人參皂苷rg1促進(jìn)2型糖尿病大鼠肝臟組織pi3k磷酸化的研究

人參皂苷rg1促進(jìn)2型糖尿病大鼠肝臟組織pi3k磷酸化的研究

糖尿病是一種嚴(yán)重的非小體疾病，嚴(yán)重危害著人類健康。2003年全球糖尿病患者數(shù)量約1.3億人,其中90%以上為Ⅱ型糖尿病,而且每年以1%的速度遞增,目前我國(guó)已有4000萬(wàn)糖尿病患者,占全球總數(shù)的l/5,已成為繼心腦血管疾病及腫瘤之后,嚴(yán)重威脅人類健康的第3大疾病。胰島素抵抗不僅是Ⅱ型糖尿病發(fā)病的重要原因和病理基礎(chǔ),同時(shí)與Ⅱ型糖尿病的許多并發(fā)癥及代謝紊亂綜合征密切相關(guān)。1材料和方法1.1動(dòng)物1.1.1調(diào)查生活環(huán)境雄性60只,體重:220g左右,中科院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,批號(hào):scxk(滬)2003-0003隨機(jī)分成6組,每組10只,籠養(yǎng)一周,以適應(yīng)環(huán)境。第二周開(kāi)始,除正常組外,每組用高脂飼料(該飼料中含有59%的脂肪,20%的碳水化合物,21%的蛋白質(zhì)),喂養(yǎng),自由取食,每只每天18g,喂養(yǎng)二周后,開(kāi)始給藥,對(duì)照組予羅格列酮每天6mg/kg,灌胃,Rg1、Rb1、Re各組每天50mg/kg,灌胃,連續(xù)灌服2周,給藥期間,各組仍予高脂飼料喂養(yǎng),自由取食,每天稱量體重。1.1.2提交材料大鼠取肝臟組織、下肢肌肉組織、皮下脂肪各一塊,以液氮冷凍后,存儲(chǔ)予低溫冰箱(-70℃)備用。1.2聚丁酯glut4人參皂苷Re,060312,1100mg,人參皂苷Rb1,060721,1100mg,人參皂苷Rg1,070309,1100mg均為90%的純度(吉林大學(xué)有機(jī)教研室提供),馬來(lái)酸羅格列酮,規(guī)格,4mg/片07030088(葛蘭素史克公司),葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(Glut4)一抗,磷酯酰肌醇3激酶(PI3K),(CellSignalingTechnology提供),羊抗大鼠二抗、羊抗兔二抗(ICL實(shí)驗(yàn)室提供)蛋白酶抑制劑(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)。1.3方法1.3.1蛋白酶抑制劑的制備稱取100mg組織置于10mL試管中,按正常組、高脂組、對(duì)照組、Rb1組、Re組、Rg1組分別做好標(biāo)記,加入1mL裂解液,于冰上勻漿。將組織勻漿液迅速移入加40uL蛋白酶抑制劑的試管,混勻后,4℃,12000r/min,離心15min。取上清至另一1.5mL試管中,-70℃保存2天,解凍,同上離心10min,取上清,將樣本配制成蛋白量含量為50ug/16uL,-70℃的冰箱內(nèi)貯藏備用。1.3.2tps的配伍規(guī)則采用SDS膠,10%下層膠10mL(水、30%丙烯酰胺、1.5MTRIS(PH8.8)、10%SDS、10%過(guò)硫酸銨、TEMED)4%上層膠4mL(水、30%丙烯酰胺、1MTRIS(PH6.8)、10%SDS、10%過(guò)硫酸銨、TEMED)按實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)比例配伍。1.3.3上樣本的制備將混合樣本在100℃的水浴中變性5min,再在冰上冷凍5min,然后放入離心機(jī)離心2min,即得上樣樣本。待凝膠固定后,將凝膠放入電泳槽,小心拔出梳子,上樣,在100V恒定電壓下跑電泳約2.5h。1.3.4膜的變化待電泳結(jié)束,將膠取下,放在轉(zhuǎn)膜夾上,貼上膜,將做了標(biāo)記的一面緊貼膠。將轉(zhuǎn)膜夾放入轉(zhuǎn)膜槽中轉(zhuǎn)膜,恒定電流300mA,1h。1.3.5封閉1.3.6洗好膜,稀釋二抗2:500將封閉好的膜放在稀釋好的一抗(1:1000)中,4℃過(guò)夜。洗膜3次,5min,5min,15min。將洗好的膜放在稀釋好的二抗(1:500)中常溫,1h。洗膜3次,5min,5min,15min。1.3.7壓塊投影定影將洗好的膜在ECL液中完全浸透1min,放入暗盒,壓片10min后,顯影5min出條帶后,用清水漂洗在定影液中。1.4統(tǒng)計(jì)方法用SPSS11.5做統(tǒng)計(jì)學(xué)統(tǒng)計(jì),各組間采用方差分析,用表達(dá)。2結(jié)果2.1大鼠體重和體重增加的檢測(cè)見(jiàn)表1、圖1。從表1和圖1可見(jiàn),Re組、Rg1組和對(duì)照組的體重增加較正常組、高脂組有增高趨勢(shì),Rb1組的體重增加較少,接近于與正常組的體重,表明人參皂苷Rb能減輕大鼠體重的增加,而Rg、Re和羅格列酮不抑制大鼠體重的增加。2.2glut4引起胰島素抵抗的可能機(jī)制見(jiàn)表2、圖2~4。從表2和圖2上可以看出Rg1組的蛋白表達(dá)要比Rb1組、Re組、高脂組、對(duì)照組和正常組有顯著性差異,P<0.05,Rb1組、Re組與對(duì)照組的蛋白表達(dá)相近,但高于高脂組,接近正常組的蛋白表達(dá)。說(shuō)明人參皂苷Rg1在肝臟組織中能促進(jìn)PI3K的磷酸化,在肝臟組織中人參皂苷Rg1的抗胰島素抵抗作用要優(yōu)于Rb1組、Re組和對(duì)照組;而Rb1組、Re組和對(duì)照組在肝臟組織中僅有促進(jìn)PI3K磷酸化的趨勢(shì),高于高脂組,說(shuō)明人參皂苷在肝臟組織中有顯著的促進(jìn)PI3K磷酸化的作用。從表2和圖3、圖4上可以看出在肌肉組織中Rb1組的蛋白表達(dá)和Re組、Rg1組、高脂組、對(duì)照組和正常組有顯著性差異P<0.05,Re、Rg組、對(duì)照組高于高脂組的蛋白表達(dá),接近于正常組的蛋白表達(dá),提示人參皂苷在肌肉組織中能促進(jìn)GLUT4的表達(dá),促進(jìn)外周組織對(duì)葡萄糖的利用度,且Rb1、Rg1的這種作用明顯優(yōu)于羅格列酮對(duì)照組P<0.05。在脂肪組織中Rb1組的蛋白表達(dá)和Re組、Rg1組、高脂組和對(duì)照組有顯著性差異P<0.05,接近于正常組的蛋白表達(dá),Rg1組和Re組相近,對(duì)照組的蛋白和其他各組有顯著性差異。提示人參皂苷可顯著提高胰島素受體(SRI)的信號(hào)通路,促進(jìn)胰島素受體的磷酸化,同時(shí),可有效促進(jìn)PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)下游的葡萄糖攝取和轉(zhuǎn)運(yùn),雖然在脂肪組織中表現(xiàn)出趨勢(shì),但在肌肉組織中表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用,且這種作用較羅格列酮明顯增加。胰島素抵抗(insulinresistance,IR)是指胰島素維持正常血糖的能力下降,其產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)低于正常水平,或組織對(duì)胰島素的反應(yīng)性下降。大量研究已證明胰島素抵抗是Ⅱ型糖尿病的主要病理生理特征,而細(xì)胞膜上葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白體4(GLUT4)含量降低是發(fā)生IR的重要原因之一。GLUT4引起胰島素抵抗的可能機(jī)制有:(1)GLUT4的表達(dá)量減少,Tozzo等研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者中,脂肪細(xì)胞所表現(xiàn)出的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)與GLUT表達(dá)量減少密切相關(guān)。(2)GLUT4內(nèi)在活性降低,研究表明存在胰島素刺激時(shí),GLUT4去磷酸化改變自身構(gòu)象,把葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi);而胞漿內(nèi)鈣離子濃度的升高則可使GLUT4發(fā)生磷酸化反應(yīng),抑制其轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的活性。(3)GLUT4的基因表達(dá)受到抑制,MichaelGaster等在對(duì)Ⅱ型糖尿患者和正常人骨骼肌進(jìn)行對(duì)比研究時(shí)得出結(jié)論:慢肌纖維比例的減少,及慢肌纖維中GLUT4表達(dá)的減少是骨骼肌產(chǎn)生胰島素抵抗的原因之一。(4)GLUT4易位障礙,Seung等試驗(yàn)表明mtDNA衰竭引起的IR是因?yàn)闇p少了IRS-1的表達(dá),從而導(dǎo)致GLUT4易位到質(zhì)膜的障礙。鑒于GLUT4引起胰島素抵抗的眾多可能機(jī)制,本研究選取GLUT4為首選目的蛋白,但由于GLUT4僅存在于胰島素敏感的骨骼肌、心肌和脂肪細(xì)胞中,本次實(shí)驗(yàn)只將肌肉組織和脂肪組織采用GLUT4做為目的蛋白,而在另一個(gè)胰島素抵抗敏感組織——肝臟組織,則采用磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)做為目的蛋白,因?yàn)镻I3K是許多生命活動(dòng)中關(guān)鍵的信號(hào)分子,PI3K介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂、分化、凋亡等活動(dòng)。IRS的磷酸化為下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白提供了一個(gè)高親和力結(jié)合位點(diǎn),通過(guò)與磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的P85亞基結(jié)合并招募其催化亞基P110而激活PI3K,繼而激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt或蛋白激酶B(PKB),最終導(dǎo)致GLUT4轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上,攝取葡萄糖。人參作為一味補(bǔ)虛良藥,具有補(bǔ)脾益肺、生津,自古就被用于“消渴”病的治療,早在《別錄》中就提到其可以“止消渴”,至今人參仍然是中醫(yī)臨床治療糖尿病(尤其是2型糖尿病)的常用藥。近年來(lái)隨著中藥藥理學(xué)研究的不斷深入,有關(guān)人參及其提取物對(duì)血糖水平的調(diào)節(jié)逐漸得到認(rèn)識(shí)。如部分研究認(rèn)為人參的提取物對(duì)四氧嘧啶等造成的糖尿病動(dòng)物模型具有調(diào)節(jié)血糖的作用,而另一部分研究證實(shí)人參的有效成分人參皂苷對(duì)糖尿病患者的免疫功能具有調(diào)節(jié)作用。而其中的人參皂苷Rb1,Rg1和Re,都是被認(rèn)為具有調(diào)節(jié)血糖作用。有研究表明,嚙齒類動(dòng)物及人類在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下,GLUT4的表達(dá)顯示明顯的組織特異性調(diào)節(jié),即在脂肪細(xì)胞中表達(dá)下降,但在骨骼肌中則被保護(hù)。羅格列酮具有良好的胰島素增敏作用,能增加肌組織UCP-3、肝臟UCP-2的基因表達(dá),表明它增敏的作用可能與肌組織UCP-3表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。羅格列酮治療后雖可引起體重增加,但這種增加不以內(nèi)臟脂肪增加為主,可能和皮下脂肪增加有關(guān)。與我們的研究結(jié)果相符,人參皂苷Rg1組和正常組、高脂組、對(duì)照組、Re組、Rb1組有顯著性差異,Rb1組、Re組也較高脂組有顯著性差異,能促使PI3K在肝臟中的磷酸化,在肌肉組織中對(duì)照組、Rb1組、Rg1組、Re組與高脂組都有顯著性差異,而與正常組無(wú)顯著性差異,提示人參皂苷在肌肉組織中能促進(jìn)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn),在脂肪組織中,GLUT4在脂肪細(xì)胞中的表達(dá)下降,高脂組與Rb1組、Rg1組、Re1組相近