具有拮抗效果細菌的篩選與鑒定

具有拮抗效果細菌的篩選與鑒定

大豆又名豆，是屬于一年生草本植物的豆類植物。在蕓豆種植過程中常遇到一些病害影響蕓豆的生長、產(chǎn)量和品質(zhì),嚴重者將導致蕓豆絕產(chǎn)。蕓豆病害主要有炭疽病、銹病、灰霉病、根腐病、細菌性疫病等。據(jù)美國《農(nóng)業(yè)研究》報道,蕓豆銹病病原菌為疣頂單胞銹菌[Uromycesappendiculatus(Pers.)Ung.],為擔子菌亞門真菌屬,是氣傳性真菌病害,一般夏秋兩季發(fā)生。本病主要發(fā)生在葉片上,也危害葉柄、莖和豆莢。當前從抗病育種、化學防治和農(nóng)業(yè)措施等方面做了大量工作,初見防病效果,但篩選抗病品種周期長,使用化學農(nóng)藥會帶來環(huán)境污染和誘導植株產(chǎn)生抗藥性。因而,開發(fā)利用新的生防菌被認為是最具發(fā)展?jié)摿Φ姆乐畏椒ㄖ?。以蕓豆銹病病原菌為指示菌,擬從蕓豆葉際篩選到對蕓豆銹病有拮抗作用的細菌,并對它們進行初步鑒定,旨在為農(nóng)業(yè)生防用菌貯備菌種資源。1材料和方法1.1材料表面1.1.1srdna的pcr擴增采用通用引物27F/1495R(正向引物:5′-agagtttgatcctggtcagaacgaacgct-3′;反向引物:5′-tacgggtaccttgttacgacttcacccc-3′)進行16SrDNA的PCR擴增。蕓豆健康植株,銹病植株。取樣時保留蕓豆根際周圍直徑10cm的土壤,以保持植株的生長狀態(tài)。1.1.2t保蛋白凝膠DNA提取緩沖液:0.15mol/LNaCl,0.1mol/LEDTA(pH8.0);SDS緩沖液:4%SDS,0.1mol/LNaCl,100μg/mL蛋白酶K;Tris飽和酚∶氯仿∶異戊醇(P∶C∶I):按體積比25∶24∶1配制混勻,4℃保存;氯仿∶異戊醇(C∶I):按體積比24∶1配制混勻,4℃保存;TE緩沖液:Tris·HCl,10mmol/L;ED-TA(pH8.0),1mmol/L。DNA聚合酶等分子生物學試劑購于寶生物大連有限公司(TaKaRaBiotechnology(Dalian)Co.,Ltd.),試劑配制方法參閱文獻。1.1.3培養(yǎng)基細菌分離用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(NA),病原菌培養(yǎng)和拮抗菌篩選用PDA固體培養(yǎng)基,細菌培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基。1.2去財產(chǎn)乙醇取銹病植株葉片1-2片,先用無菌水漂洗,以去除表面灰塵浮土;然后浸入75%的乙醇溶液消毒30-60s;再用無菌水漂洗數(shù)次,洗去葉面殘留乙醇。待葉面水分晾干后,用消毒的解剖刀切取黃豆大小病變組織,置于PDA平板培養(yǎng)基上,28℃恒溫培養(yǎng),待真菌菌落長出,觀察菌落特征及顯微觀察真菌孢子形態(tài),經(jīng)多次純化,得到銹病病原菌。1.3生長雙抗菌劑篩選通過梯度稀釋法,從蕓豆健康葉子中分離細菌,并采用傳統(tǒng)的平板對峙方法進行拮抗試驗,篩選出對蕓豆銹病具拮抗能力的細菌,記錄其編號,并分別轉(zhuǎn)接到LB斜面上保存?zhèn)溆谩?.4形態(tài)特征和生理生化特征的測定對拮抗細菌的菌落形態(tài),菌體細胞形態(tài)及部分生理生化性狀進行測定。1.5depch2o-pcr反應模板的制備方法參照文獻。PCR反應體系(25μL):Taq酶(5U/μL)0.5μL,10×Buffer(Mg2+)2.5μL,dNTPs(10mmol/Leach)0.5μL,引物各1μL,模板1μL,DepcH2O18.5μL。PCR反應程序為95℃預變性5min,94℃變性1min,56℃退火1min,72℃延伸1.5min,共30個循環(huán),72℃延伸10min;4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,溴化乙錠染色后,在UVP紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察照相。目的片段用申能博彩DNA小量快速純化試劑盒(3SSpinAgaroseGelDNApurificationkit)回收純化,經(jīng)pMD18-TVector(購自寶生物大連有限公司)連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細胞,挑取陽性克隆PCR驗證后,送樣測序,測序工作由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。1.61系統(tǒng)樹分析信度檢測測序結(jié)果用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST進行相似性分析,采用DNAMAN6.0程序進行多序列同源性分析。使用MEGA4.0(MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysisSoftwareVersion4.0)程序包,構(gòu)建InteriorBranchTestofPhylogeny中的Neighbor-JoiningTree,進化距離采用Jukes-Cantor算法,系統(tǒng)樹各分枝的置信度經(jīng)重抽樣法(Bootstrap)1000次重復檢測。2結(jié)果與分析2.1細菌分離結(jié)果梯度稀釋法從健康蕓豆植株葉片中分離出117株細菌。通過對峙試驗,共篩選出3株具有良好拮抗效果的細菌,記為SS2,L14b,NEW2。2.2菌株細胞的形態(tài)NEW2在LB平板上培養(yǎng)24h后呈菌落灰白色,邊緣不規(guī)則突起,不透明,有粘性。菌體細胞大小為(0.5-2.5)μm×(1.2-10)μm。產(chǎn)芽孢,G+,細胞桿狀。SS2在LB平板上培養(yǎng)24h后呈光滑,濕潤,不透明,乳白色,圓形,邊緣不齊,菌落較平。菌體細胞大小為(0.6-0.8)μm×(4-5)μm。產(chǎn)芽孢,G-,細胞桿狀。L14b在LB平板上培養(yǎng)24h后呈菌落乳白色,邊緣環(huán)狀突起,中心褶皺,不透明,有黏性。菌體細胞大小為(0.5-2.5)μm×(1.2-10)μm。產(chǎn)芽孢,G+,細胞直桿狀。3株菌的菌體形態(tài)如圖2所示。2.3抗感菌的生理生化特性2.41系統(tǒng)進化樹構(gòu)建16SrDNA純化產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳見圖3。將SS2,L14b,NEW2的16SrDNA序列提交GenBank,所得收錄號分別為EU771078、EU771076和EU771079。系統(tǒng)進化樹構(gòu)建結(jié)果見圖4。如圖4所示,SS2與Brevibacillusbrevis同處于一個最小的分支,進化距離最接近,其16SrDNA序列與B.brevis(EU812754)的相似性達99%,將SS2鑒定為短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis);L14b,NEW2與Bacillussubtilis同處于一個最小的分支,進化距離最接近,其16SrDNA序列與B.subtilis(EU257446)的相似性達100%,將L14b,NEW2鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。3ss2的生理生化特性將蕓豆葉際中分離得到117株細菌分離物,通過對峙蕓豆銹病病原菌[Uromycesappendiculatus(Pers.Ung.)],篩選到3株細菌SS2,L14b,NEW2具有較好拮抗效果。通過對其進行形態(tài)學觀察,生理生化測定,16SrDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析,初步鑒定SS2為短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis),L14b,NEW2為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。短短芽孢桿菌在生物防治領域的應用國內(nèi)外均有報道,該菌的抑菌機理主要是其可以產(chǎn)生短桿菌肽和幾丁質(zhì)酶等活性物質(zhì)。枯草芽孢桿菌由于其安全性和能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)的特性,已被廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。針對從蕓豆葉際篩選到的銹病拮抗菌,應用于蕓豆的生物防治,在生產(chǎn)中應具有易定殖的優(yōu)勢,同時為農(nóng)業(yè)生防用菌貯備了菌種資源。SS2