第七章 分子發(fā)光-熒光與磷光

第七章分子發(fā)光光譜法分子熒光:Fluorescence分子磷光:Phosphorescencemolecularluminescenceanalysis§7.1分子發(fā)光的基本原理第一次記錄熒光現(xiàn)象的是16世紀(jì)西班牙的內(nèi)科醫(yī)生和植物學(xué)家N.Monardes，1575年他提到在含有一種稱為“LignumNephriticum”的木頭切片的水溶液中，呈現(xiàn)了極為可愛的天藍色。直到1852年，Stokes在考察奎寧和葉綠素的熒光時，用分光光度計觀察到其熒光的波長比入射光的波長稍微長些，才判斷這種現(xiàn)象是這些物質(zhì)在吸收光能后重新發(fā)射不同波長的光，而不是由光的漫射作用所引起的，從而導(dǎo)入了熒光是光發(fā)射的概念，他還由發(fā)熒光的礦石“螢石”推演而提出“熒光”這一術(shù)語。1867年，Goppelsroder進行了歷史上首次的熒光分析工作，應(yīng)用鋁—桑色素配合物的熒光進行鋁的測定。19世紀(jì)以前，熒光的觀察是靠肉眼進行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一臺熒光計。一、熒光與磷光的產(chǎn)生過程

luminescenceprocessofmolecularfluorescencephosphorescence由分子結(jié)構(gòu)理論，主要討論熒光及磷光的產(chǎn)生機理。1.分子能級與躍遷分子能級比原子能級復(fù)雜；在每個電子能級上，都存在振動、轉(zhuǎn)動能級；基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)S1、S2…

；第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1、T2…

；2.電子激發(fā)態(tài)的多重度電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1

S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；平行自旋比成對自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級比相應(yīng)單重態(tài)能級低；大多數(shù)有機分子的基態(tài)處于單重態(tài)；

S0→T1禁阻躍遷；通過其他途徑進入(見能級圖)；進入的幾率小；

2.激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑(分子的去激過程)

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量；傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動弛預(yù)無輻射躍遷激發(fā)態(tài)停留時間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強度相對大；熒光：10-7～10-9s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；磷光：10-4～10s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫分子吸收和發(fā)射過程的Jablonski能級圖非輻射能量傳遞過程振動弛豫：在凝聚相體系中，被激發(fā)到激發(fā)態(tài)(如S1和S2)的分子能通過與溶劑分子的碰撞迅速以熱的形式把多余的振動能量傳遞給周圍的分子，而自身返回該電子能級的最低振動能級，這個過程稱為振動弛豫。發(fā)生振動弛豫的時間10-12s。內(nèi)轉(zhuǎn)換：當(dāng)S2的較低振動能級與S1的較高振動能級的能量相當(dāng)或重疊時，分子有可能從S2的振動能級以無輻射方式過渡到S1的能量相等的振動能級上。這個過程稱為內(nèi)轉(zhuǎn)換。內(nèi)轉(zhuǎn)換發(fā)生的時間約為10-12s。內(nèi)轉(zhuǎn)換過程同樣也發(fā)生在激發(fā)態(tài)三重態(tài)的電子能級間。由于振動弛豫和內(nèi)轉(zhuǎn)換過程極為迅速(10-12s)，因此，激發(fā)后的分子很快回到電子第一激發(fā)單重態(tài)S1的最低振動能級。所以高于第一激發(fā)態(tài)的熒光發(fā)射十分少見。外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換過程是熒光或磷光的競爭過程，因此，該過程使熒光或磷光減弱或“猝滅”。系間跨越：是不同多重態(tài)之間的一種無輻射躍遷。該過程是激發(fā)電子改變其自旋態(tài)，分子的多重性發(fā)生變化的結(jié)果。當(dāng)兩種能態(tài)的振動能級重疊時，這種躍遷的概率增大。如S1到T1躍遷就是系間躍遷的例子，即單重態(tài)到三重態(tài)的躍遷。即較低單重態(tài)振動能級與較高的三重態(tài)振動能級重疊。這種躍遷是“禁阻”的。

改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋—軌道耦合進行。輻射能量傳遞過程

熒光發(fā)射：當(dāng)分子處于第一激發(fā)單重態(tài)S1的最低能級時，分子返回基態(tài)的過程比振動弛豫和內(nèi)轉(zhuǎn)化過程慢得多。分子可能通過發(fā)射光子躍遷回到基態(tài)S0的各振動能級上，這個過程稱為熒光發(fā)射。電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)（多為S1→S0躍遷），發(fā)射波長為

’2的熒光；10-7～10-9s。

由圖可見，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長；’2>

2>

1

；磷光發(fā)射：激發(fā)態(tài)分子經(jīng)過系間跨躍達到激發(fā)三重態(tài)后，并經(jīng)過迅速的振動弛豫達到第一激發(fā)三重態(tài)(T1)的最低振動能級上，從T1態(tài)分子經(jīng)發(fā)射光子返回基態(tài)。此過程稱為磷光發(fā)射。磷光發(fā)射是不同多重態(tài)之間的躍遷(即T1→S0)，故屬于“禁阻”躍遷。因此磷光的壽命比熒光要長很多，約為10-3到10s。所以，將激發(fā)光從磷光樣品移走后，還?？梢杂^察到發(fā)光現(xiàn)象，而熒光發(fā)射卻觀察不到該現(xiàn)象。一.分子熒光與磷光的產(chǎn)生1.單重態(tài)與三重態(tài)2.分子的活化與去活化3.分子發(fā)光的類型按激發(fā)的模式分類：按分子激發(fā)態(tài)的類型分類：光致發(fā)光化學(xué)發(fā)光/生物發(fā)光熱致發(fā)光場致發(fā)光摩擦發(fā)光

分子發(fā)光分子發(fā)光熒光磷光瞬時熒光遲滯熒光按光子能量分類：斯托克斯熒光(Stokes)：λex<λem反斯托克斯熒光(Antistokes)：λex>λem共振熒光(Resonance)：λex=λem熒光

分子的活化與去活化S0S1T1S2紫外可見吸收光譜外轉(zhuǎn)移紫外可見共振熒光光譜內(nèi)轉(zhuǎn)移熒光系間竄躍磷光反系間竄躍遲滯熒光振動弛豫２.無輻射躍遷的類型振動弛豫:Vr10-12sec外轉(zhuǎn)移:無輻射躍遷回到基態(tài)內(nèi)轉(zhuǎn)移:S2~S1能級之間有重疊系間竄躍:

S2~T1能級之間有重疊反系間竄躍:由外部獲取能量后T1~

S2１.輻射躍遷的類型共振熒光：10-12sec熒光：10-8sec磷光：1~10-4sec遲滯熒光:102~10-4sec二.分子熒光(磷光)光譜1.熒光(磷光)激發(fā)光譜與發(fā)射光譜熒光(磷光)均為光致發(fā)光，在光輻射的作用下，熒光物質(zhì)發(fā)射出不同波長的熒光。任何熒光分子都具有兩種特征的光譜，即激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。熒光(磷光)：光致發(fā)光，照射光波長如何選擇？A.熒光激發(fā)光譜固定

em=620nm(MAX)

ex=290nm(MAX)固定發(fā)射波長掃描激發(fā)波長熒光激發(fā)光譜與紫外-可見吸收光譜類似

固定測量波長(選最大發(fā)射波長),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強度與照射光波長的關(guān)系曲線。B.發(fā)射光譜(熒光光譜)固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強度)與發(fā)射光波長關(guān)系曲線。D.磷光光譜與發(fā)射光譜相同條件下的磷光光譜激發(fā)光譜發(fā)射光譜200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜三、熒光光譜的特征—激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系1、Stokes位移在溶液中，分子的熒光發(fā)射波長總是比其相應(yīng)的吸收(或激發(fā))光譜的波長長，熒光發(fā)射這種波長位移的現(xiàn)象稱為Stokes位移。處于激發(fā)態(tài)的分子一方面由于振動弛豫等損失了部分能量，另一方面溶劑分子的弛豫作用使其能量進一步損失，因而產(chǎn)生了發(fā)射光譜波長的位移，這種位移表明在熒光激發(fā)和發(fā)射之間所產(chǎn)生的能量損失。2.鏡像對稱規(guī)則

ex=290nm(MAX)固定

em=620nm(MAX)固定

ex=290nm(MAX)

em=620nm(MAX)S04321S143211→

41→

31→

21→11

→41

→41

→21

→1通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關(guān)系。鏡像規(guī)則的解釋大多數(shù)吸收光譜的形狀表明了分子的第一激發(fā)態(tài)的振動能級結(jié)構(gòu)，而熒光發(fā)射光譜則表明了分子基態(tài)的振動能級結(jié)構(gòu)一般情況下，分子的基態(tài)和第一激發(fā)單重態(tài)的振動能級結(jié)構(gòu)相似，因此吸收光譜的形狀與熒光發(fā)生光譜的形狀呈鏡像對稱關(guān)系。3、熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)一般地，用不同波長的激發(fā)光激發(fā)熒光分子，可以觀察到形狀相同的熒光發(fā)射光譜。熒光分子無論被激發(fā)到哪一個激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的分子經(jīng)振動弛豫及內(nèi)轉(zhuǎn)換等過程最終回到第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級。而分子的熒光發(fā)射總是從第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級躍遷到基態(tài)的各振動能級上，所以熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)。S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫分子吸收和發(fā)射過程的Jablonski能級圖2.三維熒光光譜IF

∝f(λex、λem)蒽的激發(fā)光譜固定發(fā)射波長、掃描激發(fā)波長IF

∝f(λex、λem)蒽的發(fā)射光譜固定激發(fā)波長、掃描發(fā)射波長蒽的三維等高線光譜圖蒽的三維等熒光強度光譜VB1和VB2的三維熒光光譜RLSDSTSATSADS散射片三維共振光散射光譜3.三維共振光散射光譜ADSATSTSRLSDS散射片三維共振光散射等高線光譜圖共振光散射瑞利散射固定

ex=270nm拉曼光二級共振光散射三級共振光散射熒光光譜有用區(qū)間三.分子熒光(磷光)強度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系1.熒光強度(磷光)與濃度的關(guān)系光吸收定律（Lambert–BeerLaw）相應(yīng)的吸光分數(shù)為：熒光強度（IF）與相應(yīng)的吸光分數(shù)成正比：按照級數(shù)展開式：對于稀溶液，當(dāng)bc<0.05（磷光bc<0.01）時：IF----熒光強度

F-----熒光量子產(chǎn)率k--與儀器靈敏度有關(guān)的參數(shù)I0--入射光強度。IP----磷光強度

P-----磷光量子產(chǎn)率b--吸收光程

--摩爾吸光系數(shù)C--熒光物質(zhì)濃度2.熒光(磷光)的平均壽命分子在激發(fā)態(tài)的平均時間或者說處于激發(fā)態(tài)的分子數(shù)目衰減到原來的1/2所經(jīng)歷的時間。對于處于S1(T1)電子態(tài)的熒光體來說，其平均壽命()可以左式表示：

3.熒光(磷光)的量子產(chǎn)率熒光量子產(chǎn)率的定義：kF、kp主要取決與熒光物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)；

st系間竄躍效率。

ki主要取決化學(xué)環(huán)境，同時也與熒光物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。大多數(shù)的熒光物質(zhì)的量子產(chǎn)率在0.1~1之間；例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，

F=0.55；

熒光素

F=1化合物

F0.110.290.460.600.521.躍遷的類型二.熒光與有機化合物的結(jié)構(gòu)對于有機熒光物質(zhì):π*

→πn→π*εmax＜100平均壽命10-5~10-7secπ→π*

εmax≥104平均壽命10-7~10-9seckS→T小π*→nπ*→π是有機化合物產(chǎn)生熒光的主要躍遷類型。強熒光的有機化合物具備下特征:①具有大的共軛π鍵結(jié)構(gòu)；②具有剛性的平面結(jié)構(gòu)；③具有最低的單重電子激發(fā)態(tài)為S1為π*

→π型；④取代基團為給電子取代基?！?.2分子熒光與磷光強度的影響因素一.熒光的量子產(chǎn)率——分子結(jié)構(gòu)和發(fā)光分子所處的環(huán)境2.共軛效應(yīng)產(chǎn)生熒光的有機物質(zhì)，都含有共軛雙鍵體系，共軛體系越大，離域大π鍵的電子越容易激發(fā)，熒光與磷光越容易產(chǎn)生?；衔锉捷凛於∈∥焓ˇ薳xmax(nm)205286365390580λemmax

(nm)278321400480640

F0.110.290.460.600.52熒光物質(zhì)的剛性和平面性增加，有利于熒光發(fā)射。3.剛性平面結(jié)構(gòu)芴聯(lián)苯

F=1

F=0.2不產(chǎn)生熒光產(chǎn)生熒光產(chǎn)生熒光不產(chǎn)生熒光

F=0.92萘VA

F(萘)=5

F(VA)

熒光黃酚酞偶氮菲偶氮苯1）給電子取代劑加強熒光4.取代基效應(yīng)—HN2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN產(chǎn)生p→π共軛二苯甲酮：弱熒光、強磷光S1→T1的系間竄躍產(chǎn)率接近1化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚λemmax(nm)278~310285~365310~405280~390285~345相對熒光強度10182020202）得電子取代基減弱熒光、加強磷光—C=0，—COOH，—NO2不產(chǎn)生p→π共軛硝基苯：不產(chǎn)生熒光、弱磷光空間位阻對熒光發(fā)射的影響3）取代基的位置反式二苯乙烯強熒光物質(zhì)

F=0.75

F=0.03立體異構(gòu)體對熒光發(fā)射的影響順式二苯乙烯非熒光物質(zhì)電離效應(yīng)對熒光發(fā)射的影響OH-H+OH-H+pH=1,有熒光pH=13,無熒光無熒光有熒光含有重原子的溶劑，由于重原子效應(yīng)熒光減弱、磷光增強。5.重原子取代基效應(yīng)—Cl，—Br，—IS1→T1的系間竄躍由于重原子的存在增強化合物萘1-甲基萘1-氟萘1-氯萘1-溴萘1-碘萘λFmax(nm)315318316319320~λPmax(nm)470476473483484488

P/

F0.0930.0530.0685.26.4>1000τ

p(s)2.62.51.40.230.0140.00236.溶劑效應(yīng)藍移:△

En→π*

＜△

En→π*紅移:△

Eπ→π*

＞△

Eπ→π*在極性溶劑中：無溶劑化作用有溶劑化作用三.金屬螯合物的熒光1.螯合物中配位體的發(fā)光2.螯合物中金屬離子的發(fā)光8-羥基喹啉弱熒光8-羥基喹啉-Zn螯合物黃綠色強熒光2,2`-二羥基偶氮苯無熒光2,2`-二羥基偶氮苯-Al螯合物強熒光T1系間竄躍S0S1d*、f*d*→

df*→

f熒光分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移三、影響熒光強度的環(huán)境因素1.溶劑的影響

除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化；2.溫度的影響熒光強度對溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加。3.溶液pH

對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制；4.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀；5.溶液熒光的猝滅熒光熄滅：熒光分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強度降低或消失的現(xiàn)象。熒光熄滅劑：這些溶劑分子或其它溶質(zhì)分子稱為熒光熄滅劑。1.碰撞熄滅相對速率1K1[M*]K2[M*][Q]與分子的直徑、粘度、溫度等因素有關(guān)。2.能量轉(zhuǎn)移熄滅再吸收過程：共振能量轉(zhuǎn)移：分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移：hv激發(fā)發(fā)射熄滅3.氧的熄滅作用氧分子是熒光、磷光的熄滅劑，4.自熄滅與自吸收當(dāng)熒光物質(zhì)的濃度大于1g/L時，常發(fā)生熒光的自熄滅(濃度熄滅)自吸收：沒有除氧，溶液中難以觀察到磷光由于

F<1，使熒光強度減弱或消失.形成二聚體：由于二聚體不發(fā)熒光，或發(fā)射熒光的能量有改變，造成自熄滅現(xiàn)象?！?.3熒光(磷光)分光光度計一.主要組成及部件的功能熒光分光光度計工作原理基及儀器結(jié)構(gòu)框圖光源氙燈激發(fā)單色器樣品池光電倍增管數(shù)據(jù)處理儀器控制光源樣品池激發(fā)單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器發(fā)射單色器問題：熒光分光光度計與紫外-可見分光光度計有何異同點？二.光源1.光源的要求：發(fā)射強度足夠且穩(wěn)定的連續(xù)光譜光輻射強度隨波長的變化小有足夠長的使用壽命2.氙燈光源常用氣體放電燈類型：

氙燈光源高壓汞光源波長范圍：200~1000nm工作壓力：5~20atm啟動電壓：20~40KV使用壽命：1000~2000h最廣泛應(yīng)用的連續(xù)光源：發(fā)射波長范圍寬發(fā)射光強度大3.高壓汞燈光源應(yīng)用廣泛的線光源：253.7296.5302.2312.6313.2365.0365.5366.3404.7435.8546.1557.0579.0(nm)光源樣品池激發(fā)濾光片檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器光源樣品池激發(fā)濾光片檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射濾光片玻璃濾光片的透射率干涉濾光片的透射率截止涉濾光片的透射率三.單色器平面衍射光柵線色散率聚光本領(lǐng)分辨率四.檢測器光電倍增管放大倍數(shù)：2n~5n;n=10,103~107，最大108~109五.樣品池：液池、熒光池1.樣品池的材料：與紫外-可見分光光度計的吸收池一樣2.吸收池的形狀：紫外-可見分光光度計的吸收池兩面透光熒光分光光度計的樣品池四面透光波長范圍3.使用注意事項容易破碎問題：紫外-可見分光光度計的吸收池與熒光分光光度計的樣品池有什么區(qū)別？沾污問題閃躍特性六.磷光分光光度計1.光學(xué)系統(tǒng)與熒光分光光度計的區(qū)別光源樣品池激發(fā)單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器切光器（斬波器）共振熒光：10-12sec熒光：10-8sec磷光：1~10-4sec遲滯熒光：100~10-4sec2.樣品池與熒光分光光度計的區(qū)別通常情況下，樣品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶內(nèi)，來測定低溫磷光。§7.４熒光分析法的應(yīng)用一.工作曲線法熒光分析的靈敏度比紫外－可見分光光度法高103～104.熒光熄滅工作曲線法FxFCsCx直接熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線法FCsFxCx二.熒光分析法的靈敏度在紫外光照射下會發(fā)生熒光的無機化合物很少，主要依賴于有機試劑形成的螯合物。三.熒光分析的應(yīng)用1.無機化合物直接熒光測定法其中，較常測定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd與某些稀土元素；測定的靈敏度有些可以達到1