家蠶滯育的生物學特性

家蠶滯育的生物學特性

這種停滯繁殖是指從一定階段開始的生物生長和發(fā)育，然后進入不利生活環(huán)境的生理現象。滯育不同于休眠(dormancy),滯育過程中,即使適宜的溫度到來也不會立即打破滯育而繼續(xù)發(fā)育,相反,適宜的溫度正適于維持滯育狀態(tài)。昆蟲滯育可以發(fā)生在任一發(fā)育階段(卵、幼蟲、蛹、成蟲)。通過滯育,昆蟲一方面使自己的生活周期與取食季節(jié)一致,以度過不良的生存條件;另一方面使種群發(fā)育齊一,以提高雌雄交配機會,保證種的繁衍。因此,滯育對于昆蟲的生存、繁衍、進化發(fā)揮著重要的作用。滯育是由一系列階段組成的動態(tài)過程,二化性家蠶滯育卵的發(fā)育可以被分為五個不同的階段:滯育誘導、滯育決定、滯育起始、滯育維持、滯育終止。家蠶滯育發(fā)生在胚胎發(fā)育的原腸胚階段,此時由于滯育卵缺乏控制細胞分裂由G2期向M期所需的細胞周期蛋白(cyclin)B,胚胎細胞停止在G2期而滯育。家蠶卵的滯育由母代蛹期腦-咽下神經節(jié)分泌的滯育激素(diapauseu3000hormone,DH)決定,而滯育的解除則需要一個較長期的低溫或是人為地刺激,如HCL、H2O2處理等。以下即對近階段家蠶卵滯育的生理生化機制、分子機制以及遺傳機制的研究進展做進一步的詳述。1高溫、低溫催青、非滯育卵的誘導家蠶滯育受遺傳和環(huán)境的共同支配。家蠶二化性品系卵的滯育性是由親代卵期(即親代胚胎發(fā)育時期)所處的環(huán)境條件決定,高溫(25℃)催青可以有效地誘導家蠶產滯育卵,而低溫(15℃)催青則誘導家蠶產非滯育卵(圖1)。1.1滯育卵中糖原和糖醇的轉變家蠶卵滯育過程中由于環(huán)境和激素的刺激,核酸和碳水化合物的代謝以及糖原和山梨醇的利用都與家蠶滯育的誘導、決定、起始、維持、終止有關。在滯育的誘導階段,海藻糖代謝轉變?yōu)樘窃?此時海藻糖酶為其限速酶;在滯育的起始階段,糖原代謝轉變?yōu)樯嚼娲?此時糖原磷酸化酶為其限速酶;在滯育的終止階段,山梨醇代謝轉變?yōu)樘窃?此時山梨醇脫氫酶為其限速酶。滯育卵中這種糖原和糖醇的轉變,一方面從能量代謝上講,保存了氫分子,使之在滯育解除時再氧化制造ATP;另一方面從細胞生理學方面來看,糖醇是一種強力防凍劑,且對細胞膜有高度的透過性,不會對細胞造成傷害,因此積累的糖醇可以保護組織不受冬天低溫的危害。1.2類胡蘿卜素眼色素的測定在許多昆蟲中,著色與滯育有密切的關系,而且著色可以作為辨別滯育和非滯育的依據。在黑色素、眼色素和類胡蘿卜素等色素中,眼色素被認為是與胚胎滯育最密切的色素。漿膜中形成色素是滯育卵的特異現象之一,因此滯育卵著色,非滯育卵不著色。漿膜色素是眼色素系色素,是經過色氨酸→犬尿氨酸→3-羥犬尿氨酸代謝途徑形成的(圖2),滯育卵中由于漿膜色素的存在而呈深棕色,非滯育卵由于缺乏此色素而呈淺黃色或是白色。1.3谷胱甘肽向氧化狀態(tài)的轉變過氧化氫(H2O2)作為信號分子調控基因的表達、信號的轉導和生理機能。另一方面,過氧化氫酶(CAT)負責H2O2的清除,可以將H2O2催化為H2O和O2。有研究表明,滯育卵產后24h用H2O2處理,可以阻止滯育的起始,并且浸酸處理和在5℃寒冷條件下解除卵的滯育都可以明顯地觀察到卵內H2O2含量的增加,這說明H2O2的變化與家蠶卵的滯育密切相關。在真核生物中,H2O2可以被過氧化酶或是一些氧化體系消除,而谷胱甘肽被認為是在氧化過程中消除氧化物所必需的。谷胱甘肽是細胞內主要的硫醇化合物,具有還原型(GSH)和氧化型(GSSG)兩種形態(tài)。GSH/GSSG是細胞氧化脅迫的一個動態(tài)指示。在谷胱甘肽氧化循環(huán)過程中,經活性氧(ROS)的誘導,谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)和硫氧還蛋白過氧化物酶(PrdX)催化GSH的氧化;而在還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的誘導下,谷胱甘肽還原酶(GR)和硫氧還蛋白還原酶(TrxR)催化GSSG的還原。在滯育誘導的時期,卵內GSH/GSSG的比例降低,這是由于在誘導階段與非滯育卵相比,滯育卵Prdx的活性較高,使得GSH強氧化為GSSG,導致了GSH/GSSG的比例較低,表明在滯育誘導階段GSH和GSSG的反應趨于向氧化狀態(tài)進行;在滯育的起始階段,由于Prdx的活性較低,GSH的氧化減弱,使得GSH/GSSG的比例升高,表明在滯育起始階段GSH和GSSG的反應趨于向還原狀態(tài)進行;在滯育的決定階段,GSH的強氧化和GSSG的弱還原導致了GSH/GSSG比例的降低,表明此階段谷胱甘肽的轉變向氧化狀態(tài)進行,但是并沒有發(fā)現PrdX活性的明顯變化,這說明涉及到了其他的酶影響了GSH/GSSG的比例。實際上GR和TrxR的活性都降低,可能促進了GSSG的弱還原從而導致GSH/GSSG的比例降低;在滯育的終止階段,滯育卵具有較低的GSH/GSSG比例,這是由于在PrdX催化下GSH的強氧化和GR催化下GSSG的弱還原導致?？傊?在二化性家蠶品系中,谷胱甘肽向氧化狀態(tài)轉變與由滯育激素引起的滯育決定和5℃寒冷引起的滯育終止具有一致性。以上說明,谷胱甘肽的氧化循環(huán)與家蠶滯育的誘導、起始、決定、終止密切相關。1.4u3000ea4基因的轉錄表達時間間隔測定酶(Timeu3000intervalu3000measuringu3000enzyme-esteraseu3000A4,TIME-EA4)被稱為家蠶滯育生物鐘蛋白質。TIME-EA4起源于Cu-Zn超氧化物歧化酶家族,具有Cu/Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)活性和ATPase活性。其酯酶瞬時活性具有依賴低溫和鹽酸刺激等環(huán)境活化刺激因子的特性,通過空間結構的改變來打破家蠶的滯育。多肽抑制因子(peptidicu3000inhibitoryu3000needle,PIN)可以結合酯酶A4來阻止TIME-EA4的ATPase活性,停止酯酶A4閱讀時間的功能。而低溫、鹽酸和溫湯刺激處理可以使TIME-PIN分離,從而使酯酶A4的活性上升。EA4基因的轉錄水平在高溫明催青和低溫暗催青的家蠶卵中顯著不同,但是其mRNA表達水平不會隨著光照和溫度的變化而變化,這說明EA4基因不是對滯育誘導條件做出應答的時鐘控制基因。卵內EA4mRNA的轉錄在母代進行,產卵后,EA4mRNA的水平急劇下降,甚至在非滯育卵中消失。這表明EA4基因的轉錄在受精后被清除。并且EA4mRNA的表達水平在滯育卵和非滯育卵中一致。這說明基于TIME-EA4ATPase活性的滯育終止與EA4基因的表達無關,而是與TIME-EA4的蛋白結構有關。1.5br-sg中kbv的表達據有關研究報道,通過測定血淋巴和腦-咽下神經節(jié)(Br-SG)中兒茶酚胺(去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺及其衍生物)的濃度,發(fā)現只有多巴胺的濃度在滯育類型幼蟲和蛹的各組織中比非滯育類型高。通過人工喂食幼蟲或向早期蛹注射多巴和多巴胺可以使非滯育類型轉變?yōu)闇愋?并且在自然滯育誘導條件下,多巴胺脫羧酶(DDC)轉錄水平增強,提高DDC活性,引起了Br-SG中多巴胺水平的增加,從而促進了滯育激素mRNA的表達,出現滯育類型。以上研究結果表明,血淋巴和Br-SG中多巴胺的濃度在滯育類型家蠶幼蟲和蛹中要比非滯育類型高,Br-SG中多巴胺濃度的增加可以促進DH的產生,從而產生滯育類型。多巴胺與家蠶滯育有密切的關系。1.6u3000酸、堿和二甲酰胺的相互作用為了解除家蠶滯育,可以將滯育卵放置于5℃長達兩個月,或是HCl處理來阻止或打破滯育,這種方法應用于養(yǎng)蠶業(yè)已近80年之久。雖然對HCl處理來打破滯育的原理提出了許多假設,例如HCl中的H+使蠶卵內、外的pH值發(fā)生改變,pH值可改變酶的空間結構,引起酶活性變化;一方面,pH影響酶活性部位催化基團的解離狀態(tài),使底物不能分解為產物;另一方面,pH值影響酶活性部位結合基團的解離狀態(tài),使之不能與底物結合;HCl處理可以刺激一些酯酶同工酶的活性和RNA的活性。但是關于其準確的機制至今還不清楚,還有待進一步研究。最近一項研究表明發(fā)現,二甲亞砜(dimethylu3000sulfoxide,DMSO)可以有效地阻止家蠶卵進入滯育。在二甲亞砜的最佳處理濃度(100%)下,滯育的阻止率近78%,這一效果可以與HCl處理解除滯育相當或接近。二甲亞砜在滯育卵產下后24h之內發(fā)揮作用,有效地處理時期要比HCl處理的時期短。二甲亞砜發(fā)揮作用阻止滯育在卵著色開始之前,滯育卵被眼色素(如眼黃素)著色開始意味著卵膜細胞上著色顆粒的開始形成,因此,二甲亞砜的有效處理時期是著色顆粒開始形成之前。相反,HCl處理來打破滯育在卵膜上眼黃素積累的著色顆粒形成之后。這表明,DMSO和HCl打破家蠶卵的滯育具有不同的分子機制,還有待進一步探究。2u3000家蠶卵繁殖的分子基礎2.1u3000dh-pban蛋白表達控制昆蟲滯育誘導和解除的內分泌系統(tǒng)大致可以分為3個類型(山下,1986)。第一種類型是由腦-前胸腺控制的蛹滯育;第二種類型是咽側體控制的幼蟲和成蟲的滯育;第三種是咽下神經節(jié)控制的卵滯育。家蠶屬于咽下神經節(jié)控制卵滯育類型,即咽下神經節(jié)(subpharyngealu3000ganglion,SG)分泌滯育激素(DH)控制其滯育。在家蠶中,滯育激素生物合成激活多肽基因(diapauseu3000hormone-pheromoneu3000biosynthesisactivatingu3000neuropeptideu3000gene,DH-PBAN)是一個神經多肽基因,它可以編碼一個C末端包含五個氨基酸(Phe-X-Pro-Arg-Leuu3000NH2)的酰胺神經多肽(FXPRLa)前體,后此多聚多肽前體經蛋白水解酶的作用釋放出DH(diapauseu3000hormone),PBAN(pheromone-biosynthesis-activatingu3000neuropeptide)andα-,β-andγ-SGNPs(subesophagealu3000ganglionu3000neuropeptides),其中DH應答于家蠶胚胎的滯育。滯育激素的靶器官是卵巢,對卵巢的作用過程為:血液將咽下神經節(jié)分泌的DH運送到卵巢;DH和存在于卵母細胞上的“DH受體”結合;這種結合作用于鳥苷酸環(huán)化酶,使之活性下降;鳥苷酸環(huán)化酶活性下降使cGMP合成受到抑制,結果cGMP濃度下降;cGMP濃度下降導致膜上海藻糖酶的活性提高,酶分解血液海藻糖成葡萄糖的反應加快,更多的葡萄糖通過膜進入卵母細胞,在卵母細胞中合成糖原。然而家蠶在胚胎期和幼蟲期分別進行明催青和暗催青,滯育激素mRNA的表達在兩者中并沒有什么不同,這表明子代滯育卵的滯育是滯育激素的釋放而不是滯育激素mRNA表達的結果,此激素的有無決定滯育誘導的開始與否。2.2對家蠶發(fā)育的影響眾所周知,季節(jié)性非遺傳多型性涉及到由環(huán)境條件(如光照,溫度,濕度,營養(yǎng)等)決定的表型的可塑性。許多昆蟲中都表現出了由于環(huán)境條件改變而自身身體或翅顏色以及結構而發(fā)生變化的現象。瞬時受體電位通道(Transientu3000receptoru3000potentialu3000channe,TRPu3000channe)是由存在于細胞膜上的一類重要陽離子通道構成的蛋白超家族,由Minke等人在研究果蠅視覺傳導系統(tǒng)時首次發(fā)現。在哺乳動物中,已發(fā)現30種TRP通道亞型,分屬于7個亞家族,即TRPC、TRPV、TRPM、TRPML、TRPA和TRPP、TRPN。TRP通道在脊椎動物和非脊椎動物有機體中對溫度變化的感知都發(fā)揮了重要的作用。在昆蟲中,TPRA1和其它TRPA亞成員可以調節(jié)昆蟲對溫度變化的感知。Sato等人在家蠶基因組中發(fā)現了13個TRP通道亞家族成員,并成功克隆了5個TRPA亞家族基因。通過BmTRPA1RNAi技術處理剛產下的滯育卵并在25℃暗處理條件下培養(yǎng),結果發(fā)現注射了BmTRPA1dsRNA的卵高溫(25℃)催青孵化后產下了部分非滯育卵,利用免疫組織化學技術檢測BmTRPA1RNAi后咽下神經節(jié)分泌DH細胞的免疫熒光信號強度,結果發(fā)現與未進行的BmTRPA1RNAi的細胞相比其信號強度明顯,表明BmTRPA1影響了蛹-成蟲發(fā)育階段DH的釋放,從而影響家蠶子代滯育。以上結果說明家蠶胚胎期BmTRPA1作為一個熱敏TRP通道在溫度大于21℃時被激活,并且涉及到與DH釋放相關的信號通路也被激活。為了探究BmTRPA1在卵內的分布位置,掃描電鏡結果發(fā)現幼蟲組織的發(fā)生和分化在胚胎發(fā)育的第20~23階段后,利用抗BmTRPA1抗體進行免疫組織化學反應,發(fā)現BmTRPA1存在于各組織的非神經表皮細胞,因此BmTRPA1可能參與了其它生理過程的代謝調節(jié)。家蠶TRP通道可以被溫度調節(jié),探究發(fā)現利用Ca2+成像實驗篩選到有些化學復合物,如福爾馬林、H2O2、肉桂醛也可以激活BmTRPA1,從而影響子代滯育的誘導以及蛹重和繭殼重的增加,因此BmTRPA1可以作為控制家蠶季節(jié)性非遺傳多樣性從而來擴大家蠶業(yè)生產的靶標。因此,BmTRPA1充當了一個在具有季節(jié)性非遺傳多型性有機體中控制可選擇表型發(fā)育的分子開關,為家蠶滯育的研究提供了新的思路。3家蠶滯育的化性遺傳家蠶滯育同時是一個極有魅力的遺傳學課題,一直以來科學工作者對家蠶滯育的遺傳學基礎做了大量研究?；?voltinism)是家蠶滯育遺傳多型性的表現,即自然條件下一年內發(fā)生世代數多少的這一特性。通?？煞譃橐换?univoltine,V1)、二化性(bivoltine,V2或+V)和多化性(multivoltine,V3)。多化性為一年發(fā)生的世代數在3代及其以上者,又包括有滯育期多化性和無滯育期多化性。盡管化性是家蠶的一種遺傳性狀,但它同時又受溫度、光照等環(huán)境因素的影響。這在家蠶的繁育上已經加以利用,即通過嚴格控制母體世代的環(huán)境條件來穩(wěn)定品種的化性或適度調節(jié)后代的化性表型。外山(1906)和Mcu3000cracken(1908)早已提出化性屬于母性遺傳,即蠶卵受精后,卵繼續(xù)發(fā)育直至孵化還是發(fā)育到一定階段而進入滯育,雖然是F1代的性狀,但在母代就已經決定。如果母代蛹的咽下神經節(jié)分泌滯育激素,那么子代為滯育卵;相反,子代為非滯育卵。因此,雌蛾所產下卵的化性決定于母體的基因型及母體世代所處的環(huán)境,而與交配雄蛾的基因型無關。化性的母性遺傳是化性的基本遺傳特征。梅谷(1925)最先發(fā)現了化性的伴性遺傳。永友(1942)提出了伴性基因和常染色體等效越年基因的理論假說,合理解釋了蠶的化性從一化到多化構成一個連續(xù)階梯現象。諸星(1956)則以控制滯育激素分泌量的位于第6染色體上的化性主基因(顯隱性為:V1>+V>V3)和位于Z染色體控制腦機能從而影響咽下神經節(jié)分泌機能的伴性成熟基因(顯隱性為:Lm>+lm>Lme)來解釋化性的伴性遺傳現象。根據諸星的理論,家蠶的化性主要取決于由化性主效基因支配的咽下神經節(jié)分泌滯育激素的量,分泌量多則產滯育卵,分泌量少則產非滯育卵。同時咽下神經節(jié)分泌滯育激素的機能,在很大程度上又受到腦伴性成熟基因的影響,外界環(huán)境條件對蠶化性的影響就是通過調控腦伴性成熟基因而表現出來的。諸星的化性遺傳理論得到了實驗遺傳學的支持和廣泛的認同,一直為家蠶遺傳育種和繁育研究提供了有力的指導。最終系統(tǒng)地揭示家蠶滯育的