蛋白質(zhì)分離純化主要方法專題培訓(xùn)課件

蛋白質(zhì)分離純化的一般步驟層析法電泳法超離心法超濾鹽析（硫酸銨鹽析）等電點(diǎn)沉淀有機(jī)溶劑沉淀透析│←前處理→│←粗分級(jí)→│←細(xì)分級(jí)→│材料選擇與處理細(xì)胞破碎（機(jī)械破碎、溶漲和自溶、酶解、化學(xué)處理）生物組織→無細(xì)胞提取液→粗產(chǎn)品→→結(jié)晶10/25/20231鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、重金屬鹽沉淀法、生物堿或酸類沉淀法、加熱變性沉淀法離子交換層析吸附層析凝膠過濾（分子篩）親和層析等電聚集層析分離純化方法沉淀法層析法電學(xué)法電泳法等電聚焦膜分離技術(shù)透析超濾離心法10/25/20232純度鑒定分子量測(cè)定層析法：凝膠過濾;高效液相色譜法(HPLC)電泳法：PAGE、梯度凝膠電泳、等電聚焦電泳等免疫化學(xué)法：專一的沉淀線SDS-PAGE電泳法：測(cè)定亞基數(shù)超速離心：成分均一其它：如,結(jié)晶法……10/25/20233定義：利用半透膜把大小分子分開的方法。操作

蛋白質(zhì)溶液置半透膜袋中，置流動(dòng)溶劑（如蒸餾水）中，使小分子雜質(zhì)（如無機(jī)鹽、單糖、雙糖、AA、小肽等透出）蛋白質(zhì)留于袋中而得到分離。一透析10/25/20234透析工作圖半透膜原理10/25/2023510/25/20236二層析技術(shù)（chromatography）p148一、層析技術(shù)一般原理二、層析技術(shù)分類及應(yīng)用10/25/20237（一）、層析技術(shù)原理

層析技術(shù)是一種物理的分離方法。無論何種層析，其系統(tǒng)通常由互不相溶的兩個(gè)相組成：一是固定相（固體或吸附在固體上的液體），一是流動(dòng)相（液體或氣體）。層析時(shí)，利用混合物中各組分理化性質(zhì)（如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、溶解度等）的差異，使各組分不同程度地分布在兩相中，隨著流動(dòng)相從固定相上流過，不同組分以不同速度移動(dòng)而最終被分離。樣品在層析時(shí)的移動(dòng)速度可用遷移率Rf值表示：

樣品原點(diǎn)到斑點(diǎn)中心的距離

Rf=——————————————樣品原點(diǎn)到溶劑前沿的距離10/25/20238(二)層析相關(guān)概念1.固定相：固定相是層析的一個(gè)基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附，溶解，交換等作用。它對(duì)層析的效果起著關(guān)鍵的作用。10/25/202392.流動(dòng)相：在層析過程中，推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個(gè)方向移動(dòng)的液體、氣體或超臨界體等，都稱為流動(dòng)相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時(shí)稱為展層劑。它也是層析分離中的重要影響因素之一。10/25/202310（三）、層析法分類（按分離原理分類）分配層析吸附層析凝膠過濾（分子篩層析）離子交換層析親和層析

聚焦層析10/25/202311層析法分類（按裝置分類）

紙層析薄膜層析

柱層析10/25/202312填充物分部收集玻璃柱洗脫液樣品10/25/202313各類層析的原理和載體類別分離原理基質(zhì)或載體吸附層析

化學(xué)、物理吸附硅膠、氧化鋁、羥基磷酸分配層析兩溶劑相中的溶解效應(yīng)纖維素、硅藻土、硅膠凝膠層析分子篩效應(yīng)的排阻效應(yīng)sepharose、sephadex離子交換層析離子基團(tuán)的交換反應(yīng)離子交換樹脂、纖維素、葡聚糖親和層析分離物與配體之間有帶配基的sepharose特殊親和力或sephadex聚焦層析等電點(diǎn)和離子交換作用多緩沖交換劑（與帶有多種電荷基團(tuán)的配體相偶聯(lián)的sepharose6B）10/25/202314

原理：以吸附劑作為固定相，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┳髁鲃?dòng)相。由于各種物質(zhì)的極性不同，被吸附劑吸附的程度和在流動(dòng)相中的溶解度不同。層析時(shí)，當(dāng)流動(dòng)相從固定相上流過時(shí)，各組分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，從而以不同速度隨流動(dòng)相向前移動(dòng)。吸附層析（absorptionchromatography）10/25/20231510/25/202316原理：

分配層析是利用混合物(樣品)在二種或二種以上的不同溶劑中的分配系數(shù)不同而使物質(zhì)分離的方法分配層析實(shí)際上是一種連續(xù)抽提方式。如紙層析中濾紙的結(jié)合水為固定相，以水飽和的有機(jī)溶劑為流動(dòng)相（展開劑）。分配層析(p148)10/25/202317物質(zhì)在紙上移動(dòng)的速度可以用Rf表示：色斑中心至原點(diǎn)中心的距離Rf=──────────────溶劑前緣至原點(diǎn)中心的距離載體：纖維素硅藻土硅膠應(yīng)用：各種生化物質(zhì)的分離鑒定10/25/202318凝膠層析（gelfiltration）又稱為凝膠排阻層析（gelexclusionchromatography）、分子篩層析（molecularsievechromatography）、凝膠過濾（gelfiltration）、凝膠滲透層析（gelpermeationchromatography）等。10/25/202319原理p303凝膠層析是依據(jù)分子大小這一物理性質(zhì)進(jìn)行分離純化的。凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。當(dāng)含有不同分子大小的組分的樣品進(jìn)入凝膠層析柱后，各個(gè)組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴(kuò)散，組分的擴(kuò)散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。10/25/202320載體

葡聚糖凝膠（sephadex）

瓊脂糖凝膠（sepharose）應(yīng)用:

測(cè)定分子量脫鹽和濃縮分離提純生物大分子除去熱原物質(zhì)10/25/202321離子交換層析（ion-changechromatography）原理離子交換層析是依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同而進(jìn)行分離純化的。離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質(zhì)通過一定的化學(xué)反應(yīng)共價(jià)結(jié)合上某種電荷基團(tuán)形成的。10/25/202322分類：根據(jù)交換劑上吸附的離子交換基團(tuán)不同，陽離子交換劑;陰離子交換劑；按其解離度的大小，分為強(qiáng)、中強(qiáng)、弱三種：

10/25/202323磷酸基團(tuán)（PO3H2）和亞磷酸基團(tuán)（PO2H）

結(jié)合磺酸基團(tuán)（SO3H）弱酸型

強(qiáng)酸型中等酸型結(jié)合酚羥基（OH）或羧基（COOH）

弱堿型

強(qiáng)堿型中等堿型季胺基團(tuán)（N(CH3)3），

叔胺（N(CH3)2）、仲胺（NHCH3）、伯胺（-NH2）

二乙基氨基乙基（DEAE）

離子交換層析分類陰離子交換劑陽離子交換劑10/25/20232410/25/202325交換過程2.吸附階段：樣品與反離子進(jìn)行交換3、4.解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強(qiáng)吸附物質(zhì)5.再生階段：用原始平衡液進(jìn)行充分洗滌，既可重復(fù)使用12345原始緩沖溶液的反離子樣品溶液梯度濃度1.平衡階段:離子交換劑與反離子結(jié)合10/25/20232610/25/202327應(yīng)用

制備、純化生物物質(zhì)定量、定性測(cè)定混合物中各組分10/25/202328原理欲分離的大分產(chǎn)物質(zhì)S和相對(duì)應(yīng)的專一物質(zhì)L(配體)以次級(jí)鍵結(jié)合，能生成一種可解離的絡(luò)合物L(fēng)—S。其中的L又能與活化的基質(zhì)M以共價(jià)鍵首先結(jié)合，而形成M—L—S復(fù)合物。根據(jù)L—S之間能可逆地結(jié)合與解離的原理發(fā)展起來的層橋方法稱為親和層析法。親和層析（affiuitychromatography）

10/25/202329+待純化分子配體a.待純化分子和配體間具有親和性+基質(zhì)b.活性基質(zhì)與配體結(jié)合產(chǎn)生親和吸附劑++雜質(zhì)c.待純化分子與親和吸附劑結(jié)合，與雜質(zhì)分離+d.偶聯(lián)復(fù)合物經(jīng)解離后，得到純的待純化分子配體L基質(zhì)M待分離物質(zhì)SL-S復(fù)合物10/25/20233010/25/202331應(yīng)用分離純化酶、抗原、抗體分離純化核酸研究酶的結(jié)構(gòu)與功能基質(zhì)纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、sepharose、sephadex10/25/202332聚焦層析（Chromatofocusing）

該法是在等電點(diǎn)聚焦方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，其分離純化蛋白質(zhì)的依據(jù)是等電點(diǎn)的差異和離子交換行為。蛋白質(zhì)按其等電點(diǎn)在pH梯度環(huán)境中進(jìn)行排列的過程叫做聚焦效應(yīng)。原理10/25/202333pH梯度的形成(由多緩沖劑和多緩沖交換劑形成)是聚焦效應(yīng)的先決條件，如果一種蛋白質(zhì)加到已形成pH梯度的層析柱上時(shí)，由于洗脫液的連續(xù)流動(dòng)，蛋白質(zhì)將迅速地遷移到與它等電點(diǎn)相同的pH處。從此位置開始，該蛋白質(zhì)將以緩慢的速度進(jìn)行吸附、解吸附，直到在等電點(diǎn)pH時(shí)被洗出。在聚焦層析過程中，一種樣品分次加入時(shí)，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的時(shí)間進(jìn)行聚焦，剩余樣品還可以加到柱上，其聚焦過程都能順利完成。10/25/2023341、pH梯度的形成2、蛋白質(zhì)行為3、聚焦效應(yīng)10/25/202335層析時(shí)的聚焦效應(yīng)示意圖pH梯度溶液的形成示意圖蛋白質(zhì)1（pI=7）蛋白質(zhì)2（pI=8）流速移動(dòng)速率10/25/202336幾種主要層析方法比較10/25/202337二、電泳技術(shù)

電泳的一般原理電泳技術(shù)的分類電泳的影響因素常用電泳技術(shù)10/25/202338電泳的一般原理

電泳是帶電顆粒在電場(chǎng)作用下向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。許多生物分子都帶有電荷，其電荷的多少取決于分子組成、性質(zhì)及其所在介質(zhì)的pH。如果混合物中各組分的結(jié)構(gòu)組成不同，在某一pH溶液中，各組分所帶電荷性質(zhì)、電荷數(shù)量不同，加之其分子量不同，在同一電場(chǎng)的作用下，各組分泳動(dòng)的方向和速度也各異，而達(dá)到分離鑒定各組分的目的。10/25/202339電泳分類（一）按原理分四種1.區(qū)帶電泳：是當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的電泳技術(shù)。

2.自由界面電泳：這是瑞典Uppsala大學(xué)的著名科學(xué)家Tiselius最早建立的電泳技術(shù)，是在Ｕ形管中進(jìn)行電泳，無支持介質(zhì)，因而分離效果差，現(xiàn)已被其他電泳技術(shù)所取代。

3.等速電泳：需使用專用電泳儀，當(dāng)電泳達(dá)到平衡后，各電泳區(qū)帶相隨，分成清晰的界面，并以等速向前運(yùn)動(dòng)。

4.等電聚焦電泳：由兩性電解質(zhì)在電場(chǎng)中自動(dòng)形成pH梯度，當(dāng)被分離的生物大分子移動(dòng)到各自等電點(diǎn)的pH處聚集成很窄的區(qū)帶。10/25/202340（二）按支持介質(zhì)的不同可分為：

1.紙電泳

2.醋酸纖維薄膜電泳3.瓊脂凝膠電泳4.聚丙烯酰胺凝膠電泳

5.SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）。10/25/202341（三）按支持介質(zhì)形狀不同1.薄層電泳；

2.板電泳；

3.柱電泳。（四）按用途不同可分為：

1.分析電泳；2.制備電泳；

3.定量免疫電泳；10/25/202342（五）按所用電壓不同可分為：

1.低壓電泳：100V～500V，電泳時(shí)間較長，適于分離蛋白質(zhì)等生物大分子。

2.高壓電泳：1000V～5000V，電泳時(shí)間短，有時(shí)只需幾分鐘，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖類等小分子物質(zhì)的分離。（六）按pH的連續(xù)性不同可分為：1.連續(xù)pH電泳：如紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳；2.非連續(xù)pH電泳：如聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳；10/25/202343電泳技術(shù)分類（按實(shí)驗(yàn)裝置分類）

紙電泳

薄膜電泳

凝膠電泳

毛細(xì)管電泳10/25/202344毛細(xì)管電泳10/25/202345三、影響電泳的因素（一）帶電顆粒的物理性狀（二）支持物介質(zhì)：（三）緩沖溶液(pH離子強(qiáng)度)（四）電場(chǎng)強(qiáng)度：（五）電滲現(xiàn)象：（六）焦耳熱對(duì)電泳的影響10/25/202346四、常用電泳技術(shù)1、醋酸纖維薄膜電泳2、聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）3、SDS4、PAGE等電點(diǎn)聚焦3、瓊脂糖電泳4、毛細(xì)管電泳10/25/202347聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）

凝膠聚合反應(yīng)及催化系統(tǒng)

不連續(xù)PAGE

可產(chǎn)生的三種效應(yīng)：電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、濃縮效應(yīng)10/25/202348聚丙烯酰胺凝膠電泳（PolyacrylamidegelelectrophoresisPAGE），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠是由單體的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2Acrylamide）和甲叉雙丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2)2N,N’-methylenebisacrylamide）聚合而成，這一聚合過程需要有自由基催化完成。10/25/202349光聚合催化劑是核黃素，核黃素在光照下能夠產(chǎn)生自由基，催化聚合反應(yīng)。聚合方式化學(xué)聚合通常是加入催化劑過硫酸銨（AP）以及加速劑四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基10/25/202350不連續(xù)表現(xiàn)：緩沖液及凝膠pH不連續(xù)凝膠孔徑不連續(xù)電位梯度不連續(xù)10/25/202351⊕–電極緩沖液pH8.3

Tris-Gly

分離膠pH：8.9Tris-HCl電極緩沖液pH8.3Tris-Gly

濃縮膠pH：6.7Tris-HCl

樣品

10/25/20235210/25/20235310/25/202354SDS原理：

當(dāng)SDS（SodiumDodecylSulfate）與蛋白質(zhì)結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子即帶有大量的負(fù)電荷，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其原來的電荷，從而使天然蛋白質(zhì)分子間的電荷差別就降低乃至消除了。與此同時(shí)蛋白質(zhì)在SDS的作用下結(jié)構(gòu)變得松散，形狀趨向一致，所以各種SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳時(shí)產(chǎn)生的泳動(dòng)率差異，就反映了分子量的差異。在此條件下，樣品分子量的對(duì)數(shù)與其在凝膠中的遷移率呈直線關(guān)系。應(yīng)用:測(cè)定蛋白質(zhì)分子量測(cè)定蛋白質(zhì)亞基數(shù)10/25/202355SDSseparatesproteinsbyMW10/25/20235610/25/202357等電點(diǎn)聚焦（isoelectricfocusing）

原理:在一定抗對(duì)流介質(zhì)（如凝膠）中加入兩性電解質(zhì)載體(Ampholyte,是一種多氨基多羧基的混合物，由異構(gòu)物和同系物組成，其pK和pI值各自相異卻又相近），當(dāng)直流電通過時(shí)，便形成一個(gè)由陽極到陰極pH值逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過程中，就被濃集在與其等電點(diǎn)相等的pH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點(diǎn)得到分離。應(yīng)用：

高效率分離純化蛋白質(zhì)測(cè)定蛋白質(zhì)分子量10/25/202358等電聚焦電泳：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在其等電點(diǎn)時(shí)，凈電荷為零，在電場(chǎng)中不再移動(dòng)。++－－－－+－－－－－5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度通電++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－10/25/20235910/25/202360等電聚焦電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)pI10/25/202361雙向電泳10/25/20236210/25/20236310/25/202364毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管電泳又稱毛細(xì)管區(qū)帶電泳，它是在毛細(xì)管（

2-75μm）中裝入緩沖液，從其一端注入樣品，在毛細(xì)管兩端加高壓直流電實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的分離，分離后的樣品依次通過設(shè)在毛細(xì)管一端的檢測(cè)器檢出。該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴(kuò)散和樣品擴(kuò)散的問題，實(shí)現(xiàn)了快速和高效分離。

毛細(xì)管電泳是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，被認(rèn)為是90年代最有影響的分離手段之一。目前已廣泛用于氨基酸分析、蛋白質(zhì)高效分離、指紋圖譜研究、分離合成的寡核苷酸、DNA序列測(cè)定及PCR產(chǎn)物的分析鑒定等。10/25/202365毛細(xì)管電泳裝置示意圖高壓電源光源光電倍增管數(shù)據(jù)采集毛細(xì)管