第二部分 微生物技術(shù)

第二部分微生物新技術(shù)微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)大多數(shù)動物植物的研究、利用都能以個體為單位進行，而微生物由于個體微小，在絕大多數(shù)情況下都是利用群體來研究其屬性，微生物的物種（菌株）一般也是以群體的形式進行繁衍、保存。在微生物學(xué)中，在人為規(guī)定的條件下培養(yǎng)、繁殖得到的微生物群體稱為培養(yǎng)物（Culture)，而只有一種微生物的培養(yǎng)物稱為純培養(yǎng)物（pureculture）。

一、無菌技術(shù)與純培養(yǎng)第一節(jié)微生物純培養(yǎng)與保藏技術(shù)無菌技術(shù)微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且無處不在。因此，在微生物的研究及應(yīng)用中，不僅需要通過分離純化技術(shù)從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物，而且還必須隨時注意保持微生物純培養(yǎng)物的“純潔”，防止其他微生物的混人。在分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)物時防止其被其他微生物污染的技術(shù)被稱為無菌技術(shù)（aseptictechnique)，它是保證微生物學(xué)研究正常進行的關(guān)鍵。

二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)單個微生物稀釋倒平板法（pourplatemethod)涂布平板法（Spreadplatemethod)平板劃線分離法（streakplatemethod)稀釋搖管法（dilutionShakeculturemethod)對氧氣更為敏感的厭氧性微生物，純培養(yǎng)的分離則可采用稀釋搖管培養(yǎng)法進行，它是稀釋倒平板法的一種變通形式帶。先將一系列盛無菌瓊脂培養(yǎng)基的試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50℃左右，將待分離的材料用這些試管進行梯度稀釋，試管迅速搖動均勻，冷凝后，在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養(yǎng)基和空氣隔開。培養(yǎng)后，菌落形成在瓊脂柱的中間。進行單菌落的挑取和移植，需先用一只滅菌針將液體石蠟一石蠟蓋取出，再用一只毛細管插人瓊脂和管壁之間，吹人無菌無氧氣體，將瓊脂柱吸出，置放在培養(yǎng)皿中，用無菌刀將瓊脂柱切成薄片進行觀察和菌落的移植。

厭氧菌培養(yǎng)厭氧菌在有氧的情況下不能生長。要培養(yǎng)厭氧菌，必須創(chuàng)造一個無氧的環(huán)境。通常用培養(yǎng)基中加入還原劑，或用物理、化學(xué)方法去除環(huán)境中的游離氧，以降低氧化還原電勢。如皰肉培養(yǎng)基、硫基乙酸鈉培養(yǎng)基，牛心腦浸液培養(yǎng)基等。常用的厭氧培養(yǎng)方法有許多，可根據(jù)實際情況選用。厭氧缸法接種好標(biāo)本的平板或液體培養(yǎng)基試管，可放入?yún)捬醺變?nèi)培養(yǎng)，厭氧缸是普通的干燥缸，用物理化學(xué)的方法使缸內(nèi)造成厭氧環(huán)境，從而將厭氧菌培養(yǎng)出來。

厭氧袋（Bio-bag）即在塑料袋內(nèi)造成厭氧環(huán)境來培養(yǎng)厭氧菌。塑料袋透明而不透氣，內(nèi)裝氣體發(fā)生管（有硼氫化鈉的碳酸氫鈉固體以及5%檸檬酸安瓿）、美蘭指示劑管、鈀催化劑管、干燥劑。放入已接種好的平板后，盡量擠出袋內(nèi)空氣，然后密封袋口。先折斷氣體發(fā)生管，后折斷美蘭指示劑管，命名袋內(nèi)在半小時內(nèi)造成無氣環(huán)境。如不突變表示袋內(nèi)已達厭氧狀態(tài)，可以孵育。厭氧手套箱（Anaerobieglovebox）是迄今為止國際上公認(rèn)的培養(yǎng)厭氧菌最佳儀器之一。它是一個密閉的大型金屬箱，箱的前面有一個有機玻璃做的透明面板，板上裝有兩個手套，可通過手套在箱內(nèi)進行操作，故名。箱側(cè)有一交換室，具有內(nèi)外二門，內(nèi)門通箱內(nèi)先關(guān)著。欲放物入箱，先打開外門，放入交換室，關(guān)上外門進行抽氣和換氣（H2，CO2，N2）達到厭氧狀態(tài)，然后手伸入手套把交換室內(nèi)門打開，將物品移入箱內(nèi)，關(guān)上內(nèi)門。箱內(nèi)保持厭氧狀態(tài)，也是利用充氣中的氫在鈀的催化下和箱中錢殘余氧化合成水的原理。該箱可調(diào)節(jié)溫度，本身是孵箱或孵箱即附在其內(nèi)，還可放入解剖顯微鏡便于觀察厭氧菌菌落，這種厭氧箱適于作厭氧細菌的大量培養(yǎng)研究，大量培養(yǎng)基可放入作預(yù)還原和厭氧性無菌試驗。金屬硬壁型厭氧箱的抽氣、充氣、厭氧環(huán)境和溫度等均系自動調(diào)節(jié)。

生物耗氧法：在一密閉的容器內(nèi)放以生物（多是植物），消耗氧氣，同時產(chǎn)生二氧化碳，供細菌生長用。焦性末食子酸法：在一潔凈的玻片上鋪上紗布或濾紙，均勻撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速將已接種細菌的平板倒扣在上面，用融化的白蠟封邊，造成一個封閉空間。焦性末食子酸與堿反應(yīng)后耗氧。該法用于厭氧不嚴(yán)格的厭氧菌的培養(yǎng)，簡單。如有梭狀芽孢桿菌。

皰肉培養(yǎng)基：本身就是一個不需特殊設(shè)備的厭氧培養(yǎng)法。皰肉和肉湯裝入大試管，液面封凡士林，造成無氧環(huán)境。三、用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)

對于大多數(shù)細菌和真菌，用平板法分離通常是滿意的，因為它們的大多數(shù)種類在固體培養(yǎng)基上長得很好。然而迄今為止并不是所有的微生物都能在固體培養(yǎng)基上生長，例如一些細胞大的細菌、許多原生動物和藻類等，這些微生物仍需要用液體培養(yǎng)基分離來獲得純培養(yǎng)。

通常采用的液體培養(yǎng)基分離純化法是稀釋法。接種物在液體培養(yǎng)基中進行順序稀釋，以得到高度稀釋的效果，使一支試管中分配不到一個微生物。如果經(jīng)稀釋后的大多數(shù)試管中沒有微生物生長，那么有微生物生長的試管得到的培養(yǎng)物可能就是純培養(yǎng)物。如果經(jīng)稀釋后的試管中有微生物生長的比例提高了，得到純培養(yǎng)物的概率就會急劇下降。因此，采用稀釋法進行液體分離，必須在同一個稀釋度的許多平行試管中，大多數(shù)（一般應(yīng)超過95%）表現(xiàn)為不生長。四、單細胞（單抱子）分離

稀釋法有一個重要缺點，它只能分離出混雜微生物群體中占數(shù)量優(yōu)勢的種類，而在自然界，很多微生物在混雜群體中都是少數(shù)。這時，可以采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)，稱為單細胞（單抱子）分離法。

較大的微生物，可采用毛細管提取單個個體，并在大量的滅菌培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移清洗幾次，除去較小微生物的污染。這項操作可在低倍顯微鏡，如解剖顯微鏡下進行。對于個體相對較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下進行。單細胞分離法對操作技術(shù)有比較高的要求，多限于高度專業(yè)化的科學(xué)研究中采用。目前，市場上有售的顯微操作儀種類很多，一般是通過機械、空氣或油壓傳動裝置來減小手的動作幅度，在顯微鏡下用毛細管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個微生物細胞或抱子以獲得純培養(yǎng)。五、選擇培養(yǎng)分離沒有一種培養(yǎng)基或一種培養(yǎng)條件能夠滿足自然界中一切生物生長的要求，在一定程度上所有的培養(yǎng)基都是選擇性的。如果某種微生物的生長需要是已知的，也可以設(shè)計一套特定環(huán)境使之特別適合這種微生物的生長，因而能夠從自然界混雜的微生物群體中把這種微生物選擇培養(yǎng)出來，即使在混雜的微生物群體中這種微生物可能只占少數(shù)。這種通過選擇培養(yǎng)進行微生物純培養(yǎng)分離的技術(shù)稱為選擇培養(yǎng)分離，是十分重要的，特別對于從自然界中分離、尋找有用的微生物。

在自然界中，除了極特殊的情況外，在大多數(shù)場合下微生物群落是由多種微生物組成的。因此，要從中分離出所需的特定微生物是十分困難的，尤其當(dāng)某一種微生物所存在的數(shù)量與其他微生物相比非常少時，單采用一般的平板稀釋方法幾乎是不可能分離到該種微生物的。例如，若某處的土壤中的微生物數(shù)量在108時，必須稀釋到10-6才有可能在平板上分離到單菌落，而如果所需的微生物的數(shù)量僅為102--103，顯然不可能在一般通用的平板上得到該微生物的單菌落。要分離這種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等，采用選擇培養(yǎng)分離的方法?；蛞种剖勾蠖鄶?shù)微生物不能生長，或造成有利于該菌生長的環(huán)境，經(jīng)過一定時間培養(yǎng)后使該菌在群落中的數(shù)量上升，再通過平板稀釋等方法對它進行純培養(yǎng)分離。

1．利用選擇培養(yǎng)基進行直接分離主要根據(jù)待分離微生物的特點選擇不同的培養(yǎng)條件，有多種方法可以采用。例如在從土壤中篩選蛋白酶產(chǎn)生菌時，可以在培養(yǎng)基中添加牛奶或酪素制備培養(yǎng)基平板，微生物生長時若產(chǎn)生蛋白酶則會水解牛奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白質(zhì)水解圈。通過菌株培養(yǎng)時產(chǎn)生的蛋白質(zhì)水解圈對產(chǎn)酶菌株進行篩選，可以減少工作量，將那些大量的非產(chǎn)蛋白酶菌株淘汰。再如，要分離高溫菌，可在高溫條件進行培養(yǎng)；要分離某種抗生素抗性菌株，可在加有抗生素的平板上進行分離；有些微生物如螺旋體、粘細菌、藍細菌等能在瓊脂平板表面或里面滑行，可以利用它們的滑動特點進行分離純化，因為滑行能使它們自己和其他不能移動的微生物分開，可將微生物群落點種到平板上，讓微生物滑行，從滑行前沿挑取接種物接種，反復(fù)進行，得到純培養(yǎng)物。2．富集培養(yǎng)主要是指利用不同微生物間生命活動特點的不同，制定特定的環(huán)境條件，使僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長，從而使其在群落中的數(shù)量大大增加，人們能夠更容易地從自然界中分離到所需的特定微生物。富集條件可根據(jù)所需分離的微生物的特點從物理、化學(xué)、生物及綜合多個方面進行選擇，如溫度、pH、紫外線、高壓、光照、氧氣、營養(yǎng)等等許多方面。例如：從土壤中分離能降解酚類化合物對羥基苯甲酸（β-hydroxybenzylacid）的微生物的實驗過程。

首先配制以對輕基苯甲酸為唯一碳源的液體培養(yǎng)基并分裝于燒瓶中，滅菌后將少量的土壤樣品接種于該液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時間，原來透明的培養(yǎng)液會變得渾濁，說明已有大量微生物生長。取少量上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)液中重新培養(yǎng)，該過程經(jīng)數(shù)次重復(fù)后能利用對經(jīng)基苯甲酸的微生物的比例在培養(yǎng)物中將大大提高，將培養(yǎng)液涂布于以對經(jīng)基苯甲酸為唯一碳源的瓊脂平板，得到的微生物菌落中的大部分都是能降解對經(jīng)基苯甲酸的微生物。挑取一部分單菌落分別接種到含有及缺乏對經(jīng)基苯甲酸的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，其中大部分在含有對經(jīng)基苯甲酸的培養(yǎng)基中生長，而在沒有對經(jīng)基苯甲酸的培養(yǎng)基中表現(xiàn)為沒有生長，說明通過該富集程序的確得到了欲分離的目標(biāo)微生物。通過富集培養(yǎng)使原本在自然環(huán)境中占少數(shù)的微生物的數(shù)量大大提高后，可以再通過稀釋倒平板或平板劃線等操作得到純培養(yǎng)物。

富集培養(yǎng)是微生物學(xué)家最強有力的技術(shù)手段之一。營養(yǎng)和生理條件的幾乎無窮盡的組合形式可應(yīng)用于從自然界選擇出特定微生物的需要。富集培養(yǎng)方法提供了按照意愿從自然界分離出特定已知微生物種類的有力手段，只要掌握這種微生物的特殊要求就行。富集培養(yǎng)法也可用來分離培養(yǎng)出由科學(xué)家設(shè)計的特定環(huán)境中能生長的微生物，盡管我們并不知道什么微生物能在這種特定的環(huán)境中生長。六、二元培養(yǎng)物分離的目的通常是要得到純培養(yǎng)。然而，在有些情況下這是做不到的或是很難做到的。但可用二元培養(yǎng)物作為純化培養(yǎng)的替代物。只有一種微生物的培養(yǎng)物稱為純培養(yǎng)物，含有二種以上微生物的培養(yǎng)物稱為混合培養(yǎng)物，而如果培養(yǎng)物中只含有二種微生物，而且是有意識地保持二者之間的特定關(guān)系的培養(yǎng)物稱為二元培養(yǎng)物。例如：二元培養(yǎng)物是保存病毒的最有效途徑，因為病毒是細胞生物的嚴(yán)格的細胞內(nèi)寄生物。有一些具有細胞的微生物也是嚴(yán)格的其他生物的細胞內(nèi)寄生物，或和其他生物有特殊的共生關(guān)系。對于這些生物，二元培養(yǎng)物是在實驗室控制條件下可能達到的最接近于純培養(yǎng)的培養(yǎng)方法。

在自然環(huán)境中，獵食細小微生物的原生動物也很容易用二元培養(yǎng)法在實驗室培養(yǎng)，培養(yǎng)物由原生動物和它獵食的微生物二者組成，例如，纖毛蟲、變形蟲和粘菌。對這些生物，二者的關(guān)系可能并不是嚴(yán)格的。這些生物中有些能夠純培養(yǎng)，但是其營養(yǎng)要求往往極端復(fù)雜，制備純培養(yǎng)的培養(yǎng)基很困難、很費事。七、微生物的保藏技術(shù)通過分離純化得到的微生物純培養(yǎng)物，還必須通過各種保藏技術(shù)使其在一定時間內(nèi)不死亡，不會被其他微生物污染，不會因發(fā)生變異而丟失重要的生物學(xué)性狀，否則就無法真正保證微生物研究和應(yīng)用工作的順利進行。

菌種或培養(yǎng)物保藏是一項最重要的微生物學(xué)基礎(chǔ)工作，微生物菌種是珍貴的自然資源，具有重要意義。許多國家都設(shè)有相應(yīng)的菌種保藏機構(gòu)，例如，中國微生物菌種保藏委員會（CCCCM)，中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，美國典型菌種保藏中心（ATCC)，美國的北部地區(qū)研究實驗室（NRRL)，荷蘭的霉菌中心保藏所（CBS)，英國的國家典型菌種保藏中心(NCTC）以及日本的大阪發(fā)酵研究所（IFO）等。國際微生物學(xué)聯(lián)合會（IAMS）還專門設(shè)立了世界菌種保藏聯(lián)合會（WFGC），用計算機儲存世界上各保藏機構(gòu)提供的菌種數(shù)據(jù)資料，可以通過國際互聯(lián)網(wǎng)查詢和索取，進行微生物菌種的交流、研究和使用。生物的生長一般都需要一定的水分，適宜的溫度和合適的營養(yǎng)，微生物也不例外。菌種保藏就是根據(jù)菌種特性及保藏目的的不同，給微生物菌株以特定的條件，使其存活而得以延續(xù)。

例如利用培養(yǎng)基或宿主對微生物菌株進行連續(xù)移種，或改變其所處的環(huán)境條件，例如干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)等，令菌株的代謝水平降低，乃至完全停止，達到半休眠或完全休眠的狀態(tài)，而在一定時間內(nèi)得到保存，有的可保藏幾十年或更長時間。在需要時再通過提供適宜的生長條件使保藏物恢復(fù)活力。1．傳代培養(yǎng)保藏傳代培養(yǎng)與培養(yǎng)物的直接使用密切相關(guān)，是進行微生物保藏的基本方法。常用的有瓊脂斜面、半固體瓊脂柱及液體培養(yǎng)等。采用傳代法保藏微生物應(yīng)注意針對不同的菌種而選擇使用適宜的培養(yǎng)基，并在規(guī)定的時間內(nèi)進行移種，以免由于菌株接種后不生長或超過時間不能接活，喪失微生物菌種。在瓊脂斜面上保藏微生物的時間因菌種的不同而有較大差異，有些可保存數(shù)年，而有些僅數(shù)周。一般來說，通過降低培養(yǎng)物的代謝或防止培養(yǎng)基干燥，可延長傳代保藏的保存時間。例如在菌株生長良好后，改用橡皮塞封口或在培養(yǎng)基表面覆蓋液體石蠟，并放置低溫保存；將一些菌的菌苔直接刮入蒸餾水或其他緩沖液后，密封置4℃保存，也可以大大提高某些菌的保藏時間及保藏效果，這種方法有時也被稱為懸液保藏法。由于菌種進行長期傳代十分繁瑣，容易污染，特別是會由于菌株的自發(fā)突變而導(dǎo)致菌種衰退，使菌株的形態(tài)、生理特性、代謝物的產(chǎn)量等發(fā)生變化，因此在一般情況下，在實驗室里除了采用傳代法對常用的菌種進行保存外，還必須根據(jù)條件采用其他方法，特別是對那些需要長期保存的菌種更是如此。2．冷凍保藏將微生物處于冷凍狀態(tài)，使其代謝作用停止以達到保藏的目的。大多數(shù)微生物都能通過冷凍進行保存，細胞體積大者要比小者對低溫更敏感，而無細胞壁者則比有細胞壁者敏感。其原因是低溫會使細胞內(nèi)的水分形成冰晶，從而引起細胞，尤其是細胞膜的損傷。進行冷凍時，適當(dāng)采取速凍的方法，可因產(chǎn)生的冰晶小而減少對細胞的損傷。當(dāng)從低溫下移出并開始升溫時，冰晶又會長大，故快速升溫也可減少對細胞的損傷。冷凍時的介質(zhì)對細胞的損傷也有顯著的影響。例如，0.5mol／L左右的甘油或二甲亞礬可透入細胞，并通過降低強烈的脫水作用而保護細胞；大分子物質(zhì)如糊精、血清蛋白、脫脂牛奶或聚乙烯毗咯烷酮（PVP）雖不能透人細胞，但可通過與細胞表面結(jié)合的方式而防止細胞膜受凍傷。因此，在采用冷凍法保藏菌種時，一般應(yīng)加人各種保護劑以提高培養(yǎng)物的存活率。

一般來說，保藏溫度越低，保藏效果越好。在常用的冷凍保藏方法中，液氮保藏可達到-196℃。因此，從適用的微生物范圍、存活期限、性狀的穩(wěn)定性等方面來看，該方法在迄今使用的各種微生物保藏方法中是較理想的一種。與此相應(yīng)，冰箱保藏使用更為普遍。在各種基因工程手冊中，一般都推薦在-70℃低溫冰箱中保存菌株或細胞的某些特殊生理狀態(tài)（添加甘油做保護劑），例如經(jīng)誘導(dǎo)建立了感受態(tài)的細胞。

在沒有低溫冰箱的條件下，也可利用-20—-30℃的普通冰箱冷凍室保存菌種。但應(yīng)注意加有保護劑的細胞混合物的共融點處在這個溫度范圍內(nèi)，常會由于冰箱可能產(chǎn)生的微小溫度變化引起培養(yǎng)物的反復(fù)融化和再結(jié)晶，而對菌體形成強烈的損傷。因此采用普通冰箱冷凍保存菌種的效果往往遠低于低溫冰箱，應(yīng)注意經(jīng)常檢查保藏物的存活情況，隨時轉(zhuǎn)種。3．干燥保藏法水分對各種生化反應(yīng)和一切生命活動至關(guān)重要，因此，干燥，尤其是深度干燥是微生物保藏技術(shù)中另一項經(jīng)常采用的手段。沙土管保存和冷凍真空干燥保藏是最常用的二項微生物干燥保藏技術(shù)。前者主要適用于產(chǎn)抱子的微生物，如芽抱桿菌、放線菌等。一般將菌種接種至斜面，培養(yǎng)至長出大量的抱子后，洗下抱子制備抱子懸液，加人無菌的沙土試管中，減壓干燥，直至將水分抽干，最后用石蠟、膠塞等封閉管口，置冰箱保存。此法簡便易行，并可以將微生物保藏較長時間，適合一般實驗室及以放線菌等為菌種的發(fā)酵工廠采用。

冷凍真空干燥保藏是將加有保護劑的細胞樣品預(yù)先冷凍，使其凍結(jié)，然后在真空下通過冰的升華作用除去水分。達到干燥的樣品可在真空或惰性氣體的密閉環(huán)境中置低溫保存，從而使微生物處于干燥、缺氧及低溫的狀態(tài)，生命活動處于休眠，可以達到長期保藏的目的。

用冰升華的方式除去水分，手段比較溫和，細胞受損傷的程度相對較小，存活率及保藏效果均不錯，而且經(jīng)抽真空封閉的菌種安瓶管的保存、郵寄、使用均很方便。因此冷凍真空干燥保藏是目前使用最普遍，也是最重要的微生物保藏方法，大多數(shù)專業(yè)的菌種保藏機構(gòu)均采用此法作為主要的微生物保存手段。除上述方法外，各種微生物菌種保藏的方法還有很多，如紙片保藏、薄膜保藏、寄主保藏等。由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對不同的保藏方法有不同的適應(yīng)性，迄今為止尚沒有一種方法能被證明對所有的微生物均適宜。因此，在具體選擇保藏方法時必須對被保藏菌株的特性、保藏物的使用特點及現(xiàn)有條件等進行綜合考慮。對于一些比較重要的微生物菌株，則要盡可能多的采用各種不同的手段進行保藏，以免因某種方法的失敗而導(dǎo)致菌種的喪失。絕大多數(shù)微生物的大小都遠遠低于肉眼的觀察極限，因此，一般必須借助顯微鏡放大系統(tǒng)的作用才能看到它們的個體形態(tài)和內(nèi)部構(gòu)造。除了放大外，決定顯微觀察效果的還有二個重要的因素，即分辨率和反差。分辨率是指能辨別兩點之間最小距離的能力，而反差是指樣品區(qū)別于背景的程度，它們與顯微鏡的自身特點有關(guān)，但也取決于進行顯微觀察時對顯微鏡的正確使用及良好的標(biāo)本制作和觀察技術(shù)，這就是顯微技術(shù)。第二節(jié)顯微鏡和顯微技術(shù)現(xiàn)代的顯微技術(shù)，不僅僅是觀察物體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)，而且發(fā)展到對物體的組成成分定性和定量，特別是與計算科學(xué)技術(shù)的結(jié)合出現(xiàn)的圖像分析、模擬仿真等技術(shù)，為探索微生物的奧秘增添了強大武器。一、顯微鏡的種類及原理1．普通光學(xué)顯微鏡光學(xué)顯微鏡在使用最短波長的可見光（λ＝450nm)作為光源時在油鏡下可以達到其最大分辨率0.18um。由于肉眼的正常分辨能力一般為0.25mm左右，因此光學(xué)顯微鏡有效的最高總放大倍數(shù)只能達到1000-1500倍，在此基礎(chǔ)上進一步提高顯微鏡的放大能力對觀察效果的改善并無幫助。分辨率(最小可分辨的距離)=0.5ληsinθ2．暗視野顯微鏡明視野顯微鏡的照明光線直接進人視野，屬透射照明。生活的細菌在明視野顯微鏡下觀察是透明的，不易看清。而暗視野顯微鏡則利用特殊的聚光器實現(xiàn)斜射照明，給樣品照明的光不直接穿過物鏡，而是由樣品反射或折射后再進人物鏡，因此，整個視野是暗的，而樣品是明亮的。

正如我們在白天看不到的星辰卻可在黑暗的夜空中清楚地顯現(xiàn)一樣，在暗視野顯微鏡中由于樣品與背景之間的反差增大，可以清晰地觀察到在明視野顯微鏡中不易看清的活菌體等透明的微小顆而且，即使所觀察微粒的尺寸小于顯微鏡的分辨率，依然可以通過它們散射的光而發(fā)現(xiàn)其存因此，暗視野法主要用于觀察生活細菌的運動性。3．相差顯微鏡光線通過比較透明的標(biāo)本時，光的波長（顏色）和振幅（亮度）都沒有明顯的變化，因此，用普通光學(xué)顯微鏡觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本（如活的細胞）時，其形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)往往難以分辨。然而，由于細胞各部分的折射率和厚度的不同，光線通過這種標(biāo)本時，直射光和衍射光的光程就會有差別。光的相位差人肉眼感覺不到，但相差顯微鏡配備有特殊的光學(xué)裝置--環(huán)狀光闌和相差板，利用光的干涉現(xiàn)象，能將光的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)槿搜劭梢圆煊X的振幅差（明暗差），從而使原來透明的物體表現(xiàn)出明顯的明暗差異，對比度增強。正由于樣品的這種反差是以不同部位的密度差別為基礎(chǔ)形成的，因此，相差顯微鏡使人們能在不染色的情況下比較清楚地觀察到在普通光學(xué)顯微鏡和暗視野顯微鏡下都看不到或看不清的活細胞及細胞內(nèi)的某些細微結(jié)構(gòu)，是顯微技術(shù)的一大突破，為此，其發(fā)明人F.Zernike獲得了1953年的諾貝爾物理學(xué)獎。

4．熒光顯微鏡有些化合物（熒光素）可以吸收紫外線并轉(zhuǎn)放出一部分光波較長的可見光，這種現(xiàn)象稱為熒光。因此，在紫外線的照射下，發(fā)熒光的物體會在黑暗的背景下表現(xiàn)為光亮的有色物體，這就是熒光顯微技術(shù)的原理。由于不同熒光素的激發(fā)波長范圍不同，因此同一樣品可以同時用二種以上的熒光素標(biāo)記，它們在熒光顯微鏡下經(jīng)過一定波長的光激發(fā)發(fā)射出不同顏色的光。熒光顯微技術(shù)在免疫學(xué)、環(huán)境微生物學(xué)、分子生物學(xué)中應(yīng)用十分普遍。

5．透射電子顯微鏡由于顯微鏡的分辨率取決于所用光的波長，人們從20世紀(jì)初開始就嘗試用波長更短的電磁波取代可見光來放大成像，以制造分辨本領(lǐng)更高的顯微鏡。1933年，德國人E.Ruska制成了世界上第一臺以電子作為“光源”的顯微鏡-電子顯微鏡。在理論上，電子波的波長最短可達到0.005nm，所以電子顯微鏡的分辨能力要遠高于光學(xué)顯微鏡。幾十年來，電子顯微技術(shù)發(fā)展很快，應(yīng)用也日益廣泛，對包括微生物學(xué)在內(nèi)的許多學(xué)科的進步都起了巨大的推動作用。為了表彰

E.Ruska

及后來發(fā)明掃描隧道顯微鏡的G.Binning和H.Rohrer在顯微技術(shù)方面所做的開拓性工作，1986年他們?nèi)斯餐@得了當(dāng)年的諾貝爾物理學(xué)獎。

6．掃描電子顯微鏡掃描電子顯微鏡（Scanningelectronmicroscope,SEM）與光學(xué)顯微鏡和透射電鏡不同，它的工作原理類似于電視或電傳真照片。電子槍發(fā)出的電子束被磁透鏡匯聚成極細的電子“探針”，在樣品表面進行“掃描”，電子束掃到的地方就可激發(fā)樣品表面放出二次電子（同時也有一些其他信號）。二次電子產(chǎn)生的多少與電子束人射角度有關(guān)，也即是與樣品表面的立體形貌有關(guān)。與此同時，在觀察用的熒光屏上另一個電子束也做同步的掃描。二次電子由探測器收集，并在那里被閃爍器變成光信號，再經(jīng)光電倍增管和放大器又變成電壓信號來控制熒光屏上電子束的強度。這樣，樣品上產(chǎn)生二次電子多的地方，在熒光屏上相應(yīng)的部位就越亮，我們就能得到一幅放大的樣品立體圖像。掃描電鏡主要被用于觀察樣品的表面結(jié)構(gòu)。此外，在掃描電鏡中，電子束的轟擊使樣品表面除放出二次電子外，還可產(chǎn)生許多有用的物理信號，如特征性X光譜線、陰極熒光、背散射電子、俄歇電子及樣品電流等。對這些信號進行分別收集、分析，還能得到有關(guān)樣品的其他信息。例如收集X射線信號，可以對樣品各個微區(qū)的元素組成進行分析。7．掃描隧道顯微鏡在光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡的結(jié)構(gòu)和性能得到不斷完善的同時，基于其他各種原理的顯微鏡也不斷問世，使人們認(rèn)識微觀世界的能力和手段得到不斷提高。其中20世紀(jì)80年代才出現(xiàn)的掃描隧道顯微鏡（scanningtunnelingmicroscope，STM）是顯微鏡領(lǐng)域的新成員，主要原理是利用了量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)。

STM有一個半徑極細的金屬探針，其針尖通常小到只有一個原子，可利用壓電陶瓷將其推進到待測樣品表面很近的距離（0.5-2nm）進行掃描。在這樣近的距離內(nèi)，針尖頂部可以接觸到樣品表面的電子云，但又不致?lián)p壞樣品。此時在探針和樣品之間加零點幾伏的電壓，將有納安級的電流產(chǎn)生，這電流就是隧道效應(yīng)電流。該電流對針尖至樣品表面的距離非常敏感。當(dāng)距離改變一個原子臺階的大?。?.3nm)，電流將改變1000倍。利用電子學(xué)反饋控制系統(tǒng)保持探針掃描時的電流或高度恒定，就可以通過記錄電壓或電流的變化而了解樣品的表面形貌。STM的橫向分辨率可以達到0.1-0.2nm，縱向分辨率可以達到0.001nm，是目前分辨率最高的顯微鏡，足以對單個的原子進行觀察。此外，由于STM在掃描時不接觸樣品，又沒有高能電子束轟擊，原則上講可以避免樣品的變形。而且，它不僅可以在真空，而且可以在保持樣品生理條件的大氣及液體環(huán)境下工作。因此，STM對生命科學(xué)研究領(lǐng)域具有十分重要的意義。目前，人們已利用STM直接觀察到DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物大分子，及生物膜、古生菌的細胞壁、病毒等結(jié)構(gòu)。二、顯微觀察樣品的制備樣品制備是顯微技術(shù)的一個重要環(huán)節(jié)，直接影響著顯微觀察效果的好壞。一般來說，在利用顯微鏡觀察、研究生物樣品時，除要根據(jù)所用顯微鏡使用的特點采用合適的制樣方法外，還應(yīng)考慮生物樣品的特點，盡可能地使被觀察樣品的生理結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，并通過各種手段提高其反差。

1．光學(xué)顯微鏡的制樣光學(xué)顯微鏡是微生物學(xué)研究的最常用工具，有活體直接觀察和染色觀察二種基本使用方法。

(l）活體觀察可采用壓滴法、懸滴法及菌絲埋片法等在明視野、暗視野或相差顯微鏡下對微生物活體進行直接觀察。其特點是可以避免一般染色制樣時的固定作用對微生物細胞結(jié)構(gòu)的破壞，并可用于專門研究微生物的運動能力、攝食特性及生長過程中的形態(tài)變化，如細胞分裂、芽抱萌發(fā)等動態(tài)過程。①壓滴法將菌懸液滴于載玻片上，加蓋蓋玻片后立即進行顯微鏡觀察。②懸滴法在蓋玻片中央加一小滴菌懸液后反轉(zhuǎn)置于特制的凹載玻片上后進行顯微鏡觀察，為防止液滴蒸發(fā)變干，一般還應(yīng)在蓋玻片四周加封凡士林。③菌絲埋片法將無菌小塊玻璃紙鋪于平板表面，涂布放線菌或霉菌抱子懸液，經(jīng)培養(yǎng)，取下玻璃紙置于載玻片上，用顯微鏡對菌絲的形態(tài)進行觀察。

(2）染色觀察一般微生物菌體小而無色透明，在光學(xué)顯微鏡下，細胞體液及結(jié)構(gòu)的折光率與其背景相差很小，因此用壓滴法或懸滴法進行觀察時，只能看到其大體形態(tài)和運動情況。若要在光學(xué)顯微鏡下觀察其細致形態(tài)和主要結(jié)構(gòu)，一般都需要對它們進行染色，從而借助顏色的反襯作用提高觀察樣品不同部位的反差。

染色則根據(jù)方法和染料等的不同可分為很多種類，如細菌的染色，可簡單概括如下：2．電子顯微鏡的制樣生物樣品在進行電鏡觀察前必須進行固定和干燥，否則鏡筒中的高真空會導(dǎo)致其嚴(yán)重脫水，失去樣品原有的空間構(gòu)型。此外，由于構(gòu)成生物樣品的主要元素對電子的散射與吸收的能力均較弱，在制樣時一般都需要采用重金屬鹽染色或噴鍍，以提高其在電鏡下的反差，形成明暗清晰的電子圖像。(l）透射電鏡的樣品制備電子的穿透能力有限，因此透射電鏡采用覆蓋有支持膜的載網(wǎng)來承載被觀察的樣品。最常用的載網(wǎng)是銅網(wǎng)，也有用不銹鋼、金、銀、鎳等其他金屬材料制備的載網(wǎng)。而支持膜可用塑料膜（如火棉膠膜、聚乙烯甲醛膜等），也可以用碳膜或者金屬膜（如鐵膜等）。①負(fù)染技術(shù)

與將樣品本身染色來提高反差的方法相反，負(fù)染色技術(shù)是用電子密度高、本身不顯示結(jié)構(gòu)且與樣品幾乎不反應(yīng)的物質(zhì)（如磷鎢酸鈉或磷鎢酸鉀）來對樣品進行“染色”。這些重金屬鹽不被樣品成分所吸附而是沉積到樣品四周，如果樣品具有表面結(jié)構(gòu)，這種物質(zhì)還能進人表面上凹陷的部分，從而可以通過散射電子能力的差異把樣品的外形與表面結(jié)構(gòu)清楚地襯托出來。負(fù)染技術(shù)簡便易行，病毒、細菌（特別是細菌鞭毛）、離體細胞器、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子等的形態(tài)大小和表面結(jié)構(gòu)都可以采用這種制樣方法進行觀察。②投影技術(shù)在真空蒸發(fā)設(shè)備中將鉑或鉻等對電子散射能力較強的金屬原子，由樣品的斜上方進行噴鍍，提高樣品的反差。樣品上噴鍍上金屬的一面散射電子的能力強，表現(xiàn)為暗區(qū)，而沒有噴鍍上金屬的部分散射電子能力弱，表現(xiàn)為亮區(qū)，其效果就如同太陽光斜射形成的影子，使我們能了解樣品的高度和立體形狀。投影法可用于觀察病毒、細菌鞭毛、生物大分子等微小顆粒。③超薄切片技術(shù)盡管微生物的個體通常都極其微小，但除病毒外，微弱的電子束仍無法透過一般微生物如細菌的整體標(biāo)本，需要制作成100nm以下厚度的超薄切片，方能看清其內(nèi)部的細微結(jié)構(gòu)。此外，從細菌、立克次氏體、螺旋體、病毒等病原體與宿主細胞的關(guān)系，對宿主細胞引起的超微形態(tài)的改變，以及如病毒對宿主細胞的吸附、進人、繁殖等機理的研究，也都需要將宿主的組織或培養(yǎng)細胞制作超薄切片后才能用透射電鏡觀察?？梢哉f，超薄切片技術(shù)是生物學(xué)中研究細胞及組織超微結(jié)構(gòu)的最常用、最重要的電鏡樣品制備技術(shù)，其基本操作步驟如下。

取樣～固定一脫水～浸透與包埋～切片～撈片～染色～觀察。

(2）掃描電鏡的樣品制備掃描電鏡的結(jié)構(gòu)特點是利用電子束作光柵狀掃描以取樣品的形貌信息。因此，其樣品制備方法比透射電鏡要簡單，它主要要求樣品干燥，并且表面能夠?qū)щ?。對大多?shù)生物材料來說，細胞含有大量的水分，對表面不導(dǎo)電，所以觀察前必須進行處理，去除水分，對表面噴鍍金屬導(dǎo)電層。在這過程中必須始終保持樣品不變形，這樣，最后的觀察才能反映樣品本來面目。保持樣品形狀的主要關(guān)鍵是樣品干燥。干燥方法有自然干燥、真空干燥、冷凍干燥和臨界點干燥等。其中臨界點干燥的效果最好，其原理是利用許多物質(zhì)，如液態(tài)CO2，在一個密閉容器中達到一定的溫度和壓力后，氣液相面消失（即所謂的臨界點狀態(tài)）的性質(zhì)，使樣品在沒有表面張力的條件下得到干燥，很好地保持樣品的形態(tài)。干燥、噴鍍金屬層后的樣品便可用于觀察。第三節(jié)食品中微生物檢測技術(shù)食品中的微生物檢驗，在食品衛(wèi)生學(xué)中是作為判定食品被微生物污染程度的標(biāo)志，也可作為觀察食品中微生物的性質(zhì)以及微生物在食品中繁殖的動態(tài)，以便對被檢的食品進行衛(wèi)生學(xué)評價時提供科學(xué)依據(jù)。主要介紹近些年來國際、國內(nèi)常見的用于食品衛(wèi)生檢測的微生物快速檢驗方法，以及各類致病菌的初篩檢測。通過了解這些內(nèi)容，不需要太多的專業(yè)培訓(xùn)和經(jīng)驗就可以使基層檢驗部門和生產(chǎn)廠家的檢驗人員掌握，把好食品人口前的第一關(guān)。在此需要指出的是快速方法并不專指在檢測時間上能夠提前，還有一些快速方法是用在簡化操作上，比如，樣品制備、實驗準(zhǔn)備（培養(yǎng)基、實驗器具的改進等）、操作過程的簡化或自動化、培養(yǎng)條件的改善等等。一、微生物數(shù)量的快速檢測常規(guī)方法中的“菌落總數(shù)測定”和“霉菌和酵母數(shù)的測定”主要是用于評價食品品質(zhì)的，而“大腸菌群測定”則是評價食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。這些方法往往需要將細菌培養(yǎng)成肉眼可見的菌落才可確認(rèn)，所以比較麻煩，需要用特定的培養(yǎng)基培養(yǎng)、計數(shù)，且必須在