藤茶總黃酮和二氫楊梅素含藥血清對(duì)hepg2增殖的抑制作用

藤茶總黃酮和二氫楊梅素含藥血清對(duì)hepg2增殖的抑制作用

藤蔓茶系植物的顯齒蛇（handma薩爾）w.t.wang莖葉主要分布在廣西、湖南、湖北等地。它很甜，可以清熱解毒。主要治療黃黃疸、肝炎、感冒、咽喉嚨痛等?；瘜W(xué)成分分析表明藤茶富含黃酮類化合物,總黃酮達(dá)40%,其主要成分二氫楊梅素(dihydromyricetin)含量高達(dá)25%,藥理實(shí)驗(yàn)證明藤茶總黃酮及其主要成分二氫楊梅素具有鎮(zhèn)痛、降血壓、降血脂、降血糖、抑制腫瘤等多種功效。但藤茶總黃酮和二氫楊梅素對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的影響尚未有報(bào)道。本文擬觀察藤茶總黃酮和二氫楊梅素含藥血清對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的影響。1材料表面1.1氫楊素3.藤茶總黃酮由本課題組提取分離(39.8%,其中二氫楊梅素為3.14%);二氫楊梅素(張家界湘匯生物有限責(zé)任公司,純度98.5%,批號(hào)07031601),用前配制成所需濃度的混懸液;環(huán)磷酰胺(山西普德藥業(yè)有限公司,批號(hào)20080703)。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及動(dòng)物雄性Wistar大鼠,體重180~220g,購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào)SCXK(D)2008-0026。人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自上海復(fù)蒙基因生物科技有限公司。1.3藥物和微生物高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司);胚胎牛血清(FBS,Hyclone公司);青霉素-鏈霉素(哈藥集團(tuán)制藥六廠);四甲基噻唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司);0.25%胰蛋白酶(Amresco公司);AnnexinV/7AAD細(xì)胞凋亡試劑盒(BDpharmingenTM公司)。1.4檢測(cè)顯微組織dmiiilTheymoForma381型CO2培養(yǎng)箱(美國(guó));DMIIL倒置顯微鏡(德國(guó));Bioek標(biāo)儀(德國(guó));細(xì)胞培養(yǎng)瓶(加拿大BIOFIL公司);96孔板(美國(guó)CORNNG公司)。2方法2.1灌胃給藥,多次給藥取健康大鼠20只,分為空白對(duì)照組(蒸餾水),環(huán)磷酰胺組(30mg·kg-1·d-1),總黃酮組(600mg·kg-1),二氫楊梅素組(600mg·kg-1),均灌胃給藥,每天2次,連續(xù)3d。于第4天灌胃2h后,腹主動(dòng)脈取血,分離血清,于56℃溫育30min滅活,0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后分裝,置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2hepg2細(xì)胞培養(yǎng)2.3高糖dmem培養(yǎng)液制備取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化后,用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液稀釋至8×104個(gè)/mL,接種于96孔培養(yǎng)板,200μL/孔,待細(xì)胞貼壁后吸棄培養(yǎng)液,分別加入含10%,20%,30%空白鼠血清和10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液,調(diào)零孔不加細(xì)胞,只加200μL完全培養(yǎng)液。常規(guī)培養(yǎng)24,48,72h后,于每孔中加入MTT溶液(5g·L-1)20μL繼續(xù)培養(yǎng)4h,終止培養(yǎng)后,小心吸棄孔中液體,加入DMSO150μL/孔,微型震蕩器震蕩約15min,使結(jié)晶物充分溶解后,于酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)處,測(cè)定各孔吸光度A。2.4血清dmem培養(yǎng)液的測(cè)定操作同2.3,待細(xì)胞貼壁后吸棄培養(yǎng)液,分別加入含10%,20%含藥血清和空白鼠血清的高糖DMEM培養(yǎng)液,同上法測(cè)定各孔吸光度度A。抑制率=(1-A含藥血清組/A空白鼠血清組)×100%。2.5細(xì)胞毒性試驗(yàn)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化后,用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液稀釋至4×104個(gè)/mL,于50mL的培養(yǎng)瓶中,待細(xì)胞貼壁后吸棄培養(yǎng)液,用含20%的含藥血清處理72h后,直接置于顯微鏡下觀察。2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞計(jì)數(shù)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化后,用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液稀釋至8×104個(gè)/mL,于50mL的培養(yǎng)瓶中,待細(xì)胞貼壁后吸棄培養(yǎng)液,用含20%的含藥血清處理72h后胰酶消化,PBS洗滌2次,細(xì)胞計(jì)數(shù)收集約1×105個(gè)細(xì)胞,按AnnexinV/7AAD雙標(biāo)記試劑盒操作進(jìn)行,1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。2.7數(shù)據(jù)計(jì)數(shù)和指標(biāo)分析應(yīng)用SPSS10.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示,抑制率的組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1空白鼠血清加入量選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果空白鼠血清加入量為30%時(shí),作用3個(gè)時(shí)間段的吸光度值與10%胎牛血清組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;空白鼠血清加入量為10%和20%時(shí),作用3個(gè)時(shí)間段的吸光度值與10%胎牛血清組的吸光度值相近,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故選取培養(yǎng)液體積的10%和20%作為鼠血清的加入量,以使細(xì)胞能夠處于正常的生長(zhǎng)增殖狀態(tài)(表1)。3.2含藥血清的環(huán)磷酰胺對(duì)hepg細(xì)胞增殖的抑制率含10%含藥血清的總黃酮組和二氫楊梅素組作用48h和72h后對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)均具有一定的抑制作用,但作用24h對(duì)細(xì)胞無(wú)抑制作用。含20%含藥血清的總黃酮組和二氫楊梅素組作用3個(gè)時(shí)間段(24,48,72h)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制率具有明顯的抑制作用,作用72h時(shí)抑制率分別達(dá)25.73%,23.67%。含20%含藥血清的環(huán)磷酰胺組作用3個(gè)時(shí)間段(24,48,72h)對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用,但含10%含藥血清的環(huán)磷酰胺作用24h和48h對(duì)細(xì)胞基本沒有抑制作用,而72h后有一定的抑制作用。含10%和20%含藥血清的二氫楊梅素組作用96h后與相應(yīng)空白組比較有明顯的抑制作用,但其余各組含藥血清組無(wú)明顯作用。故選取培養(yǎng)液體積的20%作為鼠血清的加入量,作用72h,以表現(xiàn)出明顯的對(duì)細(xì)胞的增殖的抑制作用(表2)。3.3hepg2細(xì)胞凋亡特征見表1培養(yǎng)72h的含10%胎牛血清組和含20%鼠血清空白對(duì)照組HepG2細(xì)胞呈梭形或多角形,貼壁生長(zhǎng),輪廓清晰,生長(zhǎng)旺盛,可見清晰細(xì)胞核,但空白對(duì)照組處理過(guò)的細(xì)胞易成堆生長(zhǎng);而環(huán)磷酰胺含藥血清組、總黃酮含藥血清組和二氫楊梅素含藥血清組HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不佳,逐漸出現(xiàn)細(xì)胞凋亡特征的形態(tài)學(xué)變化(圖1)。表現(xiàn)為:貼壁疏松,形態(tài)變圓,細(xì)胞體積縮小,輪廓不清,細(xì)胞內(nèi)可見空泡增多,增殖減慢,胞質(zhì)中顆粒增多,脫落細(xì)胞增多,有的細(xì)胞膜已經(jīng)破裂并有細(xì)小顆粒狀物質(zhì)釋放,細(xì)胞密度降低。3.4環(huán)磷酰胺和藤茶總黃酮對(duì)hepg2細(xì)胞凋亡率的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示,經(jīng)含20%的血清各組,作用72h處理過(guò)的HepG2細(xì)胞,環(huán)磷酰胺組和藤茶總黃酮組的早期凋亡率與同一作用時(shí)間的對(duì)照組比較,有顯著差異(表3,圖2)。4藤茶總黃酮和二氫楊素對(duì)hepg2細(xì)胞增殖的影響血清藥理學(xué)是近年來(lái)開展的一種新的體外實(shí)驗(yàn)方法,它將受試藥經(jīng)口給予動(dòng)物后,取其血清作為藥物源加入離體反應(yīng)系統(tǒng)中研究藥理作用,比較接近藥物在體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥理效應(yīng)的真實(shí)過(guò)程,其原有成分或在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性成分,或代謝后失活,或沒有被吸收入體內(nèi),或通過(guò)第2信使而間接起作用都可以通過(guò)血清藥理學(xué)反映出來(lái)。其可信度﹑科學(xué)性﹑可行性都較以往應(yīng)用中藥粗制劑直接體外給藥進(jìn)行中藥藥理研究具有一定的優(yōu)勢(shì),不僅反映了藥物中可吸收部分的直接作用,而且能反映藥物成分在機(jī)體作用下形成的代謝產(chǎn)物和藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)的間接效果。近年來(lái)用血清藥理學(xué)進(jìn)行體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)越來(lái)越多,而腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞增殖分化異常及其凋亡受抑制有關(guān),腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞存活與凋亡的平衡失調(diào),存活大于凋亡,則腫瘤細(xì)胞數(shù)目增加。因此,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤防治的重要手段。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)總黃酮和二氫楊梅素對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖具有不同程度的抑制作用,其抑制率呈現(xiàn)時(shí)間依賴性;倒置顯微鏡觀察證實(shí),經(jīng)總黃酮和二氫楊梅素處理后的HepG2細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,出現(xiàn)凋亡特征,AnnexinV/7AAD雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)藤茶總黃酮具有誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞早期凋亡的作用,但二氫楊梅素沒有該作用,提示藤茶總黃酮誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞早期凋亡的作用