分子遺傳學(xué)第五章

物理圖的繪制原因遺傳分析繪制的基因組圖為何不能指導(dǎo)基因組計(jì)劃的測序?為何要繪制物理圖?原因有2個(gè)遺傳圖的分辨率有限微生物基因組較小，記錄成百上千次重組試驗(yàn)就能獲得十分詳盡的遺傳圖，標(biāo)記分布密度僅為數(shù)千核苷酸。人類及大多數(shù)高等真核生物由于不可能獲得大量的子代，只有少數(shù)的減數(shù)分裂事件可供研究，連鎖分析的分辨力受到很大限制。最好的一份人類遺傳圖其標(biāo)記密度平均為599kb，還不能直接用于指導(dǎo)全基因組的測序。離每100kb一個(gè)標(biāo)記的要求仍差距甚遠(yuǎn)，后者是進(jìn)入基因組全面測序的前提。高密度基因組圖僅僅采用遺傳作圖技術(shù)是無法完成的，必須借助于其他非遺傳分析的方法。遺傳圖的精確性較低Sturtevant的關(guān)于交換是隨機(jī)發(fā)生的猜想部分正確，因?yàn)橹亟M熱點(diǎn)的存在使染色體某一區(qū)段的交換頻率高于其他區(qū)段。特別是倒位區(qū)段，由于受到交換限制，無法繪制精細(xì)遺傳圖。遺傳圖的局限性表明，在進(jìn)行大規(guī)模的DNA測序之前，對大多數(shù)真核生物的遺傳圖必需進(jìn)行驗(yàn)證并利用其他作圖技術(shù)予以校正和補(bǔ)充。遺傳分析將基因及DNA標(biāo)記定位在染色體上繪制的遺傳圖。另一種基因組作圖，即直接檢測DNA標(biāo)記在染色體上的實(shí)際位置。物理作圖技術(shù)最有用的方法為以下4類：限制性作圖它是將限制性酶切位點(diǎn)標(biāo)定在DNA分子的相對位置。熒光標(biāo)記原位雜交(FISH)將熒光標(biāo)記的探針與染色體雜交確定分子標(biāo)記的所在位置。

順序標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)作圖通過PCR或分子雜交將小段DNA順序定位在基因組的DNA區(qū)段中。依靠克隆的基因組作圖

根據(jù)克隆的DNA片段之間的重疊順序構(gòu)建重疊群，繪制物理連鎖圖。物理圖的繪制方法1、限制性作圖2、熒光標(biāo)記原位雜交3、順序標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)作圖

1、限制性作圖

RFLP標(biāo)記是由限制酶酶切產(chǎn)生的一段DNA片段。不同限制酶識別的順序各異，大多數(shù)限制酶的識別順序?yàn)?、5或6個(gè)堿基對，7、8甚至更多的堿基對。

（1）、限制性作圖的基本原理

構(gòu)建限制圖的方法是比較不同限制酶產(chǎn)生的DNA片段的大小。首先用一種限制酶處理樣品，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離染色后可見大小確定的DNA片段。然后用第二種限制酶處理，獲得第二組片段。最后用2種酶混合處理，獲得第三組片段。收集所有上述資料進(jìn)行對比組裝，對于2種酶切位點(diǎn)交替出現(xiàn)的區(qū)段，利用加減法即可確定酶切位點(diǎn)的相對位置。在連續(xù)出現(xiàn)2個(gè)或多個(gè)相同酶切位點(diǎn)區(qū)段，其排列順序可有多種選擇，此時(shí)采用部分酶切的辦法使該區(qū)段只發(fā)生一次酶切，然后計(jì)算產(chǎn)生片段的長度，選擇其中正確的排序。后者稱為部分限制作圖。部分限制作圖可提供完整物理圖繪制所需的信息，但是當(dāng)涉及的限制位點(diǎn)過多時(shí)，這種方法就顯得力不從心。特別是內(nèi)部含有大小相同的片段時(shí)，位置重疊的片段無法區(qū)分，使排序變得非常復(fù)雜。此時(shí)可采用末端同位素標(biāo)記結(jié)合部分酶解的方法進(jìn)行物理圖繪制。（2）、DNA分子限制性作圖如果樣品中僅存在較少的限制性位點(diǎn)，用常規(guī)的限制酶即可繪制DNA物理圖。隨著切點(diǎn)數(shù)目的增多，單酶切，雙酶切及部分酶切產(chǎn)生的條帶數(shù)成比例擴(kuò)大，需要對大量的片段進(jìn)行比對與組裝。因?yàn)榇罅科谓?jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離時(shí)總會(huì)有些片段相互貼近，增加了分辨單個(gè)條帶的困難，很可能遺漏一些片段。限制性作圖只能應(yīng)用于較小的DNA分子，其上限取決于作圖分子中限制酶位點(diǎn)的頻率。通常采用的6堿基對識別順序的限制酶僅適合50kb以下DNA分子的精確作圖，但50kb遠(yuǎn)低于細(xì)菌及真核生物染色體的長度，只可覆蓋少數(shù)病毒和細(xì)胞器基因組。限制圖能否用于大于50kb基因組的作圖呢?

稀有切點(diǎn)限制酶限制性內(nèi)切酶是一類可與DNA結(jié)合并在特別的順序位置切割DNA的酶。因其切割位點(diǎn)有專一性，常用于RFLP分析、限制性作圖的操作。有3種限制性內(nèi)切酶，I型和Ⅲ型對酶切位點(diǎn)的特異性要求不太嚴(yán)格，Ⅱ型限制性內(nèi)切酶只能在完全正確的順序切割，專一性很強(qiáng)。例如來自大腸桿菌的限制酶EcoRI的切點(diǎn)總是5’—GAATTC—3，據(jù)此可預(yù)測已知順序的DNA經(jīng)酶切后產(chǎn)生的片段大小及其數(shù)目。2500多種限制酶，其中有300多種常用于實(shí)驗(yàn)研究。許多限制酶的識別順序?yàn)?堿基對，其他一些識別順序或長或短，有一些限制酶可識別兼并的堿基順序，如來自流感嗜血桿菌的限制酶Hinn可識別5’—GANTC—3’,其中N代表4種堿基中任何一種。限制酶切割DNA有2種方式，一種是平端切，即切頭無單鏈突出。另一種可產(chǎn)生粘性末端，即在切口位置留下5’突出或3’突出的核苷酸，一般為4個(gè)或2個(gè)核苷酸伸出。具有同一粘性末端的片段可以相互匹配，如果加入DNA連接酶將缺口補(bǔ)平，則形成穩(wěn)定的DNA分子。2個(gè)具有平端的DNA片段亦可由連接酶將其彼此結(jié)合，但效率較低。獲得理想大小的DNA片段對基因組的限制性作圖至關(guān)重要，其關(guān)鍵是選擇合適的限制酶。限制酶識別位點(diǎn)的核苷酸數(shù)目與組成決定了該酶產(chǎn)生的DNA片段的大小。如果基因組中4種堿基的分布是隨機(jī)的，預(yù)期產(chǎn)生的限制性DNA片段大小為4n,n代表限制酶識別位點(diǎn)的堿基數(shù)目。椐此可以推算：常用的4或6堿基對識別順序的限制酶只能產(chǎn)生較小的DNA片段，要獲得大于50kb的DNA片段必須采用稀有切點(diǎn)限制酶。稀有切點(diǎn)限制酶系指該酶識別的堿基順序在基因組中只有很少數(shù)量，可產(chǎn)生較大的DNA片段。稀有切點(diǎn)限制圖繪制選用稀有切點(diǎn)限制酶時(shí)有幾點(diǎn)必須注意：①一般而言，識別順序越長產(chǎn)生的片段越大。②識別位點(diǎn)的堿基組成影響限制性片段的大小。例如，人類基因組像其他哺乳類一樣，其DNA的A／T比例接近60％。如選用高比例A／T位點(diǎn)限制酶，產(chǎn)生的片段數(shù)多于高比例G／C識別位點(diǎn)酶。③有些限制酶識別位點(diǎn)較長，如酵母編碼的I—Sce識別順序?yàn)?8bp，即使高等真核生物基因組亦無此序列。此時(shí)可采用變通的方法，將這類識別位點(diǎn)引入待測的基因組中。④基因組DNA的甲基化狀態(tài)?；蚪MDNA分子的順序并非完全隨機(jī)分布，某些特異限制酶識別順序只分布在一定的區(qū)段。例如人類基因組DNA中5’—CG—3’的順序極少，因?yàn)槿思?xì)胞中具有將5’—CG—3’中胞嘧啶5—碳原子甲基化的酶，產(chǎn)生的5—甲基胞嘧啶在生理?xiàng)l件下極不穩(wěn)定，脫氨基后轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?。在漫長的進(jìn)化歷史中，人類基因組中原有的許多5’—CG—3’順序由于甲基化突變逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)?’—TG—3’順序?；罴?xì)胞中大量5’—CG—3’順序的胞嘧啶被甲基化(5—meC)，許多切點(diǎn)含有5’—CG—3’序的限制酶在人類基因組DNA中只能找到很少可切位點(diǎn)。如限制酶SmaI(5’—CCCGGG-3’)處理人類基因組DNA產(chǎn)生的片段平均長度為78kb；NotI是一個(gè)8核苷酸限制酶，靶序列(5’—GCGCGCGC—3’)在人類基因組DNA中平均每1Mb含一個(gè)切點(diǎn)。限制性作圖的潛力隨使用的稀有切點(diǎn)限制酶種類而增加，在低等生物基因組以及大分子DNA克隆片段的物理圖繪制中被廣泛采用。大分子DNA片段的分離DNA分子的長度與其在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移率僅在很小的范圍內(nèi)成線性關(guān)系，隨著DNA分子長度的增加，凝膠電泳的分辨力急劇下降。常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳即使在低濃度的凝膠條件下，也只能分離約30kb以下的線性分子。30kb以上的DNA在常規(guī)電泳凝膠中彼此擠壓，形成單一DNA遷移帶。稀有切點(diǎn)限制酶產(chǎn)生的DNA片段往往超過50kb，如NotI酶切片段可達(dá)1000kb，必須用特殊的凝膠電泳技術(shù)才能分離與觀測。Cantor首次采用一種新的電泳技術(shù)，即脈沖凝膠電泳(PFGE)突破了瓊脂糖凝膠分離大分子DNA的限制。在不改變凝膠濃度、電場強(qiáng)度和緩沖液的條件下，脈沖凝膠電泳使大分子DNA的分辨力提高于2個(gè)數(shù)量級，達(dá)到10Mb。PFGE的基本原理：將一個(gè)方向不斷變換的電場取代簡單的單一電場(單向電場)，使電泳中受阻的DNA分子在電場改變時(shí)扭轉(zhuǎn)遷移方向，達(dá)到分離的目的。凝膠中的DNA分子在電場方向不斷變換的作用下，隨時(shí)改變泳動(dòng)的方向。小分子DNA比大分子DNA更易在凝膠中重新定向，因而遷移速度更快。根據(jù)同一原理設(shè)計(jì)的電泳技術(shù)還包括：夾角等值均一電場（CHEF)電場逆轉(zhuǎn)凝膠電泳（FIGE)。交變電場分辨大分子DNA的范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出常規(guī)電泳，可將酵母14條染色體彼此分開。

大腸桿菌基因組限制性酶切位點(diǎn)物理圖大腸桿菌基因組全長4.5×106bp,NotI酶切產(chǎn)生了21個(gè)片段，長度在20～1000kb之間,經(jīng)脈沖凝膠電泳分離后，將酶切片段轉(zhuǎn)移到雜交膜上,選用已經(jīng)遺傳定位的基因?yàn)樘结樑c之雜交，可確定各酶切片段排列位置。2、熒光標(biāo)記原位雜交

熒光原位雜交(FISH)與同位素雜交的原理相同，只是標(biāo)記物不同。FISH的熒光標(biāo)記信號特點(diǎn)：可在顯微鏡下觀測，直接顯示探針與染色體雜交的位置

（1）、同位素或熒光標(biāo)記探針的原位雜交染色體DNA成為單鏈，只有單鏈DNA才可與同樣是單鏈的互補(bǔ)探針雜交。溫和的染色體DNA變性方法不破壞染色體的自然形態(tài)，其程序是首先將樣品涂抹在載玻片上自然干燥，然后用甲酰胺處理使其變性。早期的原位雜交大都采用同位素標(biāo)記探針，但效果不盡人意。原因在于同位素標(biāo)記很難兼顧敏感性與分辨率。敏感性要求放射性標(biāo)記具有較高的發(fā)射能量，但發(fā)射能量過高會(huì)使信號擴(kuò)散從而降低分辨力。用能量較低的同位素可提高分辨力，但因其敏感性低。20世紀(jì)80年代末由于非同位素標(biāo)記化合物即DNA熒光染料的發(fā)現(xiàn)使上述問題迎刃而解。這些標(biāo)記化合物將高敏感性與高分辨力集于一身，從根本上改進(jìn)了原位雜交的效果。為了使敏感性盡可能提高，可選用能產(chǎn)生極強(qiáng)信號的熒光物質(zhì)。常選擇長鏈DNA分子作為探針，一般不少于40kb的DNA片段。（2）、原位雜交的操作原位雜交最初利用的是細(xì)胞分裂中期染色體。染色體處于高度濃縮狀態(tài)，有可分辨的染色體帶型及明顯的著絲粒位置，各條染色體帶有各自的形態(tài)，有可識別的帶型。對特定探針而言，原位雜交所顯示的中期染色體熒光信號所處的位置與染色體短臂末端的相對距離是不變的，經(jīng)過比例換算可將其標(biāo)定在連鎖圖上。中期染色體的不利之處在于分辨力較低，要求2個(gè)分子標(biāo)記之間至少需隔開1000kb。中期染色體的原位雜交不適合構(gòu)建可利用的染色體物理圖，主要用于確定新發(fā)現(xiàn)的分子標(biāo)記屬于哪條染色體，給出十分粗略的染色體定位。

原位雜交的分辨力取決于雜交的技術(shù)以及染色體所處的狀態(tài)。中期染色體過于收縮不適于精細(xì)作圖，為改進(jìn)作圖精度，必須采用處于更為伸展的染色體。有2種方法可達(dá)此目的：機(jī)械伸展的染色體將中期細(xì)胞核稍作修改即可獲得伸展的染色體，離心可產(chǎn)生剪切力使染色體的伸展長度增加20倍。用這種方法制備的單個(gè)染色體形態(tài)仍可識別，其原位雜交信號的作圖與正常的中期染色體作圖相同。非中期相染色體提高分辨力考慮，間期染色體更為適用。已有一些改進(jìn)的染色體制備方法可獲得既松散又保持分辨特征的染色體。3、順序標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)作圖

限制性作圖雖然快速，并可提供詳細(xì)的信息，但不適合大基因組。原位雜交因其操作困難，資料積累慢，一次實(shí)驗(yàn)定位的分子標(biāo)記不超過3～4個(gè)。因此繪制詳細(xì)準(zhǔn)確的物理圖還必需尋找更有效的技術(shù)。

構(gòu)建最為詳細(xì)的大基因組物理圖的主流技術(shù)為STS繪圖。順序標(biāo)簽位點(diǎn)（STS)是一小段長度在100～500bp的DNA順序，每個(gè)基因組僅1份拷貝，很易分辨。原理：當(dāng)2個(gè)片段含有同一STS順序時(shí)，可以確認(rèn)這2個(gè)片段彼此重疊。2個(gè)不同的STS出現(xiàn)在同一片段的機(jī)會(huì)取決于它們在基因組中的位置靠得多近。如果它們彼此鄰接，這2個(gè)STS總會(huì)同時(shí)出現(xiàn)在相同片段上