毒理學(xué)基礎(chǔ)第6章(2)蓄積毒作用

第三節(jié)短期、亞慢性和慢性毒性作用急性毒性試驗的局限性：

1.外源性化學(xué)物在長期重復(fù)染毒時可產(chǎn)生與急性毒性試驗完全不同的毒作用。如：苯2.動物的衰老可影響毒作用的性質(zhì)和程度3.許多重要疾病均與年齡增長有關(guān)一、概述分類

1.重復(fù)劑量毒性作用（短期）2.亞慢性毒性作用3.慢性毒性作用（一）蓄積作用1、蓄積作用(accumulation)：當(dāng)化學(xué)物與機體發(fā)生亞慢性接觸,將反復(fù)進入機體,而且當(dāng)進入的速度或總量超過代謝轉(zhuǎn)化排出的速度或總量時,化學(xué)物質(zhì)就有可能在體內(nèi)逐漸增加并貯留,這種現(xiàn)象稱為化學(xué)物質(zhì)的蓄積作用。

2.儲存庫（depot）：

化學(xué)毒物容易蓄積的組織和器官稱為儲存庫。機體常見的儲存庫有血漿蛋白、脂肪組織、肝臟、腎臟、骨骼等。如骨骼為鉛的儲存庫。

蓄積形式:原形代謝產(chǎn)物與機體某些物質(zhì)結(jié)合的形式3.蓄積的分類：物質(zhì)蓄積功能蓄積(損傷蓄積）3.1物質(zhì)蓄積（materialaccumulation）：

化學(xué)毒物反復(fù)多次染毒實驗動物后，用化學(xué)分析方法能測得機體內(nèi)或某些器官組織內(nèi)存在該化合物的原型或其代謝產(chǎn)物。3.2功能蓄積（functionalaccumulation）：

化學(xué)毒物反復(fù)多次染毒實驗動物后，機體內(nèi)雖不能檢出化學(xué)毒物，然而機體可以出現(xiàn)慢性中毒現(xiàn)象。注：功能蓄積是損害效應(yīng)累計的結(jié)果。也可能是由于存留的化學(xué)毒物或代謝物數(shù)量極微，目前技術(shù)方法尚不能檢出的一種物質(zhì)蓄積，或者物質(zhì)蓄積與功能蓄積兼而有之（二）蓄積作用的毒理學(xué)意義1.蓄積作用是發(fā)生慢性中毒的物質(zhì)基礎(chǔ)2.一種外源化學(xué)物有無蓄積作用是評定該化學(xué)物是否可能引起潛在慢性中毒的論據(jù)之一3.是制定衛(wèi)生限量標(biāo)準(zhǔn)時安全系數(shù)的一種依據(jù)。蓄積毒性試驗?zāi)康?、求出外源化學(xué)物的蓄積系數(shù)，了解蓄積毒性大?。?、為慢性毒性試驗及其他有關(guān)毒性試驗的劑量選擇提供參考。(三)、蓄積作用的研究方法蓄積作用的檢測有兩類方法理化方法：應(yīng)用化學(xué)分析或其他技術(shù)測定化學(xué)物進入機體以后，在體內(nèi)含量變化的過程。該方法可確定化學(xué)物的半減期，故可作為檢測物質(zhì)蓄積的方法。生物學(xué)方法：即將多次染毒與一次染毒所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)進行比較，故所測出的蓄積性不能區(qū)分功能蓄積和物質(zhì)蓄積。1、蓄積系數(shù)法原理：在一定期限內(nèi)以低于致死劑量（小于LD50劑量），每日給予實驗動物，直至出現(xiàn)預(yù)計的毒性效應(yīng)（或死亡）為止，計算達到預(yù)計效應(yīng)的總累積劑量，求出此累積劑量與一次接觸該化學(xué)物產(chǎn)生相同效應(yīng)的劑量的比值，此比值即為蓄積系數(shù)（K值）：在衛(wèi)生毒理學(xué)實際工作中，蓄積作用試驗多用小鼠或大鼠為實驗動物，一般以死亡為指標(biāo)，其K值計算公式如下：LD50（n）表示引起一半動物死亡的累積總劑量LD50（1）表示引起一半動物死亡的一次劑量意義：K值越小，表示化學(xué)物的蓄積毒性越大。K>1;K=1;K<1;K≥5——？雖然蓄積系數(shù)法具有一定使用價值，但是某些外源化學(xué)物的慢性中毒效應(yīng)，無法用K值表示。例如多數(shù)有機磷化合物是屬于輕度蓄積（K>5），但當(dāng)小劑量反復(fù)與機體接觸后，紅細(xì)胞與腦組織的乙酰膽堿酯酶可以持續(xù)降低，而且伴有一定程度的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥候。蓄積系數(shù)法由于分次染毒的設(shè)計不同，分為：（1）固定劑量法：先測出1次染毒的LD50(1)，然后每天給予1/10（1/20）LD50直到半數(shù)動物死亡為止，此時總劑量即為LD50（n）（2）劑量遞增法：實驗開始時，按0.1LD50×4天，0.15LD50×4天，0.22LD50×4天，0.34LD50×4天,依次類推，最長28天，試驗期間，當(dāng)化學(xué)物引起動物累計死亡一半時間即可終止，計算K值。（3）劑量固定的20天蓄積法：實驗分為5組，包括陰性對照組和1/20LD50，1/10LD50，1/5LD50，1/2LD50，每組動物數(shù)10只，雌雄各半，每日染毒1次，連續(xù)20天，觀察每組動物死亡數(shù)。劑量固定20天蓄積試驗評價標(biāo)準(zhǔn)?各劑量組均無死亡，蓄積性不明顯?1/2LD50劑量組死亡，其他組無死亡，則弱蓄積性?1/20LD50劑量組無死亡，其他各組間死亡數(shù)有劑量反應(yīng)關(guān)系，則為中等蓄積性?1/20LD50劑量組有死亡，各組間死亡數(shù)有劑量反應(yīng)關(guān)系，則為強蓄積性2、生物半減期法

?生物半減期法是用毒物動力學(xué)原理,闡明外源化學(xué)物在機體內(nèi)的蓄積作用特征

(二)短期重復(fù)劑量毒性、亞慢性和慢性毒性作用基本概念

1.短期重復(fù)劑量毒性

指實驗動物或人連續(xù)接觸外源化學(xué)物14-30天所產(chǎn)生的中毒效應(yīng)。

2.亞慢性毒性（subchronictoxicity）：

是指人或?qū)嶒瀯游镞B續(xù)較長期接觸某一外源化學(xué)毒物所出現(xiàn)的中毒效應(yīng)。一般在相當(dāng)于1/10左右生命時間（壽命）內(nèi)

亞慢性毒性試驗：指在實驗動物的1/10左右（如大鼠3個月）的生命時間內(nèi)，反復(fù)多次給予低劑量化學(xué)毒物，觀察試驗動物有無引起有害作用的試驗過程。

3.慢性毒性（chronictoxicity）：

是指人或?qū)嶒瀯游镩L期（甚至終生）反復(fù)接觸低劑量的化學(xué)毒物所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。一般2年

慢性毒性試驗：在受試動物生命的大部分或終生，連續(xù)長期給予低劑量的受試物，觀察有無引起有害作用的試驗過程。試驗?zāi)康?/p>

1.觀察長期接觸受試物的毒性效應(yīng)譜、毒作用特點和靶器官；了解其毒性機制。

2.觀察受試物亞慢性毒性作用的可逆性

3.研究重復(fù)接觸受試物毒性作用的劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系，從初步了解到確定未觀察到有害作用的劑量（NOAEL）和觀察到有害作用的最小劑量（LOAEL），為制定人類接觸的安全限量提供參考值4.確定不同動物對受試物的毒效應(yīng)的差異，將研究結(jié)果外推到人提供依據(jù)。二、研究方法（一）實驗設(shè)計

（亞慢性毒性試驗）

1.實驗動物選擇

（1）物種和品系

急性原則：

*盡量選擇急性毒性反應(yīng)與人近似的動物；*易于飼養(yǎng)管理、試驗操作方便的動物；*繁殖生育能力較強，數(shù)量較大能夠保障供應(yīng)；*價格較低，易與獲得的動物。亞慢性原則：*理論上，選取對化學(xué)毒物代謝過程、生理反應(yīng)和生化特性基本上與人接近，且在急性試驗中證明是對化學(xué)毒物敏感的物種和品系常用大鼠犬豚鼠

（2）性別、年齡和數(shù)量

雌雄各半；剛斷乳的動物：大鼠6－8周齡（80-100g），同組動物體重不超過10%、組間平均體重不超過5%大鼠、小鼠每組不少于20只，犬、猴不少于6只，要求試驗結(jié)束時，活的動物數(shù)能保證統(tǒng)計學(xué)處理。

亞慢性毒性試驗

年齡：大鼠80~100g狗8~12月小鼠10~15g數(shù)量：小動物≥20大動物≥6性別：雌雄各半

慢性毒性試驗?zāi)挲g：大鼠50~70g狗<8月小鼠初斷乳數(shù)量：小動物≥40大動物≥8性別：雌雄各半（3）微生物學(xué)寄生蟲學(xué)等級和飼養(yǎng)環(huán)境應(yīng)選擇清潔級及以上等級動物動物室：清潔、溫度22oC±3，濕度30-70%，人工控制晝夜交替籠具：大小適中、動物能自由活動飼料：營養(yǎng)合理飲用水：清潔、充足2染毒方式與期限

亞慢性染毒方式原則：1）盡量選用與人群實際接觸相同的途徑和方式食品、藥品、環(huán)境污染物2）并與預(yù)期進行慢性毒性試驗的接觸途徑一致。一般以經(jīng)口、經(jīng)呼吸道和經(jīng)皮膚三種途徑染毒，每日一次，連續(xù)給予染毒期限

取決于實驗具體要求和所選擇的實驗動物

工業(yè)毒理學(xué)——3－6個月食品毒理學(xué)——6個月－1年環(huán)境毒理學(xué)——6個月－1年致癌試驗——接近或等于動物的預(yù)期壽命染毒注意的問題：（1）小動物：灌胃或喂飼法大動物：膠囊法或灌胃法喂飼法注意：混合均勻受試物穩(wěn)定保證營養(yǎng)受試物摻入量嚴(yán)格規(guī)定（2）呼吸道染毒

染毒時間：2-6h/d亞慢性：4小時慢性試驗：間歇性：工業(yè)毒物6-8小時連續(xù)性：環(huán)境接觸22-24小時

（3）注射（4）最好結(jié)合毒物動力學(xué)血藥濃度的監(jiān)測，以保持生物學(xué)效應(yīng)的每日相似性3劑量選擇和分組

（1）分組：

原則：一般設(shè)3個試驗組和1個陰性（溶劑）對照組。

最高劑量組：要求出現(xiàn)明顯的中毒癥狀或某些觀察指標(biāo)發(fā)生明顯變化，但動物不死亡，即使有死亡，不超過10%

最低劑量組：應(yīng)無中毒反應(yīng)或極輕微反應(yīng)（NOAEL)。

中劑量組相：相當(dāng)于觀察到有害作用的最低劑量(LOAEL)高、中、低劑量組距以3－10倍為宜，不少于2倍3劑量選擇和分組

（1）分組：

原則：一般設(shè)3個試驗組和1個陰性（溶劑）對照組。

最高劑量組：要求出現(xiàn)明顯的中毒癥狀或某些觀察指標(biāo)發(fā)生明顯變化，但動物不死亡，即使有死亡，不超過10%

最低劑量組：應(yīng)無中毒反應(yīng)或極輕微反應(yīng)（NOAEL)。

中劑量組相：相當(dāng)于觀察到有害作用的最低劑量(LOAEL)高、中、低劑量組距以3－10倍為宜，不少于2倍（2）劑量設(shè)計：

①以相同物種的短期毒性資料為依據(jù)。

亞慢性毒性試驗可依據(jù)急性毒性的閾劑量或以1/20～1/5LD50確定；慢性毒性試驗以亞慢性毒性試驗效應(yīng)的最大耐受量（MTD）為最高劑量。

劑量選擇步驟：急性亞急性亞慢性慢性

②對于人群主動攝入的食品和藥品，可采用人體可能接觸的最高劑量為劑量設(shè)計依據(jù)人臨床劑量的倍數(shù)大鼠：3個劑量組：1030100倍非嚙齒類：3個劑量組：51550倍根據(jù)專業(yè)特殊性和管理部門有所區(qū)別亞慢性毒性的劑量選擇陰性對照組低劑量組中劑量組高劑量組（急性毒性的閾劑量1/20~1/5LD50）組距：3~10倍，最低不小于2倍慢性毒性的劑量選擇陰性對照組低劑量組中劑量組高劑量組亞慢性閾劑量或其1/5~1/2

1/10

LD50組距：2~5倍，最低不小于2倍（1）一般觀察1）進食量、外觀體征、行為活動綜合性指標(biāo)初步判斷作用部位、損害程度（1）一般觀察1）進食量、外觀體征、行為活動綜合性指標(biāo)初步判斷作用部位、損害程度2）動物體重：

體重的增長情況是綜合反映動物健康狀況最基本的靈敏指標(biāo)之一，受食欲、消化功能、代謝和能量消化變化的影響。如發(fā)現(xiàn)實驗組動物體重增長減慢，停止或減輕，在排除由于異味引起食欲不佳的前提下，可說明化學(xué)毒物的毒性效應(yīng)。表示方法：（1）體重絕對增長量