石油降解菌的篩選及其對大慶油田的原位修復(fù)研究

石油降解菌的篩選及其對大慶油田的原位修復(fù)研究

石油污染土壤的生物恢復(fù)包括將污染物降解、積累并轉(zhuǎn)移到生物廢物中以恢復(fù)土壤生態(tài)功能的過程。恢復(fù)方法包括微生物作用、植物作用和兩者的結(jié)合。目前,國內(nèi)關(guān)于石油污染土壤的生物修復(fù)技術(shù)大多還僅限于實驗室研究階段,研究內(nèi)容主要是利用微生物對石油污染土壤進(jìn)行修復(fù),利用微生物與植物進(jìn)行聯(lián)合修復(fù)的研究還少見報道。本工作采用微生物和植物對石油污染土壤進(jìn)行了聯(lián)合修復(fù),研究了在較大規(guī)模條件下石油污染物的降解規(guī)律,為大范圍修復(fù)石油污染土壤提供了依據(jù)。1實驗部分1.1培養(yǎng)基和生長劑無機(jī)培養(yǎng)基(mg/L):KH2PO410,K2HPO410,(NH4)2SO4200,MgSO4·7H2O6,微量元素溶液2mL/L,用大慶原油作為碳源。微量元素溶液(mg/L):FeSO4·7H2O500,ZnSO4·7H2O200,MnSO460,CaCl2·2H2O3000。普通培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏5,蛋白胨10,NaCl5,水1000mL。pH為7。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):NH4Cl3.04,K2HPO4·3H2O5.42,MgSO4·7H2O0.2,CaCl2·2H2O0.02。液體石蠟20mL。NH4Cl和KH2PO4均為分析純。采用大慶油田現(xiàn)場的石油污染土壤。在實驗室從石油污染土壤中馴化培養(yǎng)石油降解菌。蓬松劑為鋸末。1.2實驗方法1.2.1培養(yǎng)原油無機(jī)溶劑在裝有100mL普通培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中加入2g石油污染土壤,石油污染土壤有4個來源不同的試樣,分別標(biāo)記為1,2,3,4,將它們放入恒溫震蕩培養(yǎng)箱中,在35℃、轉(zhuǎn)速為120r/min的條件下震蕩培養(yǎng),至培養(yǎng)液明顯渾濁,取上層液50mL加入裝有50mL無機(jī)培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中,再將適當(dāng)質(zhì)量濃度的大慶原油直接加到該錐形瓶中作為微生物生長的碳源(大慶原油的初始質(zhì)量濃度為200mg/L)。隨后將錐形瓶放入恒溫?fù)u床,培養(yǎng)一定時間至培養(yǎng)液渾濁時,倒掉一半培養(yǎng)液換上新的含大慶原油的無機(jī)培養(yǎng)基,新培養(yǎng)基中的石油質(zhì)量濃度比第一次增加。此后不斷重復(fù)該過程并且逐步提高大慶原油的質(zhì)量濃度,經(jīng)過約3個月的培養(yǎng),從4個試樣中各得到一組可降解較高濃度石油污染物的菌株。1.2.2土壤樣品的加入將沙與土體積比為1∶2的土壤先去除雜質(zhì),粉碎后于高溫下干燥。取400g土壤加入1600mg大慶原油,適當(dāng)加入NH4Cl和KH2PO4,充分混勻后,平均裝入4個150mL的錐形瓶中,每瓶100g。然后分別加入一組石油降解菌,放入30℃恒溫箱中,每隔10d測定其中石油烴的含量。1.2.3相同單元的石油降解菌石油污染土壤處理床分為5個單元。1單元至4單元,每個單元長4m,寬5m,深0.3m,投加質(zhì)量相同的石油降解菌。1單元種大豆,2單元種堿草,4單元混鋸末。2,3,4單元中無機(jī)營養(yǎng)NH4Cl和KH2PO4的加入量相同,1單元中NH4Cl的加入量減半。5單元為對照單元,長2m,寬2.5m,深0.3m,不加菌。石油污染土壤處理床的含濕量保持在15%~20%,自然通風(fēng)。1.2.4加入處理單元將實驗室篩選的高效石油降解菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵后,等量加入各處理單元。定期補(bǔ)水,使處理床的含濕量保持在15%~25%,自然通風(fēng)。定期多點采樣分析。1.3分析石油烴含量的測定采用重量法;微生物菌數(shù)的測定采用平板稀釋法。2結(jié)果與討論2.1石油降解菌的降解能力通過馴化,從4個試樣中各得到一組石油降解菌,分別標(biāo)為D1,D2,D3,D4。4組石油降解菌的降解能力見表1。從表1可以看出,經(jīng)過20d的降解,D1對石油烴的降解率最高,達(dá)到78.6%,所以后續(xù)實驗將D1作為生物修復(fù)的石油降解菌。2.2石油烴降解率實驗過程中各單元石油烴的降解情況見圖1。由圖1可見,經(jīng)過135d的運行,1,2,3,4單元的石油烴降解率分別達(dá)到81.59%,83.26%,63.65%,72.94%,比對照單元40.75%的降解率高很多。1單元和2單元的石油烴殘留量分別為410.22mg和372.96mg,均低于臨界殘留量500mg。第15天的采樣結(jié)果表明,1~4單元的石油烴降解率為30.32%~31.76%,5單元稍高于這4個單元,是由于接種所用的石油降解菌通常都有一個適應(yīng)期。15d后,1~4單元的石油烴降解率顯著升高,均高于對照單元,因為此時石油降解菌已適應(yīng)土壤的環(huán)境,開始降解土壤中的石油烴。實驗期間5個處理單元的石油烴降解率大小順序為:2單元>1單元>4單元>3單元>5單元。15d后3單元的石油烴降解率高于5單元,說明石油烴降解菌的加入加快了土壤中石油烴的降解。大豆、堿草、鋸末的存在顯著提高了土壤中石油烴的降解率。1,2,4單元的石油烴降解率大大高于3單元,這是因為,1單元大豆的根瘤能為土壤提供氮源,同時根際微生物和植物根系的生長加強(qiáng)了對土壤中石油烴的降解,2單元也是同理;4單元因為加入了鋸末,使得土壤的通透性加強(qiáng),微生物的呼吸作用加強(qiáng),所以相對于3單元,它的石油烴降解率增大。2.3對土壤微生物菌數(shù)的影響實驗過程中各單元微生物菌數(shù)的變化見圖2。由圖2可見,經(jīng)過一段時間的運行,接菌單元土壤中微生物菌數(shù)明顯高于對照單元。開始時,因接入的微生物有一個適宜土壤環(huán)境的過程,第15天以前,微生物菌數(shù)低于對照單元,以后則明顯高于對照單元。這種趨勢一直到第60天后才有所回落,但接菌單元土壤中微生物菌數(shù)仍然高于對照單元,甚至高出2個數(shù)量級以上。因為第60天以后易降解的有機(jī)物大部分已被降解,微生物得不到足夠的營養(yǎng),其生長受到限制,所以微生物菌數(shù)也開始不同程度地減少。由圖2還可以看出,第15天后石油降解菌適應(yīng)了土壤的環(huán)境,開始對石油烴進(jìn)行降解,1,2,3,4單元微生物的菌數(shù)均開始不同程度地增加,但1,2單元的微生物菌數(shù)明顯高于3,4單元,因為這時1單元中大豆的根瘤已慢慢形成,開始提供氮源,根系也開始生長、擴(kuò)大,為土壤微生物提供了棲息地,并提供了營養(yǎng),使微生物菌數(shù)開始大幅度增加,2單元中堿草因為根際環(huán)境的形成微生物菌數(shù)也大大增加,這兩個單元的微生物菌數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他單元。第15天后由于石油降解菌開始降解石油,3單元的微生物菌數(shù)開始增加,但大大低于種植物的1,2單元。第60天后雖然微生物菌數(shù)都開始下降,但1,2單元仍高于3單元。2.4根際土壤石油烴的降解從實驗進(jìn)行的第30天起,到第90天為止,分別采集了1,2單元的根際與根外土壤,進(jìn)行微生物菌數(shù)和石油烴含量的分析,結(jié)果見圖3和圖4。從圖3和圖4可見,大豆(1單元)、堿草(2單元)根際土壤的石油烴含量明顯低于根外土壤,說明根際的石油烴得到很好的降解,大豆、堿草的根際微生物菌數(shù)明顯多于根外土壤中的菌數(shù),有時候甚至高出2個數(shù)量級以上。主要原因是植物根際與微生物的相互作用。由于根系的穿插,使根際的通氣條件、水分狀況良好,比根際外的土壤更有利于微生物的生長;另一方面,植物又可將大氣中的氧氣經(jīng)葉、莖傳輸?shù)礁?擴(kuò)散到根際周圍缺氧的土壤中,形成氧化的微環(huán)境,刺激了好氧微生物的生長。3不同植物根際土壤石油烴降解率及微生物菌數(shù)a)利用實驗室篩選的高效石油降解菌,結(jié)合種植大豆、堿草等植物,對石油污染土壤進(jìn)行生物聯(lián)合修復(fù)。經(jīng)過135d的處理,