第五章 分子生物學(xué)研究方法(上)

第五章分子生物學(xué)研究方法

DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù)DNA分子的切割與連接核酸分子雜交凝膠電泳細(xì)胞轉(zhuǎn)化核酸序列分析基因的人工合成基因操作基因的定點(diǎn)突變PCR擴(kuò)增等核心技術(shù)分子生物學(xué)研究從20世紀(jì)中葉開(kāi)始得到高速發(fā)展，其中最主要的原因就是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究方法、特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步。5.1重組DNA技術(shù)回顧——三大成就：1、20世紀(jì)40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問(wèn)題；（1928FrederickGriffith&1944OswaldAveryTransformationofStreptococcuspneumoniae）2、50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問(wèn)題。但是：如果沒(méi)有分離和富集單一DNA分子的技術(shù)，科學(xué)家就無(wú)法對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行直接的生化分析。僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶進(jìn)行DNA的切割和重組遠(yuǎn)不能滿足基因研究的需要。DNA片段在體外不具備自我復(fù)制能力，要想得到足夠量和足夠純度的DNA，必須將它們連接到具備自主復(fù)制能力的DNA分子上（載體上），并轉(zhuǎn)入寄主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖。這就是基因克隆或分子克隆。1970年，Mandel和Higa發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌細(xì)胞經(jīng)適量氯化鈣處理后，能有效地吸收λ噬菌體DNA。1972年，Cohen等人又報(bào)道，經(jīng)氯化鈣處理的大腸桿菌細(xì)胞同樣能夠攝取質(zhì)粒DNA。從此，大腸桿菌就成了分子克隆中最常用的轉(zhuǎn)化受體。5.2DNA基本操作技術(shù)

5.2.1核酸的凝膠電泳自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來(lái)，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段，也是現(xiàn)在通用的許多分子生物學(xué)研究方法。DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性內(nèi)切酶片段分析以及限制酶切作圖等的技術(shù)基礎(chǔ)，受到科學(xué)界的高度重視。

1、基本原理一種分子在電場(chǎng)中，它會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。把這種電泳分子在電場(chǎng)作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場(chǎng)強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比。電場(chǎng)強(qiáng)度越大，電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)量越多，其遷移的速度越快，反之則較慢。由于在電泳中用無(wú)反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì)，如瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠等，故電泳的遷移率與分子的摩擦系數(shù)成反比。圖3-2：以禽巴氏桿菌C48-3株基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增的

cp39基因M：DNAmarkerofDL1500；1：PCR產(chǎn)物；2：陰性對(duì)照。M：標(biāo)準(zhǔn)DNA-DL2000；1：PCRproducts;2：Negativecontrol.圖2-2：體內(nèi)外培養(yǎng)禽巴氏桿菌莢膜蛋白的SDS結(jié)構(gòu)M：低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1-4：體外培養(yǎng)的X-73，C48-3，P-1059和C51-3株莢膜蛋白；5-8：體內(nèi)培養(yǎng)的巴氏桿菌X-73，C48-3，P-1059和C51-3株莢膜蛋白。

脈沖電場(chǎng)凝膠電泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE)這種電泳是在兩個(gè)不同方向的電場(chǎng)周期性交替進(jìn)行的。DNA分子在交替變換方向的電場(chǎng)中作出反應(yīng)所需的時(shí)間取決于它的大小。該方法可分離長(zhǎng)至5Mb的DNA分子。嚴(yán)格說(shuō)來(lái)，應(yīng)叫交替電場(chǎng)凝膠電泳。5.2.2細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖細(xì)菌轉(zhuǎn)化（transformation）一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自供體菌株的DNA而導(dǎo)致性狀特征改變的過(guò)程。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫做供體菌，接受轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)菌菌株則被稱為受體菌。感受態(tài)：

細(xì)菌能從周圍環(huán)境中吸收DNA的生理狀態(tài)稱為感受態(tài)(competence).

感受態(tài)的出現(xiàn)是由于細(xì)菌表面出現(xiàn)許多DNA結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)只能與雙鏈DNA結(jié)合，而不與單鏈DNA結(jié)合。這說(shuō)明完整的雙鏈結(jié)構(gòu)對(duì)于轉(zhuǎn)化活性來(lái)說(shuō)是必要的；DNA的進(jìn)入和整合均為單鏈狀態(tài)。細(xì)菌轉(zhuǎn)化的一種可能機(jī)制（1）細(xì)菌感受態(tài)的形成（2）轉(zhuǎn)化子的吸收（3）整合符合物前體的形成（4）單鏈DNA轉(zhuǎn)化子的整合（5）轉(zhuǎn)化子的形成

1.

CaCl2誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法

Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌.其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)叫做感受態(tài)(Competence)。(a)在0℃的CaCl2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生膨脹，同時(shí)Ca2+

使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離，形成感受態(tài)。(b)Ca2+

與DNA分子結(jié)合，形成抗DNase的羥基－磷酸鈣復(fù)合物，并粘附在細(xì)菌表面。(c)當(dāng)42℃熱刺激短暫處理細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動(dòng)，并隨之出現(xiàn)許多縫隙，為DNA分子提供了進(jìn)入細(xì)胞的通道。CaCl2誘導(dǎo)法的可能機(jī)制大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化（1）取100μl感受態(tài)細(xì)胞，加入相當(dāng)于50ng載體的重組DNA連接液，混勻；（2）冰浴放置半小時(shí)；（3）在42℃保溫2分鐘（熱脈沖）；（4）快速將轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1-2分鐘；（5）加入1ml新鮮培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)1小時(shí)；（6）涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選。轉(zhuǎn)化率：5×106~2×107個(gè)轉(zhuǎn)化子/ug質(zhì)粒將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場(chǎng)。在強(qiáng)大電場(chǎng)的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡(jiǎn)單，而且?guī)缀鯇?duì)所有含細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大。2.電擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌:

優(yōu)化參數(shù)—電場(chǎng)強(qiáng)度、電脈沖長(zhǎng)度、

DNA的濃度。轉(zhuǎn)化率：109-1010轉(zhuǎn)化子/μgDNA.電穿孔轉(zhuǎn)化儀感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化體總數(shù)=菌落數(shù)×（轉(zhuǎn)化反應(yīng)總體積/涂板菌液體積）插入頻率=白色菌落數(shù)/（白色菌落數(shù)+藍(lán)色菌落數(shù)）轉(zhuǎn)化頻率=轉(zhuǎn)化體總數(shù)/加入質(zhì)粒DNA總量（ug）5.2.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

PolymeraseChainReaction(PCR)1.PCR的定義在引物指導(dǎo)下由酶催化的對(duì)特定克隆或基因組DNA序列進(jìn)行的體外擴(kuò)增反應(yīng)。2.PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)（1）特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等；（2）能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍。3.PCR技術(shù)原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。模板DNA變性：加熱至94℃左右，雙鏈DNA解離成單鏈；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP為原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的雙鏈；重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。PCR過(guò)程（1）denaturatation（2）Primerannealing（3）PrimerextensionPCRproductPCR反應(yīng)曲線4.PCR的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系10×PCR緩沖液10μl

4種dNTP混合物各200μmol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2μg

TaqDNA聚合酶2.5U

Mg2+

1.5mM

無(wú)菌D.W

100ul5.PCR反應(yīng)五要素primerTaqDNApolymerasedNTP:dATP、dGTP、dCTP、dTTP

TemplateDNA

Mg2+（1）引物A.引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵;B.PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度.引物設(shè)計(jì)的原則①引物長(zhǎng)度：15-30個(gè)堿基，常為20個(gè)堿基左右;②引物擴(kuò)增跨度：以500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段;③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,ATGC最好隨機(jī)分布.④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)避免兩引物間互補(bǔ)，特別是3`端⑤引物3`端的堿基要求嚴(yán)格配對(duì)特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基⑥引物中可以加上合適的酶切位點(diǎn)要作酶切時(shí)加⑦引物的特異性引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性（2）酶濃度A.

TaqDNA聚合酶注：無(wú)3`→5`方向的校正活性B.一個(gè)典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U。濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。（3）dNTP的質(zhì)量與濃度dNTP質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系。A.dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解；B.在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為20～200μM，注意4種dNTP的濃度要相等。（4）模板DNA模板DNA的含量與純度，是PCR成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。（5）Mg2+濃度A.Mg2+對(duì)擴(kuò)增特異性和產(chǎn)量有顯著影響:

Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低；濃度過(guò)低會(huì)降低TaqDNA聚合酶活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。B.在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200μM時(shí)，Mg2+濃度為1.5-2mM為宜。6.PCR熱循環(huán)條件的選擇PCR反應(yīng)條件:溫度時(shí)間循環(huán)次數(shù)(1)溫度與時(shí)間的設(shè)置●設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)：

1）93-95℃變性

2）40-60℃退火

3）70-75℃延伸●對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度為100～300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（2）循環(huán)次數(shù)●決定PCR擴(kuò)增程度

●主要取決于模板DNA的濃度

●選在25～40次之間（3）延伸溫度與時(shí)間A.延伸溫度：一般在70～75℃之間，常用溫度為72℃；B.延伸反應(yīng)時(shí)間：根據(jù)待擴(kuò)增片段長(zhǎng)度而定,1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min。注意：

A.延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增；B.對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。（4）引物的復(fù)性溫度

當(dāng)引物長(zhǎng)度為15-20個(gè)堿基時(shí)，在高離子強(qiáng)度中反應(yīng)（如1MNaCl）。

Tm=4（G+C）+

2（A+T）復(fù)性溫度=Tm值-（5～10℃）復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合7.PCR技術(shù)的應(yīng)用（1）基因組中特異片段克?。?）RT-PCR（3）基因的體外誘變（4）基因組的比較研究5.2.4實(shí)時(shí)定量PCR（RealtimequantitativePCR）建立實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)的必要性常規(guī)PCR：可擴(kuò)增特定核苷酸片斷；用凝膠電泳可檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（定性）；同位素標(biāo)記及光密度掃描技術(shù)可檢測(cè)PCR產(chǎn)物量（定量）。研究證明：PCR產(chǎn)物總量變異系數(shù)常常達(dá)到10%-30%。但是我們所感興趣的是未經(jīng)PCR信號(hào)放大之前的起始模板量。如我們想知道某一轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)或者某一特定基因在特定組織中的表達(dá)量。在這種需求下實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。熒光定量PCR的原理PCR擴(kuò)增呈指數(shù)增長(zhǎng)，在反應(yīng)體系和條件完全一致的情況下，樣本DNA含量與擴(kuò)增產(chǎn)物的對(duì)數(shù)成正比，由于反應(yīng)體系中的熒光染料或熒光探針與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合發(fā)光，其熒光量與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，因此通過(guò)熒光量的檢測(cè)就可以測(cè)定樣本核酸量。實(shí)時(shí)定量PCR和常規(guī)PCR的區(qū)別（1）常規(guī)PCR是通過(guò)瓊脂糖電泳對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的最終產(chǎn)物進(jìn)行定性分析（定量不準(zhǔn)確）；（2）熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，使每一個(gè)循環(huán)變得“可見(jiàn)”，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的DNA或cDNA的起始濃度進(jìn)行定量的方法（準(zhǔn)確定量）。Non-specificDNAbindingdyes:-SYBR?GreenI-SYBR?Gold-EthidiumBromide非特異性嵌入熒光染料評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：與特異性的熒光探針相比價(jià)格便宜只需要設(shè)計(jì)PCR引物缺點(diǎn)：由于它和模板的結(jié)合是非特異性的，它可以和所有的雙鏈DNA包括引物和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，不能真實(shí)反映目的基因的擴(kuò)增情況。特異性熒光探針將特異性寡核苷酸被熒光素標(biāo)記，制備熒光標(biāo)記的DNA探針。通過(guò)探針與PCR產(chǎn)物特異性的結(jié)合，可均相、實(shí)時(shí)定量檢測(cè)在整個(gè)PCR過(guò)程中產(chǎn)量。TaqMan探針：一段5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)(R)，3’端標(biāo)記猝滅熒光基團(tuán)(Q)的寡核苷酸，其序列與模板DNA中的一段完全互補(bǔ)。當(dāng)探針單獨(dú)存在時(shí)，由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生,R熒光受到Q的猝滅。在PCR過(guò)程中，由于TaqDNA酶的5’→3’外切酶活性的作用，使探針的5’端的R被切除，加大了與Q的距離而使熒光恢復(fù)。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來(lái)的熒光基團(tuán)不斷積累。因此，Taqman探針檢測(cè)的是積累熒光。TaqMan探針評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：熒光信號(hào)強(qiáng)與其它探針相比設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單可用于多通道檢測(cè)

缺點(diǎn)：比DNA結(jié)合染料價(jià)格高（ThresholdCycle，Ct）閾值在PCR擴(kuò)增過(guò)程中擴(kuò)增產(chǎn)物熒光信號(hào)超過(guò)基線值或進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)的循環(huán)數(shù)。熒光擴(kuò)增曲線可分3個(gè)階段熒光背景信號(hào)階段：擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段：PCR產(chǎn)量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。平臺(tái)期：擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR終產(chǎn)物量與起始模板量間無(wú)線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。5.2.5基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建基因組文庫(kù)：含有某種生物全部遺傳信息的重組DNA分子(克隆)的總和基因組文庫(kù)特點(diǎn)：由于基因組文庫(kù)來(lái)自于某一物種的基因組，而該物種所有組織中的基因組均相同，所以基因組文庫(kù)具有種屬特異性，無(wú)組織特異性。cDNA文庫(kù)—cDNA文庫(kù)來(lái)自于某一物種某種組織的mRNA，所以cDNA文庫(kù)既有種屬特異性，也有組織特異性?；蚪M文庫(kù)的大小理論值:基因組文庫(kù)的克隆數(shù)目＝基因組DNA總長(zhǎng)/DNA插入片段的平均長(zhǎng)度。例如：細(xì)菌基因組DNA總長(zhǎng)度=3×106kb

酶切后的DNA片段平均長(zhǎng)度=15kb

基因組文庫(kù)的克隆數(shù)=3×106kb/15kb=2×

105個(gè)克隆經(jīng)驗(yàn)值：N—基因組文庫(kù)克隆總數(shù)P—在基因組文庫(kù)中目的基因DNA片段的出現(xiàn)概率f—插入片段大小與基因組DNA大小比值N=Ln(1–P)Ln(1–f)例如：基因組文庫(kù)中含目的基因DNA片段的出現(xiàn)概率達(dá)到99%，即P=0.99。N=Ln(1–0.99)Ln(1–15/3×106)=9×106經(jīng)驗(yàn)值比理論值越大4.5倍5.3RNA基本操作技術(shù)真核生物基因組DNA非常龐大，而且含有大量重復(fù)序列，無(wú)論用電泳分離還是用雜交方法都難以直接分離到靶基因片段。

cDNA則來(lái)自反轉(zhuǎn)錄的mRNA，不含冗余的序列，通過(guò)特異性探針篩選cDNA文庫(kù)，可以較快地分離到相關(guān)基因。5.3.1總RNA的提取

總RNA包括：mRNA，rRNA，tRNA以及sRNA。動(dòng)物細(xì)胞：約含10-5ug/細(xì)胞

totalRNA：rRNA—80%~85%tRNA以及sRNA—15%~20%mRNA—1%~5%總RNA的抽提方法常用的方法：異硫氰酸胍-苯酚抽提法迅速破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的RNA釋放出來(lái)并使核糖體蛋白與RNA分子分離，還能保證RNA的完整。RNA濃度和純度測(cè)定：

OD260=1，RNA濃度為40ug/ml；

OD260/OD280=1.8~2.0，RNA純度較好；

OD260/OD280〉1.8，蛋白質(zhì)或酚污染。RNA的瓊脂糖電泳檢測(cè)：變性條件下進(jìn)行瓊脂糖電泳，因?yàn)镽NA易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)而且易降解。常用變性劑是有甲醛、尿素等。5.3.2mRNA的純化根據(jù)真核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)特征來(lái)純化mRNA。5.3.3cDNA的合成

cDNA合成包括第一鏈和第二鏈的合成。以mRNA為模板，用oligodT和反轉(zhuǎn)錄酶合成第一條cDNA。用RNaseH

切割mRNA-cDNA雜合鏈中的mRNA成小片段后，以第一條cDNA為模板，用DNA聚合酶合成出第二條cDNA。5.3.4cDNA文庫(kù)的構(gòu)建由于cDNA的長(zhǎng)度一般在0.5~8kb，常用的質(zhì)粒載體和噬菌體載體都能滿足要求。cDNA文庫(kù)載體選擇要根據(jù)該文庫(kù)的用途來(lái)確定。例如：Uni-zapXR載體是一種λ噬菌體載體，具有噬菌體的高效性和質(zhì)粒載體系統(tǒng)可利用藍(lán)白色篩選的便利，可容納10kbDNA插入片段，重組載體通過(guò)體內(nèi)剪切反應(yīng)（invivoexcision）將cDNA插入片段轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒系統(tǒng)中，克隆和序列分析。5.3.5基因文庫(kù)的篩選通過(guò)某種特殊方法從基因文庫(kù)中鑒定出含有目的基因片段的特定克隆的過(guò)程。核酸雜交法用放射性同位素標(biāo)記的特異DNA探針適用于高密度的菌落雜交篩選。2.PCR篩選法

PCR篩選法與核酸雜交法具有同樣的通用性，而且操作簡(jiǎn)便，但前提是已知足夠的序列信息并獲得基因特異性引物。3.免疫篩選法

免疫篩選法是基于抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，所以該法適用于表達(dá)型文庫(kù)的篩選。5.4SNP的理論與應(yīng)用單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）是指基因組DNA序列中單核苷酸（A、T、C和G）的變異所引起的DNA序列多態(tài)性?；蚪MDNA同一位點(diǎn)上的堿基類叫做一個(gè)等位位點(diǎn)。SNP是基因組中最簡(jiǎn)單、最常見(jiàn)的多態(tài)性形式，具有很高的遺傳穩(wěn)定性。5.4.1SNP的概述一個(gè)SNP表示在基因組DNA某個(gè)位點(diǎn)上一個(gè)核苷酸的變化，這種變化可能是轉(zhuǎn)換（C?T，在其互補(bǔ)鏈上則為G?A），也可能是顛換（C?A，G?T，C?G，A?

T），具有轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占SNP總量的2/3左右。

SNP廣泛存在于人類基因組中，其發(fā)生頻率約為1%或更高。據(jù)估計(jì)，人類DNA中每300~1000bp就有一個(gè)SNP，因此，一個(gè)人類個(gè)體大約攜帶300萬(wàn)~1000萬(wàn)個(gè)SNPs。位于染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點(diǎn)被稱作單倍型（haplotype），相鄰SNPs的等位位點(diǎn)傾向于以一個(gè)整體遺傳個(gè)后代。例如：玉米儲(chǔ)藏蛋白的8個(gè)基因型共包含了3個(gè)單倍型(H1，H2和H3)，它們分別由多個(gè)相鄰的SNP所構(gòu)成。H2H15.4.2SNP的檢測(cè)技術(shù)限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP)、毛細(xì)管電泳和變性高效液相色譜（DHPLC）等。由于這些技術(shù)都必須通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行分析，通量受到限制。且這些方法僅能判斷SNP的有無(wú)而不能知道確切的堿基類型，只要進(jìn)行DNA測(cè)序分析才能確認(rèn)所發(fā)現(xiàn)的SNP?；蚍中停╣enotyping）：利用數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的SNP進(jìn)行特定人群的序列和發(fā)生頻率的研究，包括基因芯片技術(shù)、Taqman技術(shù)、分子信標(biāo)技術(shù)（molecularbeacon）和焦磷酸測(cè)序法等。1.基因芯片技術(shù)（Genechip）

固相支持介質(zhì)上進(jìn)行雜交和原位熒光檢測(cè)的一種高通量SNP分析方法。通過(guò)優(yōu)化芯片雜交程度，使探針只與完全互補(bǔ)的序列能雜交，而不能與含有錯(cuò)配的堿基的序列雜交。待測(cè)基因樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增及熒光化學(xué)標(biāo)記后與固定的探針進(jìn)行雜交。

由于目標(biāo)基因和探針雜交的程度與熒光強(qiáng)度及種類相關(guān)，因此通過(guò)熒光掃描，可根據(jù)熒光強(qiáng)弱或熒光的種類檢測(cè)出被檢序列的堿基類別?；蛐酒夹g(shù)固體平面(玻片、尼龍薄膜)DNA樣品微點(diǎn)的排列DNA/DNAorDNA/RNA堿基配對(duì)原則熒光標(biāo)記的探針cDNA芯片制備、工作過(guò)程cDNA文庫(kù)vectorPCR96-wellplate雜交、洗滌、掃描…………….…………….……