蜂房提取物的抑菌活性研究

蜂房提取物的抑菌活性研究

現(xiàn)代蟲象生態(tài)理論認(rèn)為，蟲象的發(fā)生是正?？谇痪M的平衡造成的，并將生態(tài)生理組合轉(zhuǎn)變?yōu)椴±砘衔?。根?jù)該理論,齲病預(yù)防的途徑是通過調(diào)節(jié)口腔生態(tài)平衡,恢復(fù)口腔生態(tài)的生理性組合。因此,尋找安全而又有效的生態(tài)調(diào)節(jié)制劑已成為齲病防治研究的重點(diǎn)。天然藥物包括植物藥、動(dòng)物藥和礦物藥等,其來源豐富,取材方便,用法簡單,療效顯著且副作用甚微,是重要的生態(tài)調(diào)節(jié)藥物。黃正蔚等研究發(fā)現(xiàn),五倍子和蜂房的抑齲能力較強(qiáng),即使在不影響各實(shí)驗(yàn)菌株生長的較低濃度下也可有效抑制產(chǎn)酸;在生物膜模型中隨著蜂房提取物溶液的加入,顯著減少了變形鏈球菌在羥磷灰石片上粘附的量,通過掃描電鏡的觀察也發(fā)現(xiàn)出胞外基質(zhì)明顯減少,提示蜂房溶液的加入可能對菌斑的致齲化轉(zhuǎn)變有一定的抑制作用。但是目前的研究都只停留于使用蜂房的粗提物,如丙酮提取物,醇提物,劑型粗糙,對蜂房的抗齲性能活性成分還未見具體報(bào)道,該實(shí)驗(yàn)擬采用現(xiàn)代化的分離方法,對蜂房抑齲有效成分進(jìn)行追蹤。1材料和方法1.1蜂房及蜂房組分的分離稱取蜂房10kg,以95%乙醇浸漬后滲漉,得到95%乙醇滲漉液和殘?jiān)?5%乙醇滲漉液濃縮至稠膏,加水以乙酸乙酯萃取,再將萃取液用硅膠柱層析分離,得到3個(gè)組分,分別為蜂房組分1(NVE1),蜂房組分2(NVE2),蜂房組分3(NVE3)。將95%乙醇滲漉液的殘?jiān)^續(xù)以56%乙醇滲漉,濃縮,得到蜂房組分4(NVE41)。蜂房提取物1、2和3中含有較多的甾醇類化合物,其中蜂房1內(nèi)有可分離鑒定到α-谷甾醇,蜂房3內(nèi)有可分離鑒定到α-胡蘿卜甙。1.2菌株和培養(yǎng)基變形鏈球菌S.mutansATCC25175,血鏈球菌S.sanguisATCC10556,唾液鏈球菌S.salivariusSS196,內(nèi)氏放線菌A.naeslundirWVU627,粘性放線菌A.viscosusATCC19246,乳酸桿菌L.rhamnosusAC413由教育部口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。將復(fù)蘇48h的菌種接種于TPY液體培養(yǎng)基中,80%N2,20%CO2,37℃下厭氧培養(yǎng)18h,涂片檢查為純培養(yǎng)后將菌液在4℃下3000r/min離心15min,收集細(xì)菌,無菌生理鹽水洗菌2次,并用無菌生理鹽水調(diào)整,使菌懸液540nm處吸光度A=1.0。1.3最低藥物濃度測定使用96孔板法測定藥物對6種細(xì)菌的MICO將蜂房精提物及各不同組分按對倍稀釋法溶于含1%葡萄糖的TPY液體培養(yǎng)基中,使其生藥終濃度達(dá)到32.000、16.000、8.000和4.000mg/ml。按菌液與TPY液體培養(yǎng)基1∶1(v/v)比例分別接種細(xì)菌懸液于96孔板中,80%N2,20%CO2,37℃下厭氧培養(yǎng)48h。以肉眼觀察無細(xì)菌生長的最低藥物濃度為其MIC值。結(jié)果見表1。1.4生長曲線的繪制使用活菌計(jì)數(shù)法測量蜂房精提物及各組分對變形鏈球菌生長曲線的影響。將蜂房精提物及各組分配制成為含有蜂房藥物的TPY液體培養(yǎng)基,濃度為8mg/ml。將復(fù)蘇48h的菌種接種于TPY液體培養(yǎng)基中,80%N2,20%CO2,37℃下厭氧培養(yǎng)18h,涂片檢查純培養(yǎng)后使用比濁儀,調(diào)整菌懸液最終濃度達(dá)到5×107CFU/ml,按菌懸液與TPY液體培養(yǎng)基1∶10(v/v)比例將細(xì)菌接種于含有蜂房藥物的TPY液體培養(yǎng)基中,80%N2,20%CO2,37℃下厭氧培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)5、10、30min及1、2、4、6、20和24h提取菌液,PBS緩沖液梯度稀釋后取5μl菌液接種于TPY固體培養(yǎng)基上,80%N2,20CO2,37℃下厭氧培養(yǎng)48h后計(jì)算活菌數(shù),用菌落形成單位數(shù)(CFU/ml)的對數(shù)(log)為縱坐標(biāo),時(shí)間為橫坐標(biāo),作圖繪制生長曲線。活菌計(jì)數(shù)減少99.9%即差異>3logCFU/ml者視為有殺菌作用,活菌計(jì)數(shù)下降1～3logCFU/ml者視為有抑菌作用。2結(jié)果2.1蜂窩提取物和各種組成對細(xì)菌生長的影響從表1可以看出,蜂房提取物組分1和組分2對實(shí)驗(yàn)菌株的抑制作用較蜂房提取組分3、組分4更強(qiáng)。2.2蜂窩提取物和各種組成部分對變形鏈生長曲線的影響從圖1可以看到蜂房提取物組分1、2和3均能在較短時(shí)間抑制變形鏈球菌的生長,其中蜂房提取物組分3對于細(xì)菌生長的抑制作用最強(qiáng)。3蜂房提取物對變形鏈球菌生長曲線的影響研究表明,許多天然藥物都具有較強(qiáng)的防齲作用,如茶多酚等能抑制口腔細(xì)菌的產(chǎn)糖與產(chǎn)酸能力。蜂房為胡蜂科昆蟲大黃蜂或同屬近緣昆蟲的巢。具有祛風(fēng)、攻毒和殺蟲的功效,蜂房藥用歷史悠久,早在兩千多年前的《神農(nóng)本草經(jīng)》就已有記載。國內(nèi)研究表明蜂房的抑齲能力較強(qiáng),即使在不影響各實(shí)驗(yàn)菌株生長的較低濃度下也可有效抑制產(chǎn)酸、產(chǎn)胞外多糖及早期粘附等致齲毒力因子,在生物膜模型中隨著蜂房提取物溶液的加入,顯著減少了變形鏈球菌在羥磷灰石片上粘附的量,通過掃描電鏡的觀察也發(fā)現(xiàn)出胞外基質(zhì)明顯減少,提示蜂房溶液的加入可能對菌斑的致齲化轉(zhuǎn)變有一定的抑制作用。該實(shí)驗(yàn)從蜂房中分離得到4個(gè)組分,其中3個(gè)組分有甾醇類化合物,并首次在蜂房中分離鑒定到α-谷甾醇和α-胡蘿卜甙,由于它們有較強(qiáng)的殺菌能力,推測主要是這些甾醇類化合物的作用。通過觀測蜂房各提取物對變形鏈球菌生長曲線的影響發(fā)現(xiàn),蜂房提取物組分1,2,3均有明顯的殺菌作用,其中組分3在10min時(shí)就可殺滅變形鏈球菌,而蜂房提取物組分1,3在30min時(shí)也能殺滅變形鏈球菌。由此推測蜂房提取物為濃度依賴性殺菌藥,能在較短接觸時(shí)間內(nèi)殺滅變形鏈球菌。同時(shí)提示蜂房提取物可能具有抗生素后效應(yīng),即細(xì)菌與抗生素或抗菌藥物,經(jīng)短時(shí)間接觸,將殘留抗生素清除后,細(xì)菌生長仍受抑制的生物現(xiàn)象。這也表明,可將蜂房提取物用于口內(nèi)局部用藥,通過短時(shí)間的藥物接觸后能持續(xù)抑制變形鏈球菌生長,從而達(dá)到抑齲目的。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可初步得出蜂房提取物能抑制口腔致齲菌的生長,其最小抑菌濃度在4mg/ml左右。并且通過觀察其對變形鏈球菌生長曲線的影響進(jìn)一步探討了其抑菌的機(jī)制。通過對蜂房提取物成分的分析,首次發(fā)現(xiàn)其中含有α-谷甾醇和α-胡蘿卜甙,并且這2種成分