來的位置不變地轉(zhuǎn)移到濾膜上，并在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用，故稱為菌落原位雜交。3.組織原位雜交組織原位雜交（Tissueinsituhybridization）簡稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交，它與菌落原位雜交不同，菌落原位雜交需裂解細(xì)菌釋出DNA，然后進(jìn)行雜交，而組織原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交，因此組織原位雜交可以確定探針互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點(diǎn)具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。第一節(jié)核酸分子雜交技術(shù)第二節(jié)芯片技術(shù)第三節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)與酵母雙雜交第四節(jié)基因敲除技術(shù)第五節(jié)生物信息學(xué)本章內(nèi)容第三節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)與酵母雙雜交隨著人類基因組計(jì)劃的逐步完成，科學(xué)家們又進(jìn)一步提出了后基因組計(jì)劃，蛋白質(zhì)組研究是其中一個(gè)很重要的內(nèi)容。蛋白質(zhì)組學(xué)主要研究大系統(tǒng)或部分網(wǎng)絡(luò)組成的多個(gè)不同蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系，主要是鑒定系統(tǒng)的行為而不是任何單一組分的行為。根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容可以分為：①表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)（expressionproteomics）：即研究細(xì)胞、組織中的蛋白，建立蛋白定量表達(dá)圖譜；②細(xì)胞圖譜蛋白質(zhì)組學(xué)（cell-mapproteomics）：即確定蛋白質(zhì)在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的位置，通過純化細(xì)胞器或用質(zhì)譜儀鑒定蛋白復(fù)合物組成等，來確定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用。蛋白質(zhì)組從整體的蛋白質(zhì)水平上，更加深入、更加貼近生命本質(zhì)的層次上去探討和發(fā)現(xiàn)生命活動(dòng)的規(guī)律。二、酵母雙雜交技術(shù)（一）酵母雙雜交的基本原理最早的酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song等在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立。采用轉(zhuǎn)錄激活因子單獨(dú)的DNA結(jié)合區(qū)不能激活基因轉(zhuǎn)錄，但當(dāng)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與激活結(jié)構(gòu)域物理性結(jié)合時(shí)，即能夠發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄激活功能。典型的真核生長轉(zhuǎn)錄因子如GAIA、GCN4等都含有兩個(gè)不同的且相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-bindingdomain，DNA-BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activatingdomain,AD)。二、酵母雙雜交技術(shù)（一）酵母雙雜交的基本原理前者可識(shí)別位于GAL4效應(yīng)基因（GALL-responsegene）的上游激活序列（Upstreamactivatingsequence,UAS）并與之結(jié)合，并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分相互作用，從而啟動(dòng)它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。即：DNA-BD和AD單獨(dú)分別作用并不能激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，但是當(dāng)二者在空間上充分接近時(shí)，則呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性并可激活UAS下游啟動(dòng)子，使啟動(dòng)子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。（二）酵母雙雜交技術(shù)的應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白-蛋白相互作用的重要技術(shù)手段，已廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與DNA、蛋白質(zhì)與RNA以及蛋白與其他小分子間相互作用的研究，在蛋白相互作用圖譜，多肽藥物和尋找藥物靶標(biāo)，植物與病原物識(shí)別及抗病信號(hào)傳導(dǎo)研究中也發(fā)揮了重要作用。1.建立蛋白相互作用圖譜有科學(xué)家應(yīng)用10種功能已知的與mRNA前體剪接有關(guān)的蛋白質(zhì)作起始“誘餌”，從含有約5×l06個(gè)克隆的釀酒酵母基因組文庫中進(jìn)行多輪篩選，獲得約700個(gè)陽性克隆，在這些篩選到的靶蛋白中，有9種是已知的mRNA前體剪接因子，5種是新發(fā)現(xiàn)的剪接因子，8種是與RNA其他加工過程有關(guān)的因子，還有45種與其他的功能有關(guān)。此外在以線蟲的生殖發(fā)育過程為研究對(duì)象，利用已知的27個(gè)線蟲發(fā)育相關(guān)蛋白建立了一個(gè)大規(guī)模的雙雜交系統(tǒng)，獲得了100多個(gè)相互作用的蛋白。由此可見，酵母雙雜交技術(shù)為繪制生物體的蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)狀圖譜提供了條件。2.篩選多肽藥物和尋找藥物靶標(biāo)利用雙雜交系統(tǒng)可以確定治療所用的多肽類藥物與腫瘤、細(xì)菌以及病毒的蛋白質(zhì)間的相互作用。因此，該技術(shù)已逐漸被應(yīng)用于篩選新型的具有生物活性的肽類藥物、診斷試劑和其他功能性多肽。我國學(xué)者通過將隨機(jī)DNA片段與GAIA的AD融合構(gòu)建酵母表達(dá)載體，成功構(gòu)建了一個(gè)可篩選擴(kuò)增的酵母雙雜交隨機(jī)肽庫，用于篩選和設(shè)計(jì)靶蛋白相互作用的藥物多肽。3.在植物與病原物識(shí)別中的應(yīng)用4.在植物抗病信號(hào)傳導(dǎo)研究中的應(yīng)用利用酵母雙雜交系統(tǒng)在以Pto抗病蛋白為核心的信號(hào)傳導(dǎo)鏈中先后鑒定出多種重要的蛋白元件，已初步勾勒出了Pto抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑的線條。應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)可以從番茄基因文庫中“釣”出了與Pto蛋白互作的蛋白Ptil。Ptil屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，已經(jīng)被證實(shí)是Pto蛋白激酶專一性磷酸化作用的底物。有學(xué)者利用酵母雙雜交系統(tǒng)研究證實(shí)了Pto蛋白功能的發(fā)揮與另一個(gè)抗病蛋白Prf(具有NBS．LRR結(jié)構(gòu))密不可分，認(rèn)為Prf蛋白可能是Pto激酶磷酸化的直接作用底物。二、基因敲除技術(shù)的應(yīng)用基因敲除技術(shù)可以選擇性地修飾基因及選擇如何去修飾，最終完全控制該段基因的DNA序列或修飾其周圍的調(diào)控元件。由于幾乎所有生命現(xiàn)象均由基因控制或受其影響，因此，基因敲除技術(shù)在幾乎所有生物學(xué)領(lǐng)域如微生物學(xué)、動(dòng)物學(xué)、植物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域都有應(yīng)用價(jià)值。它目前已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于各個(gè)方面，并取得了較大的進(jìn)展。第一節(jié)核酸分子雜交技術(shù)第二節(jié)芯片技術(shù)第三節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)與酵母雙雜交第四節(jié)基因敲除技術(shù)第五節(jié)生物信息學(xué)本章內(nèi)容第四節(jié)

基因敲除技術(shù)基因敲除（Knockout）又稱為基因打靶，是指人為地從DNA分子水平上去除或替換某一個(gè)基因，使細(xì)胞內(nèi)的某種特定遺傳信息無法再表達(dá)，進(jìn)而從整體水平或細(xì)胞水平推測相關(guān)基因功能的一種技術(shù)?；蚯贸夹g(shù)起源于20世紀(jì)80年代，是在基因同源重組技術(shù)和胚胎干細(xì)胞(EmbryonicStemcell，ES)技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一種新分子生物學(xué)技術(shù)。基因同源重組技術(shù)是指當(dāng)外源DNA片段大且與宿主基因片段同源性強(qiáng)者并互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，結(jié)合區(qū)的任何部分都有與宿主的相應(yīng)片段發(fā)生交換(即重組)的可能，因此這種重組技術(shù)又稱為同源重組。所謂胚胎干細(xì)胞是從著床前胚胎(孕3—5天)分離出的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Innercellmass，ICM)細(xì)胞，它具有向各種組織細(xì)胞分化的多分化潛能，能在體外培養(yǎng)并保留發(fā)育的全能性。在體外進(jìn)行遺傳操作后，將它重新植回小鼠子宮，該細(xì)胞能發(fā)育成胚胎的各種組織乃至于一個(gè)個(gè)體。基因敲除就是通過同源重組將外源基因定點(diǎn)整合入靶細(xì)胞基因組上某一特定位點(diǎn)上，以達(dá)到定點(diǎn)修飾改造染色體上某一目的基因的一種技術(shù)。它包括如下主要步驟：①構(gòu)建重組載體；②重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi)；③篩選目的細(xì)胞；④轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。這種方法的出現(xiàn)克服了隨機(jī)整合的盲目性和偶然性，是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質(zhì)的方法。該項(xiàng)技術(shù)的誕生是分子生物學(xué)技術(shù)上繼轉(zhuǎn)基因技術(shù)后的又一革命。尤其是條件性、誘導(dǎo)性基因打靶系統(tǒng)的建立，使得對(duì)基因靶位時(shí)間和空間上的操作更加明確、效果更加精確、可靠，它的發(fā)展將為發(fā)育生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)及醫(yī)學(xué)等學(xué)科提供了一個(gè)全新的、強(qiáng)有力的研究、治療手段，具有廣泛的應(yīng)用前景。一、Cre-LoxP基因敲除系統(tǒng)基因敲除的重組載體系統(tǒng)主要有插入性載體系統(tǒng)和替換性載體系統(tǒng)。插入性載體系統(tǒng)構(gòu)建載體時(shí)主要包括：要插入的基因片段(目的基因)、同源序列片段、標(biāo)志基因片段等成分；替換性載體系統(tǒng)主要包括：同源序列片段、替換基因的啟動(dòng)子和報(bào)道基因等成分。Tsien等于1996年在《Cell》首先報(bào)道了第一個(gè)腦區(qū)特異性的基因敲除動(dòng)物，被譽(yù)為條件性基因敲除研究的里程碑。該技術(shù)以Cre/LoxP系統(tǒng)為基礎(chǔ)，因?yàn)镃re在哪種組織細(xì)胞中表達(dá)，基因敲除就能夠發(fā)生在哪種組織細(xì)胞中。下面就Cre-LoxP基因敲除系統(tǒng)的基本原理做簡要介紹。Cre-LoxP系統(tǒng)屬于傳統(tǒng)的同源重組載體,但是具有了時(shí)空調(diào)控的功能。它由Cre重組酶和LoxP位點(diǎn)兩部分組成。Cre重組酶于1981年從P1噬菌體中發(fā)現(xiàn)，屬于λInt酶超基因家族。Cre重組酶基因編碼區(qū)序列全長1029bp，編碼38kDa蛋白質(zhì)。是一種位點(diǎn)特異性重組酶，能介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)（序列）之間的特異性重組，使LoxP位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組。LoxP（locusofX-overP1）序列同樣來源于P1噬菌體，是有兩個(gè)13bp反向重復(fù)序列和中間間隔的8bp序列共同組成，8bp的間隔序列同時(shí)也確定了LoxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過程中與DNA共價(jià)結(jié)合，13bp的反向重復(fù)序列是Cre酶的結(jié)合域。當(dāng)兩個(gè)loxP序列方向相同并且位于同一條染色體上時(shí)，Cre編碼的重組酶蛋白能夠?qū)⑾嗤较虻膌oxP位點(diǎn)之間的核苷酸序列切除成為游離態(tài)，即有效切除兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間的核苷酸序列；當(dāng)兩個(gè)LoxP的序列相反時(shí)，Cre重組酶使兩個(gè)loxP序列顛倒，并且這兩種反應(yīng)處于一種平衡狀態(tài)；當(dāng)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上面時(shí)，Cre重組酶能夠介導(dǎo)兩條DNA的交換或促使染色體易位。Cre重組酶能識(shí)別34bp的部分回文的loxP序列，介導(dǎo)LoxP的34bp重復(fù)序列的位點(diǎn)特異性重組,切除同向重復(fù)的2個(gè)LoxP位點(diǎn)間的DNA片段和1個(gè)LoxP位點(diǎn)，同時(shí)保留1個(gè)LoxP位點(diǎn)，從而使兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間的序列發(fā)生特異性的重組或刪除。該特性從而使得Cre-Loxp系統(tǒng)廣泛用于條件性基因敲除的研究。圖11-4Cre-LoxP介導(dǎo)的基因表達(dá)啟動(dòng)或關(guān)閉機(jī)制Cre不僅可以識(shí)別LoxP的2個(gè)13bp的反向重復(fù)序列和8bp的間隔區(qū)域，而且當(dāng)一個(gè)13bp的反向重復(fù)序列或者8bp的間隔區(qū)發(fā)生改變時(shí)仍能識(shí)別并發(fā)生重組。利用這一特點(diǎn)，人們在進(jìn)行構(gòu)建載體時(shí)可以根據(jù)需要改造LoxP位點(diǎn)序列用于基因突變或修復(fù)，增加了該系統(tǒng)的應(yīng)用范圍。重組酶介導(dǎo)的盒式交換(recombinasemedi