生物技術(shù)畢業(yè)論文

高等教育自學(xué)考試畢業(yè)設(shè)計（論文）闡明書農(nóng)學(xué)（本科）市地洛陽準考證號姓名趙源濤 河南科技大學(xué)高等教育自學(xué)考試辦公室高等教育自學(xué)考試畢業(yè)設(shè)計（論文）任務(wù)書一、題目：紅掌組培快繁過程中污染因素的分析及對策探討二、本環(huán)節(jié)自6月30日起至三、進行地點：河南科技大學(xué)四、內(nèi)容規(guī)定：綜述簡潔完整，有見解；立論對的，敘述充足，結(jié)論嚴謹合理，實驗對的，分析解決科學(xué)；文字通順，技術(shù)用語精確，符號統(tǒng)一，編號齊全，書寫工整規(guī)范，圖表完備、整潔、對的；論文成果有應(yīng)用價值。指導(dǎo)教師：職稱同意日期：年月日紅掌組培快繁過程中污染因素的分析及對策探討摘要紅掌（拉丁名：Spathiphyllumfloribundum），亦叫安祖花，紅鶴芋等，天南星科火燭屬。其花色艷麗，花莖挺拔，葉型翠綠美觀，是當今世界出名的切花和盆栽花卉之一，市場潛力大，含有極高的觀賞價值和經(jīng)濟價值。紅掌的繁殖辦法普通采用分株繁殖、扦插繁殖和組織培養(yǎng)繁殖。但分株繁殖、扦插繁殖很難滿足現(xiàn)在市場的需求，組織培養(yǎng)是紅掌快速繁殖的有效途徑。由于組織培養(yǎng)中經(jīng)常出現(xiàn)不同程度的污染問題，造成很大的損失，因此控制污染是植物組織培養(yǎng)苗工廠化生產(chǎn)中重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。本文從滅菌辦法、內(nèi)源性污染、繼代培養(yǎng)中污染防治等方面，進行了紅掌組培快繁過程中污染因素的分析及對策的探討。核心詞：紅掌，組織培養(yǎng)，滅菌，污染，防治

AndraeanumduringtissuecultureanalysisofthecausesofpollutionandrelatedcountermeasuresABSTRACTAnthurium,alsocalledAndrewFlower,linessuchasflamingo,aFireAraceae.Itsbrightcolors,tallandstraightstem,greenleaf-typeappearance,arewell-knownintoday'sworldofcutandpottedflowers,onelargemarketpotential,withhighornamentalvalueandeconomicvalue.Flowerandraeanumbreedingmethodscommonlyusedrametspropagation,cuttingpropagationandtissueculturepropagation.However,rametspropagation,cuttingpropagationisdifficulttomeetcurrentmarketdemand,tissuecultureandraeanumFlowerExpressareaneffectivewayofbreeding.Tissueculturebecauseofthefrequentoccurrenceofvariousdegreesofpollution,resultingingreatloss,socontrolofpollutionareindustrialplanttissueculturevaccineproductiontechnologyintheimportantaspect.Thisarticlefromthesterilizationmethod,endogenouspollutionsubcultureinsuchareasaspollutionprevention,todiscusshowtominimizetheemergenceoftissueinthepollutionproblems.KEYWORDS:Anthurium，tissueculture，sterilization，pollution，preventionandtreatment目錄TOC\o"1-3"\f\h\z\u前言 1第1章培養(yǎng)基的滅菌 21.1普通培養(yǎng)基的滅菌 21.2不耐熱物質(zhì)的滅菌 2第2章外植體材料的消毒與滅菌 42.1外植體的消毒與滅菌 4第3章接種前的準備工作 53.1器皿、工具的滅菌 53.1.1器皿與金屬器械的滅菌 53.1.2布質(zhì)制品的滅菌 53.2培養(yǎng)室的滅菌 53.3無菌操作和無菌操作技術(shù) 5第4章紅掌誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)過程中的污染 7第5章污染的因素和防止方法 85.1普通污染 85.2內(nèi)源性污染 85.3污染因素判斷及污染苗急救 85.4防止辦法和方法 95.4.1基本辦法 95.4.2經(jīng)常檢查消毒鍋的滅菌質(zhì)量 95.4.3檢查培養(yǎng)容器與否存在問題 105.4.4繼代培養(yǎng)中污染的控制 105.4.5減少培養(yǎng)基中的有機成分 10結(jié)論 11謝辭 12參考文獻 13附錄 15外文資料翻譯 18前言紅掌（拉丁名：Spathiphyllumfloribundum），天南星科火燭屬，原產(chǎn)地哥倫比亞。其花色艷麗，花莖挺拔，葉型翠綠美觀，是當今世界出名的切花和盆栽花卉之一，市場潛力大，含有極高的觀賞價值和經(jīng)濟價值。其繁殖辦法普通采用分株繁殖、扦插繁殖和組織培養(yǎng)繁殖。但分株繁殖、扦插繁殖很難滿足現(xiàn)在市場的需求，組織培養(yǎng)是安祖花快速繁殖的有效途徑。植物組織培養(yǎng)中經(jīng)常會出現(xiàn)不同程度的污染問題，污染是在組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，造成培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。它是影響植物組織培養(yǎng)的一種重要因素，它普通會造成培養(yǎng)失敗造成很大的損失。植物組培苗的工廠化生產(chǎn)在我國發(fā)展速度很快，組織培養(yǎng)技術(shù)日趨完善，但在組織培養(yǎng)中普通會出現(xiàn)不同程度的污染，因此防止和控制污染是植物組織培養(yǎng)苗工廠化生產(chǎn)中重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。在植物組織培養(yǎng)過程中，存在兩種類型的污染：一類是普通所說的污染，即外植體消毒不徹底，無菌操作和培養(yǎng)過程中，如：培養(yǎng)基、接種工具、接種室消毒不嚴格或操作不規(guī)范而造成的污染；另一類是內(nèi)源菌污染，內(nèi)源菌涉及真菌和細菌，內(nèi)源污染普通是指內(nèi)源細菌所致的污染。本文從普通的污染的控制、內(nèi)源性污染的控制、繼代培養(yǎng)中污染防治、減少培養(yǎng)基中的有機成分等方面，討論了如何減少組培中出現(xiàn)的污染問題，如：對于普通的污染來說，重要從操作環(huán)境、操作人員、儀器；對于內(nèi)源性污染重要是從外植體預(yù)解決到外植體滅菌辦法；對于繼代培養(yǎng)污染的控制重要是從對無菌外植體進行檢查和重復(fù)進行莖尖培養(yǎng)或分生組織培養(yǎng)；至于對培養(yǎng)基有機成分的減少方法重要是減去培養(yǎng)基中的VB1、VB6或除去培養(yǎng)基中的蔗糖這幾方面加以敘述。第1章培養(yǎng)基的滅菌1.1普通培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基是在有菌的環(huán)境中配制的，在該過程中會使培養(yǎng)基帶有多個雜菌，因此，每次培養(yǎng)基配制完畢和分裝后應(yīng)盡快滅菌，否則培養(yǎng)基中就會滋生多個雜菌，變化培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和pH值，影響培養(yǎng)效果。慣用滅菌辦法是用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌，將培養(yǎng)基置于高壓滅菌鍋中，從達成規(guī)定溫度的時刻算起，在0.105Mpa的壓力下（121。C）滅菌15-40min。滅菌的時間取決于溫度，而不是直接取決于壓力。由于容器的體積不同，瓶壁的厚度不同，所需滅菌時間也不同[1]（表1-1），對通過高壓滅菌后不會變質(zhì)的物品，如無菌水、培養(yǎng)皿、器械等，可延長滅菌時間和增加壓力。培養(yǎng)基滅菌時間不能過長，否則容易引發(fā)培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的損失，并且瓊脂也會隨滅菌時間的延長，凝固能力下降，甚至不能凝固。因此，所需的滅菌時間應(yīng)隨著要進行滅菌的物體體積而變化。表1-1培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌所必須的最少時間容器的體積（ml）在121。C下滅菌所必須的最少時間（min）20-501575-15020250-5002510003015003540當滅菌鍋里的熱溶液冷卻時，必須十分小心，如果壓力下降過急，超出了溫度下降的速率，就會使液體滾沸，從培養(yǎng)容器之中溢出。另外，只有當高壓鍋的壓力表指針回到零時，才干打開滅菌鍋。1.2不耐熱物質(zhì)的滅菌某些生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（GA3、Zt、IAA、IBA）、尿素以及某些維生素等不耐熱的物質(zhì)遇熱易分解，不能進行高壓蒸汽滅菌解決，普通只能采用單獨液體過濾滅菌辦法。熱分解化合物溶液的滅菌是通過過濾膜進行過濾滅菌的，然后將其加入通過高壓滅菌過的并未凝固的培養(yǎng)基中。如果是制備固態(tài)培養(yǎng)基，辦法是先將沒有不耐熱物質(zhì)而包含其它化合物的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)瓶中進行高壓蒸汽滅菌，滅菌后置于超凈工作臺上冷卻。當其冷卻至45。C左右（即瓊脂凝固溫度），瓊脂將要凝固之前，加入通過濾滅菌的各項不耐熱成分的溶液，然后混勻放置，待冷涼凝固后備用，但不能在瓊脂培養(yǎng)基溫度較高時加入，以避免不耐熱物質(zhì)的分解[2]。第2章外植體材料的消毒與滅菌2.1外植體的消毒與滅菌1、用紅掌莖尖作外植體時，要盡量選用帶菌少的材料，如果室外栽培的材料污染太嚴重，可先將植物樣本挖出，改為室內(nèi)盆栽，噴布殺蟲劑和殺菌劑，不便移栽的，可套塑料袋，待長出新枝條后，再行采樣接種。2、對污染嚴重的外植體，能夠在培養(yǎng)基中加入殺菌劑。也可在菌類長入組織內(nèi)部時，除去韌皮組織，只接種內(nèi)部的分生組織可避免材料帶菌。3、外植體消毒慣用藥劑有：70%～75%的酒精，0.3%～0.6%的次氯酸鈉溶液和0.1%的升汞溶液等。選用何種滅菌劑和滅菌時間根據(jù)不同狀況及操作者的經(jīng)驗來掌握，既規(guī)定將外植體表面的微生物徹底殺死，又規(guī)定盡量少傷害外植體組織和表層細胞。先用75%的酒精棉花擦拭外植體材料再使用消毒藥劑常能獲得較好的消毒效果[3]。慣用消毒劑的消毒效果比較見表2-1:表2-1慣用消毒劑的消毒效果比較消毒劑使用濃度（%）去除難易消毒時間（min）效果3.3無菌操作和無菌操作技術(shù)植物組織培養(yǎng)是一種無菌技術(shù)，因此不僅規(guī)定整個操作過程，一切用品、材料、培養(yǎng)基、培養(yǎng)室、工作人員的衣物都要無菌，并且規(guī)定工作人員在操作過程中要恪守無菌操作的規(guī)程，如少有疏忽，都會造成無法挽回的后果，使工作前功盡棄。污染中特別注意一種呈乳白色的細菌污染，這種細菌為芽孢桿菌。法國林木育種協(xié)會鑒定為緩慢芽孢桿菌，它外被莢膜，耐高溫，普通消毒劑難以殺死。它可隨培養(yǎng)材料、用品等傳輸；也可出現(xiàn)在培養(yǎng)基表面，或呈滴形云霧狀存在培養(yǎng)基內(nèi)，若出現(xiàn)時應(yīng)嚴格滅菌，清洗和消毒用品，并更換消毒酒精[6]。操作人員操作動作要純熟、動作快、規(guī)范，這樣能夠縮短操作時間，減少污染。由于有諸多組織培養(yǎng)的失敗，從材料、培養(yǎng)基條件等方面檢查均無問題，只是由于操作技術(shù)不純熟，如脫毒培養(yǎng)抽取莖尖很小，操作時間長了就會使莖尖失水變干，或不慎感染雜菌，再同時接種的環(huán)境又不是絕對無菌的。因此工作人員在進行無菌操作是要嚴守下列幾點：1、入無菌室前，要洗手，去掉指甲中的污物。2、入室時要穿上通過消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。3、操作前要用70%的酒精擦洗工作人員的手，操作中要經(jīng)慣用酒精擦洗手。不準講話，亦不準對著操作區(qū)呼吸，以免微生物污染材料、培養(yǎng)基和用品。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。4、必須在酒精燈火焰處進行操作，如打開瓶口，轉(zhuǎn)接材料。蓋瓶蓋前應(yīng)將瓶口在火焰上燒一下，再將蓋子也在火焰上燒一下，然后蓋上。第4章紅掌誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)過程中的污染初代培養(yǎng)獲得的無菌材料在后期或繼代培養(yǎng)也可能出現(xiàn)污染，這首先是由于操作不慎的因素，另外即是由于初代培養(yǎng)中使用了營養(yǎng)相對簡樸的培養(yǎng)基有可能使污染不易體現(xiàn)出來，有時繼代材料在培養(yǎng)室則可能被螨傳輸?shù)恼婢廴?。對已污染的紅掌組培苗，有時因植物材料難得或重新發(fā)生要耗費諸多時間，也可切取較大的植株重新消毒接種。李春燕等用400或600萬單位/L的青霉素無菌水溶液分別浸泡紅掌組培細菌污染苗60min或40min，可有效防治組培中的細菌污染。經(jīng)解決過的苗繼代培養(yǎng)時，不再重復(fù)出現(xiàn)細菌污染現(xiàn)象，且苗分化能力強，生根培養(yǎng)時，根系發(fā)達，移栽成活率高[7]。李穎等的實驗研究證明，如果繼代培養(yǎng)中只有真菌污染，采用3%的多菌靈無菌液浸泡0.5h以上即可，用無菌水沖洗后接種或不用無菌水沖洗直接接種都可消除真菌污染。如果在細菌污染和細菌、真菌同時污染的狀況下，可采用HgCl2消毒法，把污染的紅掌培養(yǎng)苗切割成較長的莖段作外植體，用自來水沖洗0.5h，再在超凈工作臺上用乙醇和HgCl2進行短時間的解決即可再度建立無菌苗培養(yǎng)體系[8]。有參考文獻[1]李云.林果花菜組織培養(yǎng)快速育苗技術(shù)，中國林業(yè)出版社，，1（2）:23-25[2]王青連.植物組織培養(yǎng)[M]，中國農(nóng)業(yè)出版社，：23-24.[3]周學(xué)工業(yè)出版社，，80-81[9]李春燕，李穎.組織培養(yǎng)中青霉素對細菌污染的克制作用，東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，,28(5):97-98[10]李穎，李春燕.多菌靈和青霉素在組培污染中的應(yīng)用，林業(yè)科技，，27（1）：6-8[11]由翠榮,曲復(fù)寧,龔雪琴等.迷你玫瑰組織培養(yǎng)中細菌污染的避免[J]，植物生理學(xué)通訊,,40（1）:46-47[12]周俊輝，周厚高，劉花全.植物組織培養(yǎng)中內(nèi)生細菌污染問題《廣西植物》，，23(1):41-47[13]biotec.植物組織培養(yǎng)苗之污染與檢測[EB/OL].，15(1):16-17[14]林盛，馬崇烈，胡東瓊.組織培養(yǎng)中污染的控制[J]，廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，1994(2)：87-88.[15]于?？?，張廣軍.玫瑰組織培養(yǎng)污染控制技術(shù)方法，陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，(11):47-48[16]宋鋒惠,李康,史彥江.組織培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)研究，新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，，39(6)：343-345[17]肖玉蘭.植物無糖組培快繁工廠化生產(chǎn)技術(shù)，云南科技出版社，，3(2):1-4附錄滅菌辦法慣用的滅菌辦法可分為物理的和化學(xué)的兩類，即：物理辦法如干熱(烘燒和灼燒)、濕熱(常壓或高壓蒸煮)、射線解決(紫外線、超聲波、微波)、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等方法；化學(xué)辦法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學(xué)藥品解決。這些辦法和藥劑要根據(jù)工作中的不同材料不同目的適宜選用濕熱滅菌（培養(yǎng)基）培養(yǎng)基在制備后的24h內(nèi)完畢滅菌工序。1、高壓滅菌辦法是最慣用的物理滅菌辦法，高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外溢，壓力不停上升，使水的沸點不停提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達121℃。在此蒸氣溫度下，能夠很快殺死多個細菌及其高度耐熱的芽孢。注意完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才干徹底。高壓滅菌放氣有幾個不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，確保滅菌徹底。慣用辦法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到O．05MPa時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。三次放氣后，關(guān)閥再通電，壓力表上升達0．1～0．15Mpa時，維持15～20min。對高壓滅菌后不變質(zhì)的物品，如無菌水、栽培介質(zhì)、接種用品，能夠延長滅菌時間或提高壓力。而培養(yǎng)基要嚴格恪守保壓時間，既要保壓徹底，又要避免培養(yǎng)基中的成分變質(zhì)或效力減少，不能隨意延長時間。對于某些布制品，如實驗服、口罩等也可用高壓滅菌。洗凈晾干后用耐高壓塑料袋裝好，高壓滅菌20～30min。高壓滅菌前后的培養(yǎng)基，其pH值下降0.2從而變化培養(yǎng)基的滲入壓。在8%～20%蔗糖范疇內(nèi)，高壓滅菌后的培養(yǎng)基約升高0.43倍。培養(yǎng)基中的鐵在高壓滅菌時會催化蔗糖水解，可使15%～25%的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。培養(yǎng)基值不大于5.5，其水解量更多，培養(yǎng)基中添加0.1%活性炭時，高壓下蔗糖水解大大增強，添加1%活性炭，蔗糖水解率可達5%。2、灼燒滅菌（用于無菌操作的器械）在無菌操作時，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前在酒精燈火焰上灼燒滅菌。冷卻后，立刻使用。操作中可采用250或500ml的廣口瓶，放入95%的酒精，方便插入工具。3、干熱滅菌（玻璃器皿及耐熱用品）干熱滅菌是運用烘箱加熱到160～180。C的溫度來殺死微生物。由于在干熱條件下，細菌的營養(yǎng)細胞的抗熱性大為提高，靠近芽孢的抗熱水平，普通采用170℃持續(xù)90min來滅菌。干熱滅菌的物品要預(yù)先洗凈并干燥，工具等要妥為包扎，以免滅菌后取用時重新污染。包扎可用耐高溫的塑料。滅菌時應(yīng)漸進升溫，達成頂定溫度后統(tǒng)計時間。烘箱內(nèi)放置的物品的數(shù)量不適宜過多，以免妨礙熱對流和穿透，到指定時間斷電后，待充足冷涼，才干打開烘箱，以免因驟冷而使器皿破裂。干熱滅菌能源消耗太大，浪費時間。4、過濾滅菌（不耐熱的物質(zhì)）某些生長調(diào)節(jié)劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些維生素是不耐熱的，不能用高壓滅菌解決，普通采用過濾滅菌辦法?？捎脽o菌的孔徑0.20～0.45um的硝酸纖維素膜過濾菌類，當溶液通過濾膜后，細菌的細胞和真菌的孢子等因不不大于濾膜直徑而被阻，在需要過濾滅菌的液體量大時，常使用抽濾裝置；液量小時，可用注射器。使用前對其高壓滅菌，將濾膜裝在注射器的靠針管處，將待過濾的液體裝入注射器，推壓注射器活塞桿，溶液壓出濾膜，從針管壓出的溶液就是無菌溶液。5、紫外線和熏蒸滅菌（空間）(1)紫外線滅菌在接種室、超凈臺上或接種箱里用紫外燈滅菌。紫外線滅菌是運用輻射因子滅菌，細菌吸取紫外線后，蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生構(gòu)造變化，引發(fā)細菌的染色體變異，造成死亡。紫外線的波長為200～300nm，其中以260nm的殺菌能力最強，但是由于紫外線的穿透物質(zhì)的能力很弱，因此只適于空氣和物體表面的滅菌，并且規(guī)定距照射物以不超出120cm為宜。(2)熏蒸滅菌用加熱焚燒、氧化等辦法，使化學(xué)藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。這種辦法簡便，只需要把消毒的空間關(guān)閉緊密即可。慣用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時，房間關(guān)閉緊密，按5～8ml/m3用量，將甲醛置于廣口容器中，加5g/m6、噴霧滅菌（物體表面）物體表面可用某些藥劑涂擦、噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手、植物材料表面等，可用70%的酒精重復(fù)涂擦滅菌，l%～2%的來蘇兒溶液以及0.25%～1%的新潔爾滅也能夠。外文資料翻譯CHITOSANonandraeanumtissueinhibitionofbacteriacontaminationAbstract:Thefungiwasisolatedandpurifiedfrompollutedanthuriumsubculturemedium,identifiedtobeDeuteromycotinaHyphpmycetesHyphomycetalesDematiaceaeandtrichoderma.Theinhibitioneffectofthethreekindsofchitosanonthefungiwasconducted.Theresultsshowedthatthechitosanhadinhibitioneffectonthefungi.Thehigherconcentrationsofchitosanhadabetteinhibitioneffectthanthelowerones.Theinhibitioneffectof50000and250000molecularweightchitosanisbetterthanthatofthe3000molecularweight.Itispreliminarilyprovedthatchitosanhadgoodinhibitioneffectonthefungifrompollutedtissueculture,andwillhavegoodapplicationvalueinthefieldsofpollutionpreventioninflowerstissueculture.Keywords:tissueculture;contamination;Chitosan;inhibitioneffectPlanttissueculture,notonlyinplantbreeding,rapidpropagationofseedlingsandtheproductionofusefulsecondarymetabolites,suchastheuseofawiderangeofplantgeneticengineeringisandPlantMolecularBiology,oneoftheimportantfoundationforthestudy[1].Pollution,browning,glassandtissueculturearethemainproblems,includingpollutionofthemostcommon[2].Thereforetakeeffectivepreventionandcontrolmeasurestoreducethechanceofcontaminationoccurred,tissuecultureisanimportantguaranteeforsuccess.Chitosan(chitosan)isthechitininstrongalkalineconditionsfromB

AftertheformationofacylanimportantderivativeisdeterminedbyanumberofN-acetylglucosaminethroughβ-(1-4)glycosidicbondlinkingthenatureofitmorelively.Hasnaturalantibacterialpropertiesofchitosan,andabroadspectrumantimicrobial,inrecentyears,chitosaninvariousfieldssuchasagriculture，medicine[3],manufacture[4],food[5],etc.Theuseofgreatimportance.Tissuecultureofthechitosanintheapplicationofinhibitionhasnotbeenreported.Thisexperimenttobefromthecontaminatedmediumsubcultureandraeanumextraction,purificationandidentificationofbacteriacontamination,withdifferentmolecularweightchitosananddifferentconcentrationsoftheirinhibition,andexplorethebestinhibitoryeffectofchitosanmolecularweightandthebestinhibitoryconcentration,inordertoexplorethechitosanasanewtypeofantimicrobialagenttoprovidespecificinformation.1MaterialsandMethods

1.1Testmaterials

1.1.1Isolates

Streptomycesbacteriapollution(code-namedWCHPA),separatedfromthelaboratorycontaminationandraeanumsubculturemedium.

1.1.2TestforDrugs

Chitosan,aZhejiangXingBiotechnologyAustraliaLimited,amolecularweightof3kd(degreeofdeacetylation>80%),50kd(degreeofdeacetylation>90%),25kd(degreeofdeacetylation>90%)[6].

1.1.3MediumPDAmedium

Potatoes200g,glucose20g,agar20g,distilledwater1000ml,pHvalueofthenatural.

1.2TestMethod

1.2.1Isolationandpurification

CleanouttheworkinTaichungandraeanumsubculturemediumpollutionfungi,fromPDAmedium.Repeatseveraltimesuntilthecolonycharacteristicsandmorphologychangesarenolonger,wecanidentifybacteriahavebeenpurified.

1.2.2Identificationofbacteriacontamination

Continuousobservationofcolonymorphologyafterpurification.Filmproductionequipmenttofurtherobservetheshapestrain,mycelium,spores,sporecellsporecellmorphologyandconidiationofthewaysandformsandsoon,takingpictureswithadigitalmicroscope.

1.2.3BacteriostaticTest

Thatthedifferentmolecularweightchitosanwith1MsolutionofaceticaciddissolvedmixedwithPDAmediumtoproduceafinalconcentrationofchitosan(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0)mg/mlofculturemedium,1MsolutionofsodiumhydroxidebyadjustingpHvalueof6.0,inadditiontothecontrolwithoutchitosan,theotherwiththeadditionofchitosaninthesamemedium[7].Toeliminateallhigh-pressurecookersterilization30minunder121℃andpourplate.Myceliumwhitetogreenafter24handthenintoabrown,hyphaedeveloped,velvet-like,3dtrainingaroundthemiddleofthebrownandwhiteflocculentmyceliumoffimbriaeproduced.Hyphaeareseparatedfromalongstalkconidiatoproducelateralbrancheswhorledbranchesmeristematicconidiationshortbottles.Single-cellconidiaoval,smooth.

2ResultsandAnalysis

2.1Andraeanumsymptomssubculturemediumpollution

AndraeanumsubcultureingrowthmediumbrownFimbriae,mediumsurfacewasblack,brownandwhitemyceliumontheflocculationbetweenthehyphae.

2.2fungalpurecultureandidentificationoftheresults

PDAmediumintheuppercolonydiameter,edgeneatly,sporegerminationofthePDAmediumbyaddingchitosan,4dclearlyobservedafterthecolonyissurroundedbyablackhalo,blackhaloandcolonygrowthastotherelocationof.Thebetterthegeneralinhibitoryeffectofthemoreobviousblackhalo[8].Colonyhasnocontrolthisphenomenon.Chitosanmolecularweightandconcentrationofthebacteriostaticeffect.

2.3.Thesamethreeconcentrationsofthebacteriostaticeffectofchitosanmolecularweightcompared

Concentrationof0.5mg/ml3speciesofmolecularweightchitosanWCHPAcolonyinhibitoryeffectofsixconcentrationsofthreekindsofmolecularweightofchitosanontheinhibitionrateofcolonyWCHPAresults0.5mg/mlconcentrationofthreekindsofmolecularweightchitosanthereisnoclearlaw,themaximuminhibitoryrateof50,000inmolecularweightofchitosanfortheculturemediumfor20.45%.Inhibitoryrateandthetimeandnocloseties.Theresultsshowthattheconcentrationof0.5mg/mlofthethreekindsofmolecularweightoftheantibacterialeffectofchitosanhasnotbeensatisfactory[9].5dpriortothefirstthreekindsofchitosanmolecularweightthegreatertheinhibitoryrateofthehighermolecularweight,andareextendedovertimetoreducetherateofinhibition.Inparagraph5d,3000molecularweightinhibitoryrateofmorethantwootherinhibitoryrateofmolecularweight,molecularweightandinhibitionrateof3000alsoreachedthehighestvalue.Atitsbacteriostaticeffectafter7dand5dissimilartobefore,thegreatertheinhibitoryrateofthehighermolecularweight.

3Discussionandconclusions

3.1Chitosanasapotentialnewantibacterialagents

Pollutionplanttissuecanbebroadlydividedintotwotypesofoperationsmayproduceairpollutionmainlymoldcontamination;explantsisitselfbroughtaboutbybacteriaprimarilybyfungalandbacterialcontamination[10].Highinhibitoryratewasashighas79.55%.Antibioticsintissuecultureisnowthemostcommonmolecularweightofchitosanand3.2haveanimportantimpactonantimicrobialpropertiesoftheexperimentalresultsfromthe50,000and250,000thebacteriostaticeffectofchitosanmolecularweightthanthatof3000;thehighestinhibitoryrateinthe250,000molecularweightconcentrationof3.0mg/mland2.0mg/mlofthetwo.Butonthewhole,takingintoaccountthefactorsofpriceanditsoperationtotheconclusionthattheexperimentalmolecularweightof50,000asthebestconcentrationof1.5mg/ml.

3.2ConcentrationontheantimicrobialpropertiesofchitQiu-ping[11],Theresultsshowthattheantimicrobialeffectofchitosanwithitsconcentrationincreases,theexperimentalresultssupporttheresultsofthestudy.Awiderangeofapplicationsofchitin,chitosaninthemedical,food,environmentalprotection,inareassuchaschemicalproductshavewide-rangingandimportantapplications.Chitosanflowerswillbeusedfortissueculturewouldbeverygoodprospects.References[1]MK.Razdan.Zun-Xiao-an,ZHUYangtranslation.IntroductiontoPlantTissueCulture[M].Beijing:ChemicalIndustryPress,:1-2.[2]Hu,ZHANGLi-jun,baixuemei,etal.PlantTissueCulturePollutionAnalysisandthedisinfectionofexplants[J].AnhuiAgriculturalScience,,35(3):680-681.[3]Yi-TingWang,wanglianping,MouHero,etal.Industrialproductionoftissueculturestudiesofpollutionanditscontrol[J].AnhuiAgriculturalScience,,33(12):2357-2358.[4]Chiangbig.Chitin[M].Beijing:ChinaEnvironmentalSciencePress,1996.[5]FuTianXia,LIUXiao-yu,LiuZhiheng.Chitosan'santibacterialpropertiesoftheprogressofappliedresearch[J].LiaoningChemical,,1234(12):541-544.[6]YuHanshou,WuZhang,YangBing.Chitosaninhibitresearchprogressofplantdiseases[J].Naturalproductsresearchanddevelopment,1999,12(3):94-97.[7]LiFang,shishaowei.ChitosanPreparationandapplicationinthefoodindustryMechanism[J].FoodandDrug,(03A):19-22.[8]Wu,Xiawater.Non-biologicalfactorsontheantibacterialactivityofchitosan[J].FoodScience,,25(7):53-55.[9]wuxiaoyong,Qing-XiaoZeng,MOshaofang.Severaloftheantibacterialpropertiesofchitosan[J].FoodandFermentationIndustry,,206(2):18-21.[10]Hu,ZHANGLi-jun,baixuemei,etal.PlantTissueCulturePollutionAnalysisandthedisinfectionofexplants[J].AnhuiAgriculturalScience,,35(3):680-681.[11]Qiu-ping,ChitosanonmangoColletotrichumgloeosporioides,Diplodiaantagonismbacteria[J].Foodandmachinery,,21,(1):25-27.

殼聚糖對紅掌組培污染菌的克制作用摘要：在污染的紅掌繼代培養(yǎng)基中提取污染菌并進行了分離及純化，初步鑒定為為半知菌亞門（Deuteromycotina),絲孢綱（Hyphpmycetes),絲孢目（Hyphomycetales）,淡色孢科（Dematiaceae）,木霉屬（trichoderma）。研究了殼聚糖對該菌的克制作用，探索了3種分子量及其6種濃度的殼聚糖對該菌的克制效果。成果表明：殼聚糖對該污染菌有克制作用，5萬和25萬分子量的抑菌效果高于3000分子量，濃度越高，抑菌效果越好。初步證明了殼聚糖對組培污染菌類有較好的克制作用，在花卉組織培養(yǎng)污染防治方面含有應(yīng)用價值。核心詞：組織培養(yǎng)；污染；殼聚糖；克制作用植物組織培養(yǎng)不僅在植物育種、苗木快速繁殖和有用次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)等方面應(yīng)用廣泛，也是植物基因工程和植物分子生物學(xué)研究的重要基礎(chǔ)之一[1]。污染、褐化、玻璃化等是組織培養(yǎng)存在的重要問題，其中污染最普遍[2]。因此采用有效的防控方法，減少污染發(fā)生的機率，是組織培養(yǎng)成功的重要保障。殼聚糖（chitosan）是甲殼素在強堿性條件下進行脫乙?；饔煤笮纬傻囊环N重要的衍生物，是由多個N-乙酰氨基葡萄糖通過β-(1-4)糖苷鍵連接起來，但它的性質(zhì)較為活潑。殼聚糖含有天然抑菌性能，且抑菌譜廣，近年來殼聚糖在各個領(lǐng)域如農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)[3]、制造[4]、食品[5]等方面中的運用受到很大的重視。有關(guān)殼聚糖在組織培養(yǎng)中的抑菌應(yīng)用尚未見報道。本實驗擬從污染的紅掌繼代培養(yǎng)基中提取、純化污染菌并進行鑒定，用不同分子量及其不同濃度的殼聚糖對其進行克制實驗，探索出抑菌效果最佳的殼聚糖分子量及最佳抑菌濃度，為探索殼聚糖成為新型的抑菌劑提供具體信息。1材料與辦法1.1實驗材料1.1.1供試菌株霉菌污染菌（代號WCHPA），分離于實驗室污染的紅掌繼代培養(yǎng)基中。1.1.2供試藥品殼聚糖，有浙江澳興生物科技有限公司提供，分子量為3kd（脫乙酰度〉80%），50kd（脫乙酰度〉90%），25kd（脫乙酰度〉90