第三章 基因克隆載體復(fù)習(xí)

主講教師:任國領(lǐng)生命科學(xué)學(xué)院第三章

基因克隆載體基因克隆載體概述DNA克隆載體通過不同途徑將承載的外源DNA片段（基因）帶入受體細(xì)胞且能在其中維持的DNA分子。也稱DNA克隆載體。必備條件基因克隆載體概述3.1質(zhì)粒克隆載體一、質(zhì)粒（Plasmid）獨(dú)立于染色體外能夠自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子（少數(shù)為線狀）。構(gòu)型：l-DNAoc-DNAccc-DNA3、復(fù)制特點(diǎn)3.1質(zhì)?？寺≥d體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點(diǎn)特點(diǎn)：在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行單向復(fù)制?？截悢?shù)（細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒與染色體數(shù)量之比值）（１）每種質(zhì)粒在其宿主細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)相對穩(wěn)定。 嚴(yán)緊控制型：1～數(shù)個(gè)拷貝；大質(zhì)粒 松馳控制型：10個(gè)以上拷貝；小質(zhì)粒。經(jīng)氯霉素處理，宿主中質(zhì)粒大量擴(kuò)增（如ColE1拷貝數(shù)達(dá)3000個(gè)）。４、質(zhì)粒的不親合性3.1質(zhì)?？寺≥d體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點(diǎn)親和性質(zhì)粒：能在同一細(xì)胞中復(fù)制的幾種質(zhì)粒不親和性（不相容性）質(zhì)粒：不能在同一細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒。意義：宿主細(xì)胞內(nèi)的原有質(zhì)粒與克隆載體的質(zhì)粒必須是親和性質(zhì)粒，最好不含內(nèi)源性質(zhì)粒。５、質(zhì)粒遷移3.1質(zhì)?？寺≥d體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點(diǎn)（１）接合質(zhì)粒：含tra基因→合成細(xì)胞表面物質(zhì)（鞭毛）→質(zhì)粒DNA入受體細(xì)胞

含tra基因的質(zhì)粒稱為接合質(zhì)粒。如F、Ti等

不含tra基因的質(zhì)粒稱為非接合質(zhì)粒。如ColE1、pPbS等（２）遷移作用：不含tra基因而含bom（oriＴ）位點(diǎn)的質(zhì)粒，當(dāng)宿主細(xì)胞存在輔助質(zhì)粒mob基因產(chǎn)物時(shí)，即可打開oriＴ位點(diǎn)，非結(jié)合質(zhì)粒借助接合質(zhì)粒tra基因的產(chǎn)物而遷移入受體細(xì)胞。這種現(xiàn)象稱～質(zhì)粒的遷移作用５、質(zhì)粒遷移3.1質(zhì)?？寺≥d體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點(diǎn)６、顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)粒3.1質(zhì)?？寺≥d體二、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的一般特點(diǎn)宿主因含某種質(zhì)粒而呈現(xiàn)出新的性狀，稱為顯性質(zhì)粒。顯性質(zhì)粒 Ｒ質(zhì)粒：含有氨芐青霉素Ap/Amp（抗性質(zhì)粒）

氯霉素Cm/Cap

卡那霉素Km/Kan

四環(huán)素Tc/Tet

Col質(zhì)粒（產(chǎn)大腸桿菌素）Ｆ質(zhì)粒（引起細(xì)胞結(jié)合的育性質(zhì)粒） 降解毒物的降解質(zhì)粒Ｔi質(zhì)粒隱蔽質(zhì)粒

藍(lán)藻內(nèi)源質(zhì)粒１、能進(jìn)行有效復(fù)制——復(fù)制起始位點(diǎn)（最好是多拷貝）復(fù)制子由復(fù)制起點(diǎn)、復(fù)制區(qū)、復(fù)制終點(diǎn)組成。是能夠進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制的一種遺傳因子。每一個(gè)復(fù)制子都含有一個(gè)特定的RNA聚合酶結(jié)合的序列和DNA復(fù)制起始部位，即開始復(fù)制的復(fù)制區(qū)。3.1質(zhì)?？寺≥d體三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建用來插入外源DNA片段，且不影響復(fù)制。2、標(biāo)記基因——抗性基因，LacZ’基因篩選的標(biāo)志，理想的載體應(yīng)該有兩種抗菌素抗性的基因。3、克隆位點(diǎn)——組裝MCS連桿3.1質(zhì)?？寺≥d體三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建3.1質(zhì)?？寺≥d體三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建４、分子盡可能小（轉(zhuǎn)化率高），

＞15kb轉(zhuǎn)化率↓↓５、組裝各種“元件”，如啟動(dòng)子、終止子等3.1質(zhì)粒克隆載體三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建1、pBR322構(gòu)建

目標(biāo)是縮小基因組的體積，移去一些對基因克隆載體無關(guān)緊要的DNA片段，限制酶識別位點(diǎn)。質(zhì)粒載體命名法則 “pBR322”

p：質(zhì)粒（plasmid) BR：兩位主要構(gòu)建者 322：實(shí)驗(yàn)編號3.1質(zhì)?？寺≥d體四、代表性實(shí)例（一）pBR322及其衍生載體ColE1

松馳型，篩選系統(tǒng)復(fù)雜。

衍生的pMB1為出發(fā)質(zhì)粒（松弛型復(fù)制起始位點(diǎn)，但缺較好的選擇標(biāo)記基因和克隆位點(diǎn)）。

pSC101（最早用于DNA克隆的載體），嚴(yán)緊型，含有Tcr基因。

2、pBR322優(yōu)點(diǎn)（1）較小的分子量10kb以內(nèi)DNA分子純化過程中可避免斷裂，pBR322易于自身純化，且可克隆6kb左右的外源DNA。（2）較高的拷貝數(shù)經(jīng)氯霉素?cái)U(kuò)培后達(dá)1000～3000copys/cell（3）兩種抗菌素抗性基因插入失活，分兩次先后選擇。3.1質(zhì)?？寺≥d體四、代表性實(shí)例（二）、pUC18/19質(zhì)粒載體與pBR322區(qū)別：乳糖操縱子的一個(gè)DNA片段（lacZ`基因）替換Tcr基因；組裝了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS）連桿。命名pUC——UniversityofCalifornia的科學(xué)家首先構(gòu)建。

圖3-3pUC包括四個(gè)組成部分：（1）復(fù)制起點(diǎn)pBR322的ori。（2）Apmr基因pBR322的Ampr。（3）lacZ的啟動(dòng)子大腸桿菌（4）在lacZ`基因大腸桿菌lacZ的a-肽鏈序列，是LacZ的氨基酸片段。

含乳糖操縱子的啟動(dòng)子、調(diào)節(jié)因子和 β-半乳糖苷酶的N端146殘基(α-肽)合成有活性的基因（lacZ`）的質(zhì)粒載體引入可編β-半乳糖苷酶碼C端部分殘基的宿主(與LacZ`互補(bǔ)的大腸桿菌) 在含IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）和 X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖）藍(lán)色菌落 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)在N端α-肽的編碼區(qū)插入MCS不影響lacZ`基因功能插入外源DNA滅活lacZ`基因白色菌落LacZ`篩選機(jī)制：pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)分子量更小、拷貝數(shù)更高篩選方便X-gal顯色、抗菌素雙重直接選擇?？寺”憷哂卸嗫寺∥稽c(diǎn)（MCS），使兩個(gè)不同粘性末端的外源DNA方面的插入。測序方便TA克隆載體——針對PCR產(chǎn)物的克隆原理PCR產(chǎn)物在Taq酶的非模板依賴活性作用下，于3`端加一非配對的A。故可研制一種線性載體，其5`端各帶一不配對T，可直接與PCR產(chǎn)物以TA連接進(jìn)行克隆，即TA克隆。TA載體的再生方法（1）克隆載體線性化（2）克隆載體末端補(bǔ)平反應(yīng)（3）克隆載體末端加T反應(yīng)注：再生后的TA載體，原線性化的酶切位點(diǎn)消失知識回顧PBR322各部分結(jié)構(gòu)來源：amp抗性來自

載體，Tet抗性來自

載體，Ori來自

載體。3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、病毒的一般特征病毒基本結(jié)構(gòu)DNA（或RNA）+外殼蛋白感染細(xì)菌的病毒，稱為噬菌體。分類溫和性病毒：溶原性增殖烈性病毒：溶菌性增殖生活周期

溶菌周期

感染細(xì)菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬菌體。3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、病毒的一般特征溶源周期

感染細(xì)菌后，將自己的DNA整合到細(xì)菌的染色體DNA中。形成這一過程稱為溶源化。生活周期

3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、病毒的一般特征一、λ噬菌體克隆載體λDNA+外殼蛋白1、λDNA(48.5kb)噬菌體中：線性宿主細(xì)胞：環(huán)狀(cos位點(diǎn))3.2病毒（噬菌體）克隆載體（一）性質(zhì)cos位點(diǎn)2、λ噬菌體基因組有基因61個(gè)以上 有一半是必須的，與自身的活動(dòng)有關(guān)，成簇排列；大約1/3為非必須的，J與N、P與Q之間為非必需序列3.2病毒（噬菌體）克隆載體（一）性質(zhì)3、限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn):56種

4、λ噬菌體的生長途徑

溶菌生長途徑

溶源生長途徑5、λDNA的復(fù)制模型

復(fù)制

滾環(huán)式復(fù)制

3.2病毒（噬菌體）克隆載體（一）性質(zhì)進(jìn)入溶原狀態(tài)時(shí)，只有少量基因表達(dá)，包括編碼阻遏物的cI基因（抑制裂解基因的表達(dá)），正向調(diào)控自身基因的表達(dá)；int基因的表達(dá)（整合到基因組）。

研究E.coliDNA復(fù)制時(shí)，采用3H標(biāo)記的T，經(jīng)放射自顯影和電子顯微鏡拍照，展示了“θ”形結(jié)構(gòu)而得名。3.2病毒（噬菌體）克隆載體滾環(huán)復(fù)制過程（1）雙鏈環(huán)狀DNA的（+）鏈從“ori”處切刻開。5’-端離開環(huán)。(-)5’ori（+）3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體

DNA聚合酶以（-）鏈環(huán)為模板，從（+）鏈的3’-OH端共價(jià)延伸，合成子代（+）鏈DNA。(-)5’3’(2)SSB覆蓋在（+）鏈的5’-端單鏈上，（+）3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體

(4)DNA聚合酶以延伸的單鏈DNA為模板，合成子代雙鏈DNA。(-)5’3’3’5’(3)象拉卷尺一樣，（+）鏈越拉越長。44（+）3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體

(5)連接各崗崎片段，子代DNA形成線狀或環(huán)狀。(-)5’3’3’5’45（+）3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體1、λ噬菌體是一種溫和噬菌體對大腸桿菌有很高的感染性，以原噬菌體的形式長期潛伏在溶原細(xì)胞里，容易保存。在一定條件下又可轉(zhuǎn)入溶菌生長途徑，進(jìn)行大量繁殖。2、能承載較大的外源DNA片段 λDNA頭部可包裝約36.4～51kb(自身的75%～105%)，且約有20kbλDNA可缺失（生長非必需）3、在λDNA上有多種限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（二）構(gòu)建依據(jù)3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體策略:切去部分非必需區(qū);刪掉多余的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn);插入選擇性標(biāo)記基因;建立體外包裝系統(tǒng)。3.2病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體（三）構(gòu)建的基本策略與技術(shù)路線 2、在λDNA的非必需區(qū)內(nèi)插入選擇標(biāo)記基因 （1）取代red和gam基因 外源DNA取代獲Spi-表型

在P2噬菌體溶原性細(xì)胞中能生長

野生型λ噬菌體(Spi+表型)

在P2噬菌體溶原性細(xì)胞中不能生長 局限性：只能以P2噬菌體溶原細(xì)胞作為受體（2）最常用的篩選標(biāo)記：LacZ基因3、建立重組λDNA分子體外包裝系統(tǒng)體外重組DNA分子必須經(jīng)體外包裝成噬菌體顆粒后，才能轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細(xì)胞。在試管中與λ噬菌體的頭部和尾部蛋白人工裝配成噬菌體顆粒，才能高效地感染大腸桿菌，把重組DNA注入受體菌。

由質(zhì)粒和含cos位點(diǎn)的λDNA片段組裝成的載體，即cosmid.3.2病毒（噬菌體）克隆載體二、cosmid克隆載體（柯斯質(zhì)粒載體）λDNA質(zhì)粒含cos位點(diǎn)和控制包裝的序列復(fù)制子抗藥性基因克隆位點(diǎn)（一）構(gòu)建策略?1、環(huán)形雙鏈DNA分子,

≤36.4kb,一般＜10kb2、具有質(zhì)粒的性質(zhì)，可轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并按質(zhì)粒方式復(fù)制（二）cosmid的特征3.2病毒（噬菌體）克隆載體3、含有一個(gè)cos位點(diǎn)A蛋白cos末端→體外包裝成為噬菌體，但不含λ噬菌體溶菌生長途徑、溶原生長途徑和DNA復(fù)制系統(tǒng)，不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌體.4、cosmid較小，可承載更大的外源DNA 若cosmid為6.5kb，則可承載44.5(51-6.5)kb外源DNA，且能被包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。

因此，cosmid克隆廣泛用于構(gòu)建基因組文庫。5、方便的選擇具有抗菌素抗性基因，以及插入失活的選擇標(biāo)記、克隆位點(diǎn)。3.2病毒（噬菌體）克隆載體（三）理論依據(jù)利用Cosmid載體在大腸桿菌中克隆大片段的真核基因組DNA技術(shù)，叫“柯斯克隆”。（CosmidClone）cos位點(diǎn)：包裝識別。3.2病毒（噬菌體）克隆載體（四）一般過程3.2病毒（噬菌體）克隆載體3.2病毒（噬菌體）克隆載體（五）cosmid載體克隆的缺點(diǎn)解決措施3.2病毒（噬菌體）克隆載體絲狀噬菌體，內(nèi)有一環(huán)狀單鏈DNA分子（“+”鏈DNA） 大?。?.4kb

結(jié)構(gòu)：10個(gè)區(qū)基因間隔區(qū)507bp（intergenicregion，IG區(qū)）含復(fù)制起始位點(diǎn)及可插入外源DNA的位點(diǎn)三、M13噬菌體克隆載體（一）M13DNA3.2病毒（噬菌體）克隆載體三、M13噬菌體克隆載體（一）單鏈DNA噬菌體的特征(1)+DNA（ssDNA）.(2)復(fù)制型是雙鏈DNA為中間媒介。M13噬菌體感染雄性大腸桿菌后，M13的“+”DNA進(jìn)入細(xì)胞，以此為模板復(fù)制“-”DNA,,由此產(chǎn)生的DNA為雙鏈DNA（RF-DNA）。RF-DNA一般按照環(huán)狀雙鏈DNA進(jìn)行復(fù)制，同時(shí)按照“+”DNA轉(zhuǎn)譯出一些包裝蛋白。當(dāng)RF-DNA達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，“+”DNA被阻遏蛋白結(jié)合，阻斷“-”DNA復(fù)制合成。結(jié)果細(xì)胞只能以“-”DNA為模板合成新鏈“+”DNA，而新鏈“+”DNA被積累在細(xì)胞內(nèi)的殼蛋白包裝成噬菌體，不斷被擠出宿主細(xì)胞。3.2病毒（噬菌體）克隆載體3.2病毒（噬菌體）克隆載體（一）單鏈DNA噬菌體的特征3.2病毒（噬菌體）克隆載體（一）單鏈DNA噬菌體的特征（二）M13的生活周期3.2病毒（噬菌體）克隆載體三、M13噬菌體克隆載體+DNA轉(zhuǎn)錄mRNA翻譯形成噬菌體蛋白，-DNA合成+DNA。3.2病毒（噬菌體）克隆載體策略：在RF-DNA的IG區(qū)插入選擇標(biāo)記基因，并組裝合適MCS。1.克隆區(qū)域的選定（2）酶切位點(diǎn)（1）基因間隔區(qū)（intergenicregion，IG區(qū)）該區(qū)域只有一個(gè)BsuI酶切位點(diǎn)，其余9個(gè)在其他部位。3.2病毒（噬菌體）克隆載體（三）M13噬菌體克隆載體的構(gòu)建策略和途徑三、M13噬菌體克隆載體含復(fù)制起始位點(diǎn)及可插入外源DNA的位點(diǎn)（不影響M13噬菌體活性）。3.2病毒（噬菌體）克隆載體（三）M13噬菌體克隆載體的構(gòu)建策略和途徑三、M13噬菌體克隆載體2.加入酶切位點(diǎn)（1）在IG區(qū)加入酶切位點(diǎn)在IG區(qū)內(nèi)插入大腸桿菌的LacZ序列（a-肽序列）。利用a-肽序列的三個(gè)單一酶切位點(diǎn)（BglII、AvaII和PvuI）3.2病毒（噬菌體）克隆載體（三）M13噬菌體克隆載體的構(gòu)建策略和途徑三、M13噬菌體克隆載體3.2病毒（噬菌體）克隆載體（三）M13噬菌體克隆載體的構(gòu)建策略和途徑花椰菜花葉病病毒（CaMV）

環(huán)狀雙鏈DNA分子（一）CaMV

DNA分子 大?。?kb

結(jié)構(gòu)：在病毒顆粒中呈開環(huán)形式，負(fù)鏈有一缺口，正鏈有兩缺口。進(jìn)入植物細(xì)胞后單鏈部分被酶解，缺口自行閉合，成為環(huán)狀DNA分子。3.2病毒（噬菌體）克隆載體四、CaMV克隆載體G1G2G3CaMVDNA分子上有八個(gè)開放閱讀框（ORF)和三個(gè)間隔區(qū)。

ORFI：編碼運(yùn)動(dòng)蛋白，負(fù)責(zé)CaMV在細(xì)胞間運(yùn)轉(zhuǎn)。

ORFII：表達(dá)產(chǎn)物與蚜蟲口針或前腸的特殊位點(diǎn)相結(jié)合，參與蚜蟲的感染。

ORFIV：編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白。

ORFV：編碼反轉(zhuǎn)錄酶。二)CaMV基因區(qū)病毒增殖缺口閉合侵染編碼病毒反轉(zhuǎn)錄酶，35S反轉(zhuǎn)錄表現(xiàn)癥狀和宿主范圍編碼外殼蛋白

花椰菜花斑病病毒基因組DNA的結(jié)構(gòu)3)CaMVDNA的間隔區(qū)

IR1：位于ORFVI和ORFVII之間，長度為700bp，含有啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄35SRNA的啟動(dòng)子。

IR2：位于ORFVII和ORFI之間，長度為60bp。

IR3：位于ORFV和ORFVI之間，長度為60bp，含有啟動(dòng)19SRNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。IR1和IR3區(qū)各有一個(gè)啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，分別啟動(dòng)同方向轉(zhuǎn)錄35SRNA和19SRNA，而兩者的終止子都在IR1區(qū)。35S啟動(dòng)子——組成型強(qiáng)啟動(dòng)子。組裝了35S啟動(dòng)子的外源基因可在植物細(xì)胞高效表達(dá)，在藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)也有效表達(dá)。CaMV35S啟動(dòng)子序列4）CaMV-DNA限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)在CaMV-DNA的非必需區(qū)（II區(qū)和VII區(qū)）含有限制酶識別位點(diǎn)（如BstEII和XhoI），這些單酶切位點(diǎn)可用于插入外源DNA片段．CaMV（CabbB-S）DNA的部分酶切位點(diǎn)（三）CaMV的增殖和感染

1、增殖途徑：

CaMV顆粒→蚜蟲→病毒DNA進(jìn)入植物細(xì)胞核→ 轉(zhuǎn)錄19SRNA→翻譯

35SRNA→翻譯反轉(zhuǎn)錄“-”鏈DNA→復(fù)制出“+”鏈2、CaMV-DNA可轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞 在ORFII和ORFVII區(qū)插入外源DNA后仍能轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞包裝成新的CaMV顆粒（四）構(gòu)建CaMV克隆載體的基本策略和途徑策略：

CaMV-DNA能侵入植物細(xì)胞而將目的基因?qū)耄⑶仪宄鼵aMV對植物的致病性基因.六、農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建

Ti質(zhì)粒：根癌農(nóng)桿菌中引發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤（冠癭瘤）的質(zhì)粒，故稱Tumorinducingplasmid（Ti質(zhì)粒）。雙鏈環(huán)狀DNA分子，200～250kb。

1、4個(gè)功能區(qū)：T-DNA區(qū)、Vir區(qū)、Con區(qū)、Ori區(qū)

（1）T-DNA區(qū)

Ti質(zhì)粒進(jìn)入植物細(xì)胞的約25kb部分，即T-DNA（transferDNA)。左右邊界各有一個(gè)25bp正向重復(fù)序列（LTS和RTS）稱為邊界序列，為T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合所必需。只要保留T-DNA的邊界序列，中間序列被外源DNA片段替換，仍可轉(zhuǎn)移整合到植物基因組中。這是Ti質(zhì)粒用于遺傳轉(zhuǎn)化的理論依據(jù)。用野生型Ti質(zhì)粒獲得的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞只能分裂，不能分化為植株，故不能直接選育轉(zhuǎn)基因植物。（2）Vir區(qū) 位于T-DNA區(qū)上游，其表達(dá)產(chǎn)物可激活T-DNA的轉(zhuǎn)移，顯示致瘤性。（3）Con區(qū) 含有農(nóng)桿菌之間接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因（tra)，可受宿主產(chǎn)生的冠癭堿活化，使Ti質(zhì)粒在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移，也即接合轉(zhuǎn)移基因編碼區(qū)。（4）Ori區(qū) 復(fù)制起始區(qū)，調(diào)控Ti質(zhì)粒自我復(fù)制。

Ti質(zhì)?？寺≥d體真正用于植物而非農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌只起中介作用。

３.3人工染色體克隆載體人工染色體克隆載體含義和特點(diǎn) 實(shí)際上是一種“穿梭”克隆載體：含有質(zhì)粒克隆載體所必備的第一受體（大腸桿菌）源質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)（ori），還含有第二受體（如酵母菌）染色體DNA著絲點(diǎn)、端粒和復(fù)制起始位點(diǎn)的序列，以及合適的選擇標(biāo)記基因。特點(diǎn)：能容納長達(dá)1000至3000kb的外源DNA片段。YAC人工染色體載體是利用釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）的染色體的復(fù)制元件構(gòu)建的載體，其工作環(huán)境也是在釀酒酵母中。

YAC載體為能夠滿足自主復(fù)制、染色體在子代細(xì)胞間的分離及保持染色體穩(wěn)定的需要，必須含有以下元件：

·端粒重復(fù)序列（telomericrepeat，TEL）：定位于染色體末端一段序列，用于保護(hù)線狀的DNA不被胞內(nèi)的核酸酶降解，以形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

2、染色體復(fù)制和遺傳的三個(gè)基本組件·著絲粒（centromere，CEN）：有絲分裂過程中紡錘絲的結(jié)合位點(diǎn)，使染色體在分裂過程中能正確分配到子細(xì)胞中。在YAC中起到保證一個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有一個(gè)人工染色體的作用。如pYAC4使用的是酵母第四條染色體的著絲粒。

·自主復(fù)制序列（autonomouslyreplicationsequences，ARS）一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA進(jìn)行雙向復(fù)制所必須的信號。3、克隆位點(diǎn)與YAC載體配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因帶有一個(gè)赭石突變ade2-1。帶有這個(gè)突變的酵母菌在基本培養(yǎng)基上形成紅色菌落，當(dāng)帶有赭石突變抑制基因sup4的載體存在于細(xì)胞中時(shí)，可抑制ade2-1基因的突變效應(yīng)，形成正常的白色菌落。

4、篩選標(biāo)記YAC載體的選擇標(biāo)記主要采用營養(yǎng)缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和組氨酸合成缺陷型基因trp1、leu2和his3、尿嘧啶合成缺陷型基因ura3等，以及赭石突變抑制基因sup4。

5、克隆原理對于BamHⅠ切割后形成的微型酵母染色體，當(dāng)用EcoRⅠ或SnaBⅠ切割抑制基因sup4內(nèi)部的位點(diǎn)后形成染色體的兩條臂，與外源大片段DNA在該切點(diǎn)相連就形成一個(gè)大型人工酵母染色體。通過轉(zhuǎn)化進(jìn)入到酵母菌后可象染色體一樣復(fù)制，并隨細(xì)胞分裂分配到子細(xì)胞中去，達(dá)到克隆大片段DNA的目的。裝載了外源DNA片段的重組子導(dǎo)致抑制基因sup4插入失活，從而形成紅色菌落；而載體自身連接后轉(zhuǎn)入到酵母細(xì)胞后形成白色菌落。這些紅色的裝載了不同外源DNA片段的重組酵母菌菌落的群體就構(gòu)成了YAC文庫。二、細(xì)菌人工染色體載體

（Bacterialartificialchromosomes，BACs）是基于大腸桿菌的F

質(zhì)粒構(gòu)建的，高通量低拷貝的質(zhì)粒載體。基本元件每個(gè)環(huán)狀DNA分子中攜帶：一個(gè)抗生素抗性標(biāo)記；一個(gè)來源于大腸桿菌F因子（致育因子）的嚴(yán)謹(jǐn)型控制的復(fù)制子oriS（Shizuyaetal.1992）；一個(gè)易于DNA復(fù)制的由ATP驅(qū)動(dòng)的解旋酶（RepE）；三個(gè)確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細(xì)胞的基因座（parA,parB,和parC）。新型的BAC載體可以通過α互補(bǔ)的原理篩選含有插入片段的重組子，并設(shè)計(jì)了用于回收克隆DNA的NotⅠ酶切位點(diǎn)和用于克隆DNA測序的Sp6啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子（Kimetal.1996;Asakawaetal.1997）。

構(gòu)建優(yōu)勢和應(yīng)用①BAC復(fù)制子來源于F因子，可穩(wěn)定遺傳，缺失、嵌合及重組現(xiàn)象極少；②以大腸桿菌為宿主，轉(zhuǎn)化效率高，提取制備及操作方便；③可通過菌落原位雜交篩選目的基因，方便選擇；④兩側(cè)具有Sp6啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子，用于轉(zhuǎn)錄RNA探針或者測序。基因組文庫構(gòu)建，基因組測序和圖譜構(gòu)建的主要工具。

3.4

染色體定位整合克隆載體質(zhì)粒與病毒克隆載體的不足：1、轉(zhuǎn)基因生物中游離的外源DNA分子能多拷貝復(fù)制，但易丟失，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因生物的不穩(wěn)定性。2、隨機(jī)插入染色體的外源DNA片段能穩(wěn)定維持，但因插入的位點(diǎn)不確定，可能干擾受體細(xì)胞基因組的自穩(wěn)系統(tǒng)，進(jìn)而導(dǎo)致有害突變，造成選育轉(zhuǎn)基因生物不可知性，增加難度?；蛘掀脚_系統(tǒng)——基因定位同源重組(基因打靶)

整合平臺：即受體細(xì)胞基因組上給定的DNA區(qū)域，是外源DNA定位整