實(shí)驗(yàn)八 食品蛋白質(zhì)含量測定

[鍵入文字]PAGEPAGE1實(shí)驗(yàn)八食品中蛋白質(zhì)含量測定實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?）學(xué)習(xí)凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的原理。（2）掌握凱氏定氮法的操作技術(shù)，包括樣品的消化處理、蒸餾、滴定及蛋白質(zhì)含量計(jì)算等。2.實(shí)驗(yàn)原理2.1消解蛋白質(zhì)是含氮的化合物。食品與濃硫酸在催化劑作用下共同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨而留在消化液中，然后加堿蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量來乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，即得蛋白質(zhì)含量。因?yàn)槭称分谐鞍踪|(zhì)外，還含有其它含氮物質(zhì)，所以此蛋白質(zhì)稱為粗蛋白。NH2(CH2)2COOH+13H2SO4=(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O濃硫酸將有機(jī)物炭化后為碳、氫與氮，將形成的碳氧化：2H2SO4+C（Δ）=CO2+2H2O+2SO2↑生成的二氧化硫?qū)⒀趸瘧B(tài)的氮還原為氨而自身被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸反應(yīng)生成硫酸銨，H2SO4+2NH3=(NH4)2SO4在消解試驗(yàn)中，為了加速蛋白質(zhì)的分解，縮短消解時(shí)間，常常加入下列物質(zhì)：（1）硫酸鉀：一般濃硫酸的沸點(diǎn)為340℃，但加入硫酸鉀后，硫酸不斷分解，水不斷溢出引起硫酸鉀濃度不斷增加，沸點(diǎn)因此而增加。K2SO4+H2SO4=KHSO4KHSO4（Δ）=K2SO4+H2O↑+SO3但硫酸鉀濃度不能太大，否則消化溫度過高會(huì)引起銨鹽的熱分解而釋放出氨，（NH4）2SO4（Δ）=（NH4）2SO4+NH3↑2KSO4（Δ）=2H2O+2NH3↑+2SO3↑除了可以添加硫酸鉀之外，也可以加入硫酸鈉、氯化鉀等以提高溶液溫度，但效果要差于硫酸鉀。（2）硫酸銅：硫酸銅可以催化反應(yīng)。可以采用的催化劑除了硫酸銅外，還可以加入氧化汞、汞、硒粉以及二氧化鈦等，但考慮效果、價(jià)格以及污染等原因外，最常用的還是硫酸銅，同時(shí)可以加入少量的過氧化氫、次氯酸鉀等作為氧化劑以加速有機(jī)物的氧化，反應(yīng)機(jī)理為：2CuSO4（Δ）=Cu2SO4+O2↑+SO2↑C+CuSO4（Δ）=Cu2SO4+CO2↑+SO2↑H2SO4+Cu2SO4（Δ）=2CuSO4+2H2O↑+SO2↑此反應(yīng)不斷進(jìn)行，如溶液沒有褐色生成（Cu2SO4顏色）而呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色，說明有機(jī)物已經(jīng)全部被消解完畢。因此，在試驗(yàn)過程中，硫酸銅不但能夠催化反應(yīng)，而且能夠指示反應(yīng)的進(jìn)行程度。2.2堿化蒸餾在消解完全的樣品溶液中加入過量的濃的氫氧化鈉溶液使溶液呈現(xiàn)堿性，加熱蒸餾而放出氨氣：2NaOH+（NH4）2SO4（Δ）=Na2SO4+2H2O+2NH3↑2.3吸收與滴定將加熱蒸餾釋放出來的氨利用硼酸溶液進(jìn)行吸收，因硼酸屬于弱酸，其后再用鹽酸進(jìn)行滴定：2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+5H2O+2HCl=2NH4Cl+4H3BO3除此之外，也可以用過量的鹽酸或者硫酸吸收整流而出的氨氣，然后再用氫氧化鈉進(jìn)行回滴。3.儀器及材料 3.1儀器FOSSKjelitecTM2100自動(dòng)定氮儀（含digestor2006消化爐、消化管），酸式滴定管，三角瓶3.2試劑硫酸銅（CuSO4·5H20），硫酸鉀，濃硫酸（密度為1.84g/ml），硼酸溶液（20g/L），氫氧化鈉溶液（400g/L），0.01mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液，混合指示試劑：0.1%甲基紅乙醇溶液液：0.1%溴甲酚綠乙醇溶液=1:53.3材料脫脂奶粉3.4注意事項(xiàng)（1）樣品的取用量應(yīng)適中，以免影響后續(xù)反應(yīng)。（2）加入的催化劑硫酸鉀和硫酸銅的配比適宜。（3）催化劑的添加量一定要準(zhǔn)確，否則催化速度不一致，導(dǎo)致反應(yīng)程度和揮發(fā)的氨不一樣，誤差大。（4）消化過程中消化的時(shí)間應(yīng)該充分，確保消化完全，消化至溶液呈現(xiàn)透明的淺藍(lán)色。（5）消化后要將液體充分冷卻，定容到容量瓶中備用。（6）消化之前檢查凱氏定氮儀氣密性良好，后用蒸餾水清洗凱氏定氮儀，要充分清洗。（7）消化過程中，加堿液后要迅速關(guān)閉進(jìn)樣口，防止反應(yīng)放出的氨氣逸出。（8）消化過程中，火焰的溫度要適當(dāng)，太小加熱過慢，太大容易導(dǎo)致溶液暴沸甚至從進(jìn)氣口溢出。實(shí)驗(yàn)步驟稱取黃豆粉約0.3～0.5g，移入干燥的消化瓶中→加入0.2g硫酸銅和6g硫酸鉀→加入10mL濃硫酸→消化（440oC）至液體呈藍(lán)綠色澄清透明→繼續(xù)加熱0.5h→空蒸定氮裝置2次→消化液堿化蒸餾（加堿40mL，時(shí)間3-4min，三角瓶中加20mL20g/l的硼酸溶液和3-4滴混合指示劑）→取出三角瓶→標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定（藍(lán)色變?yōu)槲⒓t色）→記錄數(shù)據(jù)→計(jì)算結(jié)果與分析5.1計(jì)算公式式中：X——樣品蛋白質(zhì)含量（g/100g）；V1——樣品滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）；V2——空白滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）；c——鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度（mol/L）；0.0140——1.0mL鹽酸[c(HCL)=1.000mol/L]標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量（g）；m——樣品的質(zhì)量（g）；F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，一般食物為6.25；乳制品為6.38；面粉為5.70；高梁為6.24；花生為5.46；米為5.95；大豆及其制品為5.71；肉與肉制品為6.25；大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83；芝麻、向日葵5.30。計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。5.2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)樣品質(zhì)量/g滴定用鹽酸體積/ml蛋白質(zhì)含量%空白(-)(-)1.55(-)樣品10.19308.3031.220.416315.1529.2(SD=1)由計(jì)算結(jié)果可得：樣品蛋白質(zhì)含量為30.2g/100g。討論與心得6.1思考題6.1.1實(shí)驗(yàn)操作過程中，影響測定準(zhǔn)確性的因素有哪些？答：凱氏定氮儀測定蛋白質(zhì)含量的誤差來源可能是樣品、催化劑種類和用量、消化的時(shí)間、加堿液后的操作、蒸餾加熱、清洗凱氏定氮儀的過程、凱氏定氮儀的氣密性、氨氣是否完全蒸餾出來；硼酸是否封住蒸餾管口、試劑的準(zhǔn)確性、滴定終點(diǎn)的判斷、滴定鹽酸的濃度準(zhǔn)確性等。6.1.2濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅的作用是什么？答：（1）濃硫酸：氧化劑，分解蛋白質(zhì)成氨氣和其他成分。（2）粉末硫酸鉀-硫酸銅混合物（K2SO4:CuSO4·5H2O=3:1）：充當(dāng)催化劑，硫酸鉀可以提高消化液的沸點(diǎn)，硫酸銅作為催化反應(yīng)的主要成分。6.1.3在鹽酸滴定過程中，能否使用酚酞作為指示劑？為什么？答：質(zhì)量分?jǐn)?shù)比5:1的溴甲酚綠—甲基紅指示劑的變色范圍為：pH5.2以上時(shí)，藍(lán)綠色；pH5.0時(shí)，淡紫灰到淡藍(lán)色；pH4.8時(shí)，帶淡藍(lán)色的淡粉紅色；pH4.6時(shí)，淡粉紅。以溴甲酚綠—甲基紅作指示劑滴定水樣堿度時(shí)，終點(diǎn)為淡藍(lán)色變?yōu)榈奂t色時(shí)，報(bào)告的終點(diǎn)pH可記為4.6。酚酞的變色范圍是8.2～10.0，所以酚酞只能檢驗(yàn)堿而不能檢驗(yàn)酸。實(shí)驗(yàn)需保證滴定終點(diǎn)時(shí)堿被完全中和，故不使用酚酞試液，而是用溴甲酚綠—甲基紅混合指示劑。這樣可以使滴定終點(diǎn)更為準(zhǔn)確。6.2實(shí)驗(yàn)心得這是第八次進(jìn)行食品分析與檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)課程。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容是掌握凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量。其中我主要學(xué)會(huì)了用FOSSKjelitecTM2100自動(dòng)定氮儀以及凱氏定氮法測食品的蛋白質(zhì)含量的基本操作技術(shù)，掌握了相關(guān)實(shí)驗(yàn)測定條件的選擇，這在以后的食品分析與檢驗(yàn)試驗(yàn)中是很有用的。在實(shí)驗(yàn)過程中我組成員各有分工，尤其注意了精確觀察讀數(shù)記錄、滴定過程的細(xì)致操作等一系列基本操作。實(shí)驗(yàn)全程我們嚴(yán)格按照規(guī)范操作，取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這門課程作為專業(yè)課程的配套實(shí)驗(yàn)，這