第五章 目的基因的獲取

第五章目的基因的獲取把需要研究的基因稱為目的基因（靶基因或者插入基因）。要分離、改造、擴增或表達的基因。

目的基因：如：生長激素基因、干擾素基因等。就是幾千個或幾百個甚至更少的堿基對的DNA片段。生物種類人擬南芥果蠅水稻蠕蟲流感病毒基因數(shù)目（萬個）3~42.551.3651.780.175單個gene在整個基因組中所占的比例極其微小，加上復雜的基因間序列；對單個目的gene的分離如同大海撈針。已知基因的獲取方法：⒈PCR技術擴增目的基因⒉化學方法人工合成目的基因未知基因的獲得途徑：⒈構建基因組文庫利用鳥槍法克隆目的基因2.構建cDNA文庫，篩選目的基因3.mRNA差異顯示技術篩選差異表達基因4.酵母雙雜交體內(nèi)鑒定基因本章內(nèi)容第一節(jié)基因組DNA的片斷化

第二節(jié)基因的化學合成第三節(jié)目的基因的保存和擴增第四節(jié)目的基因的分離和擴增

第一節(jié)基因組DNA的片斷化二、限制性內(nèi)切酶消化法一、

機械切割法一.機械切割法（1）超聲波斷裂成約300bp的隨機片斷（2）高速攪拌1500轉/分下攪拌30min，可產(chǎn)生約8kb的隨機片斷（3）移液器抽吸法二、限制性內(nèi)切酶消化法用限制性內(nèi)切酶把基因組DNA切成不同大小的片斷。酶切基因組DNA1.優(yōu)點

如果帶有粘性末端，產(chǎn)物可以直接與載體連接，連接效率高2.缺點①目的基因內(nèi)部可能有內(nèi)切酶的切點BamHIBamHIBamHIGene目的基因也被切成碎片?、谙钠瑪喾肿恿刻蠡蛱〔环陷d體容量，不能克隆解決的辦法采用隨機片斷化制備DNA的克隆片斷3.限制性內(nèi)切酶局部消化法控制內(nèi)切酶的用量和消化時間，使基因組中的酶切位點只有一部分被隨機切開。①內(nèi)切酶識別位點的堿基數(shù)影響所切出的產(chǎn)物的長度和隨機程度限制性內(nèi)切酶的選用原則1）4bp的內(nèi)切酶平均每4096（46）bp一個切點。2）6bp的內(nèi)切酶平均每256（44）bp一個切點隨機程度高。如HaeⅢ、AluI、MobI、Sau3AI②內(nèi)切酶粘性末端能與常用克隆位點相連Sau3AIBamHI5’-GATC-3’5’-GGATC-3’文庫：是指一種全體的集合。通過克隆方法保存在適當宿主中的某種生物、組織、器官或細胞類型的所有DNA片段而構成的克隆集合體。

克隆并不是為了保存，而是為了分離。

第三節(jié)目的基因的保存和擴增一、基因文庫（genelibrary）1.基因文庫為什么要建基因文庫？高等生物的基因組DNA十分復雜，單個基因在基因組或某個特定發(fā)育階段或特定組織中所占比例很小。因此，要想從龐大的基因組中分離某個特定的未知基因非常難的，必須構建基因文庫，利用文庫篩選技術獲得該基因的陽性克隆，然后對其進行分析。基因文庫的分類基因組文庫：提取染色體基因組DNA。如果要研究的是控制基因表達的調(diào)控序列，或是在mRNA中不存在的某種特定序列。cDNA文庫：mRNA反轉錄成的cDNA。如果研究的目標是弄清一種蛋白質的氨基酸序列，可以根據(jù)克隆的cDNA分子的核苷酸序列推導出來。mRNA結構圖DNA結構圖2.基因文庫的構建載體的制備DNA的提取及片段化、cDNA的合成載體與插入片段的連接

重組DNA分子導入宿主菌轉化細胞的篩選將某種生物細胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當?shù)妮d體連接，引入相應的宿主細胞中繁殖保存和擴增。二、基因組文庫的構建1.基因組文庫理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因篩選目的基因目前常用的載體2.載體選用載體能夠容載的DNA片斷大小直接影響到構建完整的基因文庫所需要的重組子的數(shù)目。載體容量越大，所要求的DNA片斷數(shù)目越少對載體的要求載體系列：容量為24kpcosmid載體：容量為50kbYAC：容量為1MbBAC:容量為300kb（1）λ噬菌體載體最常用

插入型載體構建文庫時，通常用限制性核酸內(nèi)切酶切割位于λ噬菌體DNA非必需區(qū)的單一酶切位點，以供外源基因片段的插入，插入片段適宜長度約為9kb。

替代型載體構建文庫時，需要將非必需區(qū)兩邊的臂進行分析純化，才能用于連接，插入片段適宜長度約為9～22kb。（2）黏粒載體不僅能克隆和增殖完整的真核基因，還可克隆和分析組成某一基因家族或基因座的真核DNA片段。構建過程與噬菌體文庫的構建過程相似。（3）YAC、BAC載體克隆大片斷DNA的載體。可用來克隆完整的動物基因。在人類基因組計劃中，YAC被廣泛地用于大規(guī)?；蚪M結構分析。最早用于基因克隆的載體。只能容納比質粒分子量更小的片段。不能用于核基因組文庫。適合于短序列的克隆文庫。葉綠體DNA文庫、線粒體DNA文庫、cDNA文庫。（4）質粒載體3.基因組文庫構建的一般步驟（1）基因組DNA的提取關鍵:制備高分子質量的基因組DNA經(jīng)典的方法：在EDTA和SDS存在下，用蛋白酶K消化細胞，然后用酚－氯仿混合液抽提蛋白質，并用透析法去除分子質量雜質。在提取時必須盡可能地避免機械切割關鍵：斷點完全隨機，片斷長度合適于載體連接（2）DNA克隆片段的制備超聲波（300bp）或機械攪拌（8kb）①物理切割法：內(nèi)切酶Sau3A進行局部消化?？傻玫?0-30kb的隨機片斷②酶切法：（3）載體與基因組DNA大片段的連接①粘性末端直接連接載體與外源DNA大片段的兩個末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A與BamHI的酶切末端。直接連接、人工接頭或同聚物加尾②人工接頭法人工合成的限制性內(nèi)切酶粘性末端片斷各種酶的接頭可以向公司定做或購買接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉移酶粘性末端③同聚物加尾4.基因組文庫的大小一個文庫要包含99%的基因組DNA時所需要的克隆數(shù)目N=ln(1-p)ln(1-f)p:文庫包含了整個基因組DNA的概率（99%）f:插入載體的DNA片斷的平均長度占整個基因組DNA的百分數(shù)N:所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）基因文庫的大小以及從中獲得特定序列的概率的計算公式：例如：人的基因組是3×109bp，插入DNA片斷的平均長度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG:Genome大小；f:fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×1055.基因組文庫的擴增及保存（1）基因組文庫的擴增①液體培養(yǎng)增殖法最簡便混合培養(yǎng)方法：從瓊脂糖平板上挑取已長出的克隆子轉入含適當?shù)目股嘏囵B(yǎng)基中，混合的細菌生長數(shù)代后，其培養(yǎng)物于-80℃儲存（加終濃度為25%的甘油）缺點：由于細菌在液體中以混合群體的形式生長和不同克隆生長速率的差異，導致文庫中某些特定的序列過多或過少。保存單個克隆子于含有甘油的培養(yǎng)基中方法：從平板上挑選單個克隆子接種于合適的含抗生素的培養(yǎng)基中，菌體生長到一定濃度后，加入終濃度為25%的甘油，于-80℃保存。缺點：需保存的克隆子數(shù)過多，工作量大。384孔板②影印濾膜培養(yǎng)法失真最小，最麻煩用包裝后的噬菌體顆粒感染細菌，并讓細菌在硝酸纖維素膜上生長，然后將濾膜上的文庫影印到其他濾膜上，以供篩選和低溫（-80℃）保存。③制備已包裝的轉導性裂解物適用于粘粒文庫，轉導性裂解物可以在低溫下長期保存。（2）基因組文庫的保存小包裝，方便，避免反復凍融噬菌體一類的基因文庫：密封，加入少許氯仿，在4℃冰箱內(nèi)可較長時間地保存（6個月），低溫冰箱可保存數(shù)年。500kb50-300kb100-300kb，濃縮產(chǎn)物濃度達到100ng/ul三、cDNA文庫的構建cDNA文庫：是指某種生物體某一發(fā)育時期所轉錄的全部的mRNA經(jīng)反轉錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。cDNA文庫具有組織細胞特異性，具有時效性。為什么要構建cDNA文庫？真核生物的基因組DNA龐大且含有大量的重復序列，難以分離到目的基因片段。1.cDNA以mRNA為模板逆轉錄出的DNA稱cDNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反轉錄酶引物2.cDNA文庫的特點（1）不含內(nèi)含子序列（2）可以在細菌中直接表達（3）包含了所有編碼蛋白質的基因（時效性）（4）比基因組DNA文庫小得多，容易構建3.構建cDNA文庫的一般步驟（1）mRNA的來源特點：多數(shù)基因的表達具有不同程度的組織特異性和發(fā)育階段性。

選用mRNA含量高的組織材料，或通過藥物等方法提高mRNA的含量。高豐度：當特定的mRNA在細胞總mRNA群體中所占比例達到50～90％時。低豐度：當上述比例小于0.5％時。分離mRNA用商業(yè)化的OligodT纖維柱。利用真核生物mRNA都含有一段30～300個A組成的polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-5%。（2）mRNA的分離純化①原理②mRNA的分離純化纖維素柱層析法③mRNA的長度哺乳動物mRNA長度為500-8000bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb。反轉錄酶（3）cDNA的合成①cDNA第一鏈合成逆轉錄酶能以RNA為模板合成DNA。a.OligodT引導合成法從3’-開始，無法到達5’-末端mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物RNA－D