第九章模擬酶人工酶-課件

1第九章模擬酶與人工酶2模擬酶的理論基礎(chǔ)和策略模擬酶的概念吸收酶中那些起主導(dǎo)作用的因素，利用有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)等方法設(shè)計(jì)和合成一些較天然酶簡單的非蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)分子，以這些分子作為模型來模擬酶對其作用底物的結(jié)合和催化過程。由此可見，模擬酶是在分子水平上模擬酶活性部位的形狀、大小及微環(huán)境等結(jié)構(gòu)特征，以及酶的作用機(jī)理和立體化學(xué)等特異性的一門科學(xué)。一方面基于酶的作用機(jī)制，另一方面基于對簡化的人工體系中識別、結(jié)合和催化。較為理想的小分子仿酶體系有環(huán)糊精、冠醚、環(huán)番、環(huán)芳烴、卟啉等大環(huán)化合物；大分子仿酶體系有聚合物酶模型，分子印跡酶模型、膠束酶模型?；瘜W(xué)修飾、基因工程改造天然酶產(chǎn)生的半合成人工酶。抗體酶理論基礎(chǔ)主客體化學(xué)：主體和客體通過配位鍵或其他次級鍵形成穩(wěn)定復(fù)合物的化學(xué)領(lǐng)域。本質(zhì)上，來源于酶和底物的相互作用，主體和客體在結(jié)合部位的空間及電子排列的互補(bǔ)。超分子化學(xué)：超分子起源于底物和受體的結(jié)合，基于非共價(jià)健的相互作用，如靜電作用、氫鍵、范德華力等。當(dāng)接受體和絡(luò)合離子或分子結(jié)合成穩(wěn)定的、具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的實(shí)體，即“超分子”，它兼具分子識別、催化和選擇性輸出的功能。主客體化學(xué)、超分子化學(xué)是酶人工模擬的重要理論基礎(chǔ)。根據(jù)酶催化反應(yīng)機(jī)理，若能合成出能識別底物又具有酶活性部位催化基團(tuán)的主體分子，就能有效地模擬酶的催化過程。5設(shè)計(jì)模擬酶前，酶的結(jié)構(gòu)和酶學(xué)性質(zhì)的深入了解：（1）酶活性中心-底物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)、（2）酶的專一性及其桶底物結(jié)合的方式和能力、（3）反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)及各中間物的知識。設(shè)計(jì)要點(diǎn)6設(shè)計(jì)人工酶模型應(yīng)該考慮的因素：（1）非共價(jià)鍵相互作用是生物酶柔韌性可變性和專一性的基礎(chǔ)，故酶模型要為底物提供良好的微環(huán)境；（2）催化基團(tuán)必須相對于結(jié)合點(diǎn)盡可能同底物的功能團(tuán)相接近，以促進(jìn)反應(yīng)定向發(fā)生；（3）模型應(yīng)該具有足夠的水溶性，并在接近生理?xiàng)l件下保持其催化活性。設(shè)計(jì)要點(diǎn)7模擬酶可分為：根據(jù)Kirby分類法（1）單純酶模型：即以化學(xué)方法通過天然酶的活性模擬來重建和改造酶的活性。（2）機(jī)理酶模型：即通過對酶作用機(jī)制諸如識別，結(jié)合和過渡態(tài)穩(wěn)定化的認(rèn)識來指導(dǎo)酶模型的設(shè)計(jì)和合成。（3）單純合成的酶樣化合物：化學(xué)合成的具有酶樣催化活性的簡單分子按照模擬酶的屬性，可分為：①主客體酶模型②膠束酶模型③肽酶④抗體酶⑤分子印跡⑥半合成酶。9模擬酶的介紹一.主、客體酶的模型天然宿主：CD合成主體：冠醚、穴醚、雜環(huán)大分子化合物、卟啉類10主、客體酶的模型（一）環(huán)糊精酶模型環(huán)糊精是環(huán)狀低聚糖的總稱。其中研究得最多的是

環(huán)糊精。

環(huán)糊精是由6個(gè)葡萄糖分子按照1

4連接方式形成的一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)天然淀粉，并具有園柱型立體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。112．環(huán)糊精結(jié)構(gòu)示意外側(cè)親水，OH可與多種客體形成氫鍵。內(nèi)側(cè)C3C5的H和糖苷O組成的空腔，疏水性，能包結(jié)多種客體分子，類似酶對底物的識別。12介紹幾種水解酶模型1.水解酶模型α-胰蛋白酶是一種蛋白水解酶，具有疏水性的環(huán)狀結(jié)合部位，能有效的結(jié)合芳環(huán)。催化部位有57號組氨酸咪唑基，102號天冬氨酸羧基及195號絲氨酸羥基。13水解酶模型A:β-Benzyme,水解叔丁基苯基乙酸酯（p-NPAc）比天然酶快1倍。B：咪唑直接與CD連接，比天然酶催化速度快1個(gè)數(shù)量級。C：增加CD對底物過渡態(tài)的結(jié)合能力：修飾底物增加，底物與CD的結(jié)合，如用二茂鐵、金剛烷為結(jié)合位點(diǎn)的硝基苯酯,CD作為催化劑加速水解大105-106倍。142.核糖核酸酶模型核糖核酸酶具有2個(gè)組氨酸咪唑基及1個(gè)質(zhì)子化賴氨酸基處于活性中心。在它的催化下RNA的磷酸酯水解分為兩步進(jìn)行，兩個(gè)咪唑基交替起到一般酸或堿的催化作用，使離去基團(tuán)質(zhì)子化或增加親核基團(tuán)的親核性。Breslow等人設(shè)計(jì)了2種核糖核酸酶模型：A、B，A催化只生成III，B催化只生成II。CD底物復(fù)合物的幾何形狀和催化基團(tuán)所處的位置對選擇性起了決定性作用。最佳pH6：一個(gè)咪唑基以堿的形式，另一個(gè)咪唑基以質(zhì)子化形式參加反應(yīng)，與天然酶相似。163.轉(zhuǎn)氨酶的模型：磷酸吡哆醛（胺）是轉(zhuǎn)氨酶的輔酶，最重要的反應(yīng)是酮酸與氨基酸的轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)氨反應(yīng)機(jī)理.沒有酶存在時(shí)，磷酸吡哆醛（胺）也能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)氨作用，但反應(yīng)極慢，其無任何選擇性。原因在于輔酶本身無結(jié)合部位，不能形成酶-底物絡(luò)合物，后者是酶反應(yīng)必不可少的環(huán)節(jié)。第一個(gè)模擬轉(zhuǎn)氨酶模型1980年被報(bào)道，磷酸吡哆胺連在β-CD上，模擬酶的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)比磷酸吡哆胺單獨(dú)存在是快200倍，CD空腔能穩(wěn)定結(jié)合類似亞胺中間體的過渡態(tài)。最大特點(diǎn)：良好的立體選擇性，β-CD的手征性，產(chǎn)物氨基酸也具有光學(xué)活性。1718Han等人合成了含核糖的CD酶模型，兼具核酸酶、連接酶、磷酸酯酶和磷酸化酶的活力。核糖中相鄰的二個(gè)羥基是關(guān)鍵，水解環(huán)狀磷酸酯的速率提高33倍。19CD分子研究熱點(diǎn)CD和底物的結(jié)合常數(shù)104L/mol,<酶，過去的工作：CD的修飾，在CD的兩面引入催化基團(tuán)，通過柔性或剛性加冕引入疏水基團(tuán)，改善CD的疏水結(jié)合和催化功能，通常只有單包結(jié)部位和雙重識別作用。現(xiàn)在，橋聯(lián)環(huán)糊精和聚合環(huán)糊精，可得到雙重或多重疏水結(jié)合作用和多重識別作用，結(jié)合常數(shù)108L/mol,20將乙二胺與CD偶聯(lián)，然后與Cu鹽作用形成橋連環(huán)糊精。含鎳的水楊酚CD復(fù)合物A、B，對一些特殊結(jié)構(gòu)的三肽化合物有顯著的選擇結(jié)合能力,用于肽庫中篩選特異性小肽。21胡蘿卜素氧化酶的模擬：含卟啉的橋連CD，金屬卟啉能催化雙鍵，可以選擇性氧化C15=C15‘鍵。合成的復(fù)合物對底物胡蘿卜素的結(jié)合遠(yuǎn)大于產(chǎn)物視黃醛。四橋連的CD模擬P-450酶（抗氧化酶，細(xì)胞色素），P-450活性中心的金屬卟啉分子與4個(gè)CD相連，既有底物結(jié)合部位又有催化基團(tuán)的小分子。2223（二）合成的主客體酶模型合成的冠醚、穴醚、環(huán)芳烴作為主體構(gòu)筑酶模型。日本學(xué)者合成了帶巰基的仿酶模型，可在分子內(nèi)實(shí)行“準(zhǔn)雙分子反應(yīng)”以合成多肽，此模型具有結(jié)合兩個(gè)氨基酸的能力。24冠醚水解酶的模擬含冠醚環(huán)和SH基的主體分子A、B、C，分子中的冠醚環(huán)為結(jié)合部位，含醚側(cè)臂或亞甲基為主體識別部位，側(cè)臂末端為催化部位。25二.膠束酶模型膠束在水溶液中提供了疏水微環(huán)境（類似酶的結(jié)合部位），可以對底物束縛。如果將催化基團(tuán)如咪唑、硫醇、羥基、一些輔酶共價(jià)或非共價(jià)連接或吸附在膠束上，就有可能提供活性中心部位，合成有酶活力或部分酶活力的膠束酶模型。1.模擬水解酶的膠束酶模型2.輔酶的膠束酶模型3.金屬膠束酶模型26模擬水解酶的膠束酶模型表面活性劑分子上連接組氨酸殘基或咪唑基團(tuán)，就有可能形成模擬水解酶的膠束。如：N-十四?；M氨酸所形成的膠束催化PNPA（對硝基苯酚乙酸酯）的水解，催化效率比N-乙酰基組氨酸(無膠束)高3300倍。如果該膠束中加入帶羥基的表面活性劑N，N-二甲基-N-（2-羥乙基）十八烷基氨溴化物，共同催化PNPA的水解，先生成?；溥蚧虚g體，然后?；D(zhuǎn)移到羥基上（電荷中繼系統(tǒng)），與α-胰凝乳蛋白酶水解很相似。27輔酶的膠束酶模型將疏水性VB6長鏈衍生物與陽離子膠束混合形成泡囊體系中，在Cu2+存在下可將酮酸轉(zhuǎn)化為氨基酸，有效模擬了VB6為輔酶的轉(zhuǎn)氨基作用，氨基酸的收率達(dá)52%.陽離子膠束不但能活化催化基團(tuán)，也能活化輔酶的功能團(tuán)。28金屬膠束酶模型帶疏水鍵的金屬配合物單獨(dú)或與其他表面活性劑共同形成的膠束體系。模擬金屬酶的活性中心結(jié)構(gòu)和疏水性的微環(huán)境。金屬離子--催化水解反應(yīng)，疏水性微環(huán)境--底物包結(jié)。模擬羧肽酶A、堿性磷酸酯酶、氧化酶、轉(zhuǎn)氨酶。如：羧肽酶A的模擬,水解PNPP（α-吡啶甲酸對硝基苯酚酯）,Cu2+、Zn2+與相應(yīng)的表面活性劑形成1：1的配合物時(shí)，水解反應(yīng)速度最大。29三.肽酶肽酶(pepzyme)就是模擬天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。四.半合成酶半合成酶是以天然蛋白質(zhì)或酶為母體，用化學(xué)或生物的方法引進(jìn)適當(dāng)?shù)幕钚圆课换虼呋鶊F(tuán)，或改變其結(jié)構(gòu)從而形成一種新的“人工酶”。類型1：選擇性修飾AA側(cè)鏈將一種AA側(cè)鏈化學(xué)轉(zhuǎn)化為新的AA側(cè)鏈（化學(xué)誘變法）類型2：將輔酶引入母體結(jié)構(gòu)制備半合成酶，如黃素木瓜蛋白酶，其他輔酶如VB1、吡哆醛、卟啉都可以共價(jià)偶聯(lián)到某些酶的結(jié)合部位，產(chǎn)生新的實(shí)用催化劑。30抗體酶（Abzyme)催化抗體又稱抗體酶：是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物，本質(zhì)上，是一類具有催化活性的免疫球蛋白，在其可變的區(qū)域賦予了酶的屬性。抗體由抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的，在結(jié)構(gòu)上與抗原高度互補(bǔ)并與抗原具有特異結(jié)合功能的免疫球蛋白?？贵w的最顯著的特征是多樣性和專一性酶是生物催化劑酶是一類具有催化功能的生物分子酶反應(yīng)有兩個(gè)主要的特征：高催化效率、高選擇性1946年，Pauling用過渡態(tài)理論闡明酶催化的實(shí)質(zhì)酶之所以具有催化活力是因?yàn)樗芴禺愋越Y(jié)合并穩(wěn)定化學(xué)反應(yīng)的過渡態(tài)(底物激態(tài))，從而降低反應(yīng)能級。對任何化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)物在變?yōu)楫a(chǎn)物之前，必須獲得一定的能量，成為活化態(tài)或稱過渡態(tài)。過渡態(tài)處于最高能階上。過渡態(tài)與反應(yīng)物的能階之差稱為活化能。獲得活化能的多少與反應(yīng)的速度成正比。過渡態(tài)理論是解釋酶催化原理的經(jīng)典理論。過渡態(tài)理論過渡態(tài)理論認(rèn)為，酶與底物的結(jié)合經(jīng)歷了一個(gè)易于形成產(chǎn)物的過渡態(tài)，實(shí)際上是降低了反應(yīng)所需的活化能。過渡態(tài)理論與反應(yīng)過渡狀態(tài)結(jié)合作用在酶催化的反應(yīng)中，與酶的活性中心形成復(fù)合物--實(shí)際上是底物形成的過渡狀態(tài)，酶與過渡狀態(tài)的親和力要大于酶與底物或產(chǎn)物的親和力?？贵w與酶抗體具有極高的親和力，與酶相似。抗體與酶的本質(zhì)差別：酶是能與反應(yīng)過渡態(tài)選擇結(jié)合的催化性物質(zhì)，結(jié)合過渡態(tài)降低能障，而抗體是和基態(tài)緊密結(jié)合的物質(zhì)。以過渡態(tài)類似物作為半抗原，誘導(dǎo)與其互補(bǔ)構(gòu)象的抗體，使其具有催化活性（抗體酶）。1969年Jencks根據(jù)抗體結(jié)合抗原的高度特異性，與天然酶結(jié)合底物的高度專一性相類似的特性，在過渡態(tài)理論的基礎(chǔ)上首先提出設(shè)想：能與化學(xué)反應(yīng)中過渡態(tài)結(jié)合的抗體，可能具有酶的活性，催化反應(yīng)的進(jìn)行。1986年Lerner和Schultz證實(shí)了這一設(shè)想。抗體酶設(shè)想抗體酶的發(fā)現(xiàn)Lerner和Schultz分別領(lǐng)導(dǎo)各自的研究小組首次觀察到了抗體具有選擇性的催化活性。1986年美國Lerner和Schultz兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)在Science上發(fā)表論文，報(bào)道他們成功地得到了具有催化活性的抗體。并將這類具催化能力的免疫球蛋白稱為催化抗體，即抗體酶。1986年Schultz以對硝基苯酚磷酸膽堿酯（PNPPC）作為相應(yīng)的羧酸二酯的過渡態(tài)類似物。誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體酶使水解反應(yīng)速度加快12000倍?？贵w酶抗體酶（Abzyme）或催化抗體（Catalyticantibody)一種具有催化功能的抗體分子，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。它是利用現(xiàn)代生物學(xué)與化學(xué)的理論與技術(shù)交叉研究的成果，是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物。過渡態(tài)理論與抗體酶如果使抗原最大限度地接近某一特定反應(yīng)的過渡態(tài)，就可能使誘導(dǎo)的抗體在與之結(jié)合時(shí)發(fā)揮催化作用。實(shí)際所采用的過渡態(tài)抗原只是推測而設(shè)計(jì)的過渡態(tài)類似物。用過渡態(tài)類似物誘導(dǎo)的抗體所催化的反應(yīng)并非該類似物本身，而是與其相似的另一種反應(yīng)?？贵w酶具有典型的酶反應(yīng)特性結(jié)合了酶與抗體的優(yōu)點(diǎn)，既可以起酶促催化作用，又可以起抗體的選擇性和專一性結(jié)合抗原的作用。與配體(底物)結(jié)合的專一性，包括立體專一性，抗體酶催化反應(yīng)的專一性可以達(dá)到甚至超過天然酶的專一性；具有高效催化性，一般抗體酶催化反應(yīng)速度比非催化反應(yīng)快102～106倍，有的反應(yīng)速度已接近于天然酶促反應(yīng)速度；仍比天然酶慢抗體酶還具有與天然酶相近的米氏方程動(dòng)力學(xué)及pH依賴性等。在理論上研究酶的作用機(jī)理，也為過渡態(tài)理論提供依據(jù)。抗體酶的特性有更強(qiáng)的專一性和穩(wěn)定性抗體的精細(xì)識別使其能結(jié)合幾乎任何天然的或合成的分子抗體酶催化反應(yīng)的介質(zhì)效應(yīng)酯解反應(yīng)中介質(zhì)效應(yīng)：抗體酶在有機(jī)溶劑中具穩(wěn)定性。脫羧反應(yīng)中介質(zhì)效應(yīng)：有機(jī)溶劑引起脫羧反應(yīng)速率增加。?；D(zhuǎn)移反應(yīng)中介質(zhì)效應(yīng)：在疏水溶劑中，活性較高?？贵w酶的催化反應(yīng)類型天然酶所催化的6種酶促反應(yīng)和數(shù)10種類型的常規(guī)反應(yīng)的抗體酶，如酯、羧酸和酰胺鍵的水解、酰胺的形成、光誘導(dǎo)裂解和聚合、酯交換、內(nèi)酯化、克萊森重排、金屬螯合、環(huán)氧化、氧化還原、化學(xué)上不利的環(huán)化、肽鍵形成、脫羧、過氧化、周環(huán)反應(yīng)。能催化一些天然酶不能催化的反應(yīng)有許多化學(xué)反應(yīng)還沒有已知酶催化進(jìn)行抗體的多樣性決定了抗體酶催化反應(yīng)類型多樣性抗體酶可以根據(jù)需要人工裁制抗體酶的制備將抗體轉(zhuǎn)變?yōu)槊缚赏ㄟ^誘導(dǎo)法、拷貝法、引入法、化學(xué)修飾法等途徑。誘導(dǎo)法是利用反應(yīng)過渡態(tài)類似物為半抗原制作單克隆抗體，篩選出具高催化活性的單抗即抗體酶?？截惙ㄖ饕鶕?jù)抗體生成過程中抗原-抗體互補(bǔ)性來設(shè)計(jì)的。引入法則借助基因工程和蛋白質(zhì)工程將催化基因引入到特異抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)上，使其獲得催化功能?；瘜W(xué)修飾法對抗體進(jìn)行化學(xué)修飾，使抗體與催化基團(tuán)相連。誘導(dǎo)法設(shè)計(jì)半抗原選擇合適的反應(yīng)過渡態(tài)類似物作為化學(xué)模型物用設(shè)計(jì)好的半抗原，與載體蛋白（如牛血清白蛋白）偶聯(lián)制成抗原；將此抗原進(jìn)行免疫，使宿主針