第九章 植物細胞培養(yǎng)

第九章植物細胞培養(yǎng)第一節(jié)單細胞培養(yǎng)第二節(jié)細胞懸浮培養(yǎng)第三節(jié)植物細胞生長和活力的測定第四節(jié)植物細胞培養(yǎng)的應用

植物細胞培養(yǎng)，即對植物器官或愈傷組織上分離的單細胞(或小細胞團)進行培養(yǎng)，形成單細胞無性系或再生植株的技術。第一節(jié)單細胞培養(yǎng)一、定義單細胞培養(yǎng)：對分離得到的單個細胞進行培養(yǎng)，誘導其分裂增殖，形成細胞團，再經(jīng)過分化形成芽、根等器官或胚狀體，甚至長成完整植株的技術。二、意義1、建立單細胞無性系2、對培養(yǎng)的單細胞可以誘發(fā)突變3、排除體細胞干擾4、遺傳轉化受體的建立三、單細胞的分離葉組織是分離單細胞的最好材料，1、機械法：葉片組織輕輕研碎，勻漿過濾或離心，得到純化細胞。特點：細胞不受酶傷害，不會發(fā)生質壁分離。

不適用于所有植物2、酶解法：利用果膠酶處理葉片，使細胞間的中膠層發(fā)生降解，分離出具有代謝活性的細胞。特點：必須對酶溶液給予滲透壓保護，防止細胞脹裂。四、單細胞培養(yǎng)方法（一）看護培養(yǎng)法

用一塊活躍生長的愈傷組織塊來看護單個細胞，并使其生長和增殖的方法。（1）取處于活躍生長期約1厘米大小愈傷組織塊。（2）無菌條件下，愈傷組織塊安放在培養(yǎng)瓶中，在愈傷組織上放約1厘米平方的無菌濾紙片。置培養(yǎng)室中放過夜。（3）從懸浮培養(yǎng)物或疏松的愈傷組織上分離出單細胞，并把單細胞接種在培養(yǎng)瓶中的濾紙上面。（4）恒溫培養(yǎng)。（二）微室培養(yǎng)法

人工制造一個小室（載玻片和蓋玻片），將單細胞培養(yǎng)在小室中的少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖成細胞團的方法。小室可通過毛細管與外界通氣，便于觀察。注意載玻片厚度1mm，微室厚度最好不超過20um，蓋玻片厚度在0.17-0.18mm左右，觀察效果才好。（三）平板培養(yǎng)法

平板培養(yǎng)法是把單個細胞與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混合，并平鋪一薄層在培養(yǎng)皿底上的培養(yǎng)方法。廣泛應用于細胞、原生質體及融合產(chǎn)物的培養(yǎng)。步驟：1、單細胞懸浮液的制備2、懸浮細胞密度的調制3、瓊脂培養(yǎng)基的配制4、平板制作5、培養(yǎng)（四）條件培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入高密度的細胞進行培養(yǎng)，一定時間后這些細胞就會向培養(yǎng)基中分泌一些物質，使培養(yǎng)基條件化。方法：把液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)了4-6周的高密度細胞過濾掉，將其培養(yǎng)基制成液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基來培養(yǎng)單細胞或低密度細胞群體，這樣可明顯提高單細胞培養(yǎng)物存活和分裂的能力。第二節(jié)細胞懸浮培養(yǎng)細胞懸浮培養(yǎng)是使離體的植物細胞懸浮在液體培養(yǎng)基中進行的無菌培養(yǎng)。建立在愈傷組織的液體培養(yǎng)技術基礎上。目前已發(fā)展到全自動控制的大容積發(fā)酵罐的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的連續(xù)培養(yǎng)。為研究細胞的生長和分化提供了一個獨特的實驗系統(tǒng)。1、愈傷組織誘導材料自來水沖洗——75%的乙醇擦洗——將材料切成小塊（帶形成層）——接種到MS+2,4-D2mg/L+CH500mg/L+瓊脂0.8%,pH5.8的培養(yǎng)基上——得愈傷組織——擴大繁殖。2、單細胞懸浮液的制備愈傷組織轉移到液體培養(yǎng)基中——4r/min轉床培養(yǎng)10d——140m×140m的細胞篩過篩——使細胞密度達到10個/ml左右——得單細胞懸浮液。

一、前期準備

在細胞懸浮培養(yǎng)中，采用生長快、有效成分高、適合懸浮培養(yǎng)的細胞株。篩選細胞株的方法是：

（1）從培養(yǎng)的愈傷組織中挑選出外觀疏松、生長快的淺色愈傷組織。

（2）用振蕩或酶法，游離出單個細胞或小細胞團。

（3）接種在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周。

（4）挑選生長快的細胞株并繼代培養(yǎng)。

（5）取各細胞系的培養(yǎng)物，進行有效成分的測定，篩選出有效成分高而生長較快的細胞株。二、培養(yǎng)類型和方法（一）成批培養(yǎng)

指把細胞分裝在一定容積的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，當培養(yǎng)物增殖到一定量時，轉接繼代，建立起單細胞培養(yǎng)物。它是進行細胞生長和細胞分裂的生理生化研究常用的培養(yǎng)方法。

（1）細胞生長在固定體積的培養(yǎng)基上，直至培養(yǎng)基中的養(yǎng)分為細胞耗盡為止。

（2）用適當攪拌的方法增加和維持游離細胞和細胞團在培養(yǎng)基中的均勻分布。

（3）在整個培養(yǎng)過程中，細胞數(shù)目會不斷發(fā)生變化，呈現(xiàn)出明顯的慢-快-慢，最后增長停止的細胞生長周期。

（4）成批培養(yǎng)結束后，若要進行下一批培養(yǎng)，必須另外進行繼代培養(yǎng)，其方法是用注射器吸取一定量的含單細胞和小細胞團的懸浮培養(yǎng)物，并移到含有新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶里，繼續(xù)進行培養(yǎng)。1、成批培養(yǎng)法細胞生長周期延滯期對數(shù)增長期直線生長期緩慢期靜止期時間

細胞數(shù)目（二）半連續(xù)培養(yǎng)指每隔一定時間后倒出一半的懸浮液，并同時補充加入等量新鮮培養(yǎng)液。能重復地取得大量、均一的培養(yǎng)細胞，供生物研究之用。

是利用特制的培養(yǎng)容器進行大規(guī)模細胞培養(yǎng)的一種方式。

在培養(yǎng)過程中，以不斷抽取懸浮培養(yǎng)物并注入等量新鮮培養(yǎng)基，使培養(yǎng)物不斷得到養(yǎng)分補充，保持其恒定體積的培養(yǎng)。

（三）連續(xù)培養(yǎng)1、連續(xù)培養(yǎng)的特點

（1）由于不斷加入新鮮培養(yǎng)基，保證了養(yǎng)分的充分供應，不會出現(xiàn)懸浮培養(yǎng)物發(fā)生營養(yǎng)不足的現(xiàn)象。

（2）可在培養(yǎng)期間使細胞保持在對數(shù)生長期中。細胞增殖速度快。

（3）適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。2、連續(xù)培養(yǎng)的種類

封閉式連續(xù)培養(yǎng)：系統(tǒng)中的細胞數(shù)目不斷增加。

開放式連續(xù)培養(yǎng)：系統(tǒng)中的細胞密度保持恒定。

封閉型連續(xù)培養(yǎng)：在培養(yǎng)過程中，排除的舊培養(yǎng)基由加入的新鮮培養(yǎng)基進行補充，進出數(shù)量保持平衡，從而使培養(yǎng)系統(tǒng)中營養(yǎng)物質的含量總是超過細胞生長的需要。懸浮在排除液中的細胞經(jīng)機械方法收集后再放回培養(yǎng)系統(tǒng)中，因此在這樣培養(yǎng)方式中，隨著培養(yǎng)時間延長，細胞密度不斷增加。開放型連續(xù)培養(yǎng)：為了不使限制細胞生長的因子出現(xiàn)，創(chuàng)造一個穩(wěn)定的細胞生長的環(huán)境，必須建立一套自動控制系統(tǒng)來調節(jié)培養(yǎng)基注入的數(shù)量和培養(yǎng)液的總體積。在開放連續(xù)培養(yǎng)中，注入的新鮮培養(yǎng)液的容積與流出的培養(yǎng)液容積相等，其中細胞的密度也保持恒定，并通過調節(jié)流入和流出的速度，使細胞的生長速度一直保持在一個穩(wěn)定狀態(tài)，流出的細胞相當于培養(yǎng)系統(tǒng)中新細胞的增加數(shù)。3、為了保持在開放連續(xù)培養(yǎng)中細胞增殖的穩(wěn)定性，采取的控制方法：

（1）濁度恒定法

（2）化學恒定法

三、懸浮細胞的繼代在懸浮培養(yǎng)中，為了保持一定的懸浮細胞增殖速度和增殖量，應定期做繼代培養(yǎng)，最適的周期一般為1-2周。但實際所需的時間和接種量應視不同細胞系而定。繼代時間為1周的細胞系可用1：4的接種量，繼代時間為2周的可用1：10的接種量。在懸浮培養(yǎng)中，細胞剛進入靜止期之初，細胞懸浮液達到最大量，就必須進行繼代培養(yǎng)。因為處在靜止期的細胞懸浮液保存時間太長會引起細胞的大量死亡和解體。為了加速細胞增殖，有的甚至在對數(shù)生長期末就進行繼代。四、培養(yǎng)細胞的同步化同步培養(yǎng)：在培養(yǎng)基中大多數(shù)細胞都能同時通過細胞周期的各個階段，同步性的程度以百分百分數(shù)表示。實現(xiàn)懸浮培養(yǎng)細胞同步化的方法：1、饑餓法：先對細胞斷絕供應一種進行細胞分裂所必需的營養(yǎng)成分或激素，使細胞停滯在G1期或G2期，經(jīng)過一段時間的饑餓后