環(huán)丙沙星對豬鏈球菌病的緩解作用

環(huán)丙沙星對豬鏈球菌病的緩解作用

氨基丙沙星是氨基丙烯酸酯活性最強的品種之一。這是控制全身感染的藥。以往的研究證明了這種抗高血壓藥物具有解決方案。0.1～100mg/ml的環(huán)丙沙星可降低人白細胞粘附性;其影響人中性多核細胞趨化性的程度屬中等且取決于受試者個體差異;小鼠腹腔注射該藥,5mg/(kg·d)給藥組遲發(fā)型皮膚超敏(DTH)無反應,而10mg/(kg·d)給藥組DTH反應被顯著抑制,皮下注射,并不影響小鼠DTH反應;5～20μg/ml的環(huán)丙沙星能增強體外淋巴細胞增殖,達20μg/ml時,則對有絲分裂原刺激淋巴細胞分裂的S期和G2/M期有顯著抑制作用;小鼠皮下注射環(huán)丙沙星,用SRBC免疫時,特異性抗體增加,但Forxgern等、Sato等卻認為該藥抑制免疫球蛋白的產(chǎn)生,不過,當小鼠連續(xù)3d按10mg/(kg·d)腹腔注射該藥,最后一次給藥后,接種SRBC免疫,溶血IgG形成細胞受到抑制,IgM形成細胞不變,連續(xù)7d給藥,抗體形成細胞不再發(fā)生變化,若先用SRBC免疫后24h,再連續(xù)腹腔給藥3d,IgM形成細胞顯著增加,IgG則受到抑制?？傊?由于方法和條件不同,對環(huán)丙沙星免疫調(diào)節(jié)作用研究常得到一些不同結(jié)論;且大多數(shù)研究建立在小鼠模型上和體外研究,與獸醫(yī)臨床相比,尚有差距。因此研究該藥臨床用藥狀況下的免疫調(diào)節(jié)作用,有著更實際的意義。鏈球菌病是常見的熱性傳染病,鏈球菌的某些毒力因子對影響宿主吞噬細胞功能、DTH反應、體外淋巴細胞增殖、免疫球蛋白的產(chǎn)生、補體活性的影響已有報道。這些研究主要立足于人鏈球菌病及體外試驗,對抗生素治療鏈球菌病免疫學研究報道尚少見諸文獻。本研究旨在檢測環(huán)丙沙星治療鏈球菌病時對機體免疫反應的調(diào)節(jié)作用,以探討藥物、機體與病原間的關系。1材料和方法1.1材料表面1.1.1動物分組及免疫7周齡長大雜交豬24頭,體重(25.5±1.4)kg,公母各半,均去勢,購于華中農(nóng)業(yè)大學試驗種豬場。隨機均分為空白組、陰性組、陽性組和試驗組。供試前,按生產(chǎn)要求進行飼養(yǎng),且免疫接種豬瘟、仔豬副傷寒、豬丹毒、豬肺疫等疫苗,不接種鏈球菌疫苗,無鏈球菌病史,確保動物沒接觸過喹諾酮類藥物。臨試前,在試驗條件下觀察1周,臨床健康,觀察和試驗期間,飼喂不含任何抗菌藥物全價中豬料,圈養(yǎng),自由飲水。1.1.2藥物、藥物及試劑供試菌種C55126系馬腺疫鏈球菌獸疫亞種,購于中國獸藥監(jiān)察所。使用前經(jīng)普通肉湯培養(yǎng),小白鼠傳5代,分離培養(yǎng),擴大培養(yǎng),最后用無菌生理鹽水稀釋成150億個菌/ml。1.1.3乳酸環(huán)丙沙星注射液組環(huán)丙沙星,批號990312,中國浙江京新制藥廠產(chǎn)品,配成2.5%(W/V)乳酸環(huán)丙沙星注射劑(pH4.5～5.5)。按藥典要求過濾、分裝、滅菌、去熱原。1.1.4完全rpmi170培養(yǎng)基硝基藍四氮唑(NBT)(前進試劑廠生產(chǎn));噻唑藍(MTT)(Fluka生產(chǎn));豬標準IgG(Sigma生產(chǎn));植物血凝素(PHA)(上海伊華臨床醫(yī)學科技公司生產(chǎn));RPMI1640(GIBCO生產(chǎn)),臨用前在RPMI1640培養(yǎng)液中,加入10%滅活小牛血清、50μmol/L2-巰基乙醇,20～25mmol/L的Hepes、100μg/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素,即為完全RPMI1640培養(yǎng)基;淋巴細胞分離液(上海試劑工廠生產(chǎn))。1.2方法1.2.1共感染試驗組和陰性組每頭豬按每公斤體重4.5億個菌于腹部皮下接種,復制豬鏈球菌病亞急性模型?？瞻捉M和陽性組用無菌生理鹽水接種。1.2.2給藥傷口試驗組和陽性組接種后第7天起豬由耳靜脈5mg/kgbw注藥,2次/d,連續(xù)8d;陰性組和空白組,推注無菌生理鹽水。1.2.3血清學檢測接種第0、7、14、21、28天,前腔靜脈無菌采2份血,其一用肝素抗凝,用于血細胞計數(shù)、分離淋巴細胞及嗜中性白細胞,另一份不抗凝,用于分離血清供IgG濃度和補體總活性的測定。1.2.4白細胞計數(shù)和分類計數(shù)顯微鏡計數(shù)法計數(shù)白細胞總數(shù),姬姆薩染色法作白細胞分類計數(shù)按文獻進行。1.2.5還原nbt的能力按文獻分離嗜中性白細胞,調(diào)整為每毫升3.5×107個細胞,按文獻檢測其還原NBT的能力,以還原產(chǎn)物溶于二甲亞砜后在540nm處的光密度OD540代表。1.2.6細胞轉(zhuǎn)化能力測定按文獻分離淋巴細胞,用完全RPMI1640調(diào)整為每毫升3.5×106個細胞,按文獻在96孔培養(yǎng)板上,設PHA刺激孔和對照孔,進行淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗。以PHA刺激指數(shù)(SI)代表淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力。其中,SI=PHA刺激孔OD570nm均值/對照孔OD570nm均值。1.2.7dh反應臨試第0、7、14、21、28天,按文獻進行PHA皮膚試驗,以紅斑長、短徑均值代表DTH反應。1.2.8血清中igg含量的測定按文獻進行。1.2.9血清中補體總活性的測定按50%溶血試驗計算出每毫升未稀釋的血清中所含的50%溶血劑量數(shù)(CH50),即補體總活性。1.2.1感染兩因素交互效應用SAS軟件檢測注射環(huán)丙沙星和鏈球菌感染兩因素交互效應顯著性,用t檢驗比較試驗組、陰性組、陽性組與空白組之間的差異,及試驗組與陰性組之間的差異。2結(jié)果與分析2.12.2對免疫組化的影響接種后第14、21天,陰性組嗜中性白細胞百分含量極顯著低于空白組(P<0.01);試驗組接種后第21、28天,顯著低于空白組(P<0.05),且極顯著低于陰性組(P<0.01),第21天,兩因素交互作用顯著(P<0.05)。淋巴細胞百分含量則相反,陰性組接種后第14、21天極顯著高于空白組(P<0.01);試驗組接種后第21天極顯著高于空白組(P<0.01),第28天顯著高于空白組(P<0.05),且均顯著高于陰性組(P<0.05);第21天兩因素交互作用顯著(P<0.05)。2.32.42.52.62.73開皮爾斯克氏體對抗體作用的影響成功復制出典型的豬鏈球菌病亞急性模型是本研究的前提。與文獻相比,本研究動物感染后體溫升高的程度稍低,可能是菌株和動物不同所致,其它如臨床癥狀、血液學變化、病理特征、病原檢查(結(jié)果未全顯示)與文獻一致。試驗組和陰性組白細胞總數(shù)升高,與文獻一致。試驗組接種后第21天,白細胞總數(shù)回落,第28天,藥物作用和兩因素交互作用才表現(xiàn)出來,且陽性組白細胞總數(shù)沒有變化,說明試驗組白細胞變化主要是鏈球菌作用導致,環(huán)丙沙星本身對機體白細胞總數(shù)不影響,而是通過給藥后,機體本身損傷得以恢復后,使試驗組白細胞數(shù)在第21、28天回落,與Jimenez-valera等報道的環(huán)丙沙星能降低外周血中白細胞數(shù)不一致,可能是試驗對象和給藥途徑不同所致。試驗組,因環(huán)丙沙星治療作用以及環(huán)丙沙星促進淋巴細胞增殖使其于接種后第21天,淋巴細胞百分含量升高,嗜中性白細胞百分含量相對較低。鏈球菌感染和環(huán)丙沙星均使嗜中性白細胞吞噬功能增強,即還原NBT能力增強。因細菌感染,嗜中性白細胞吞噬功能增強,己糖旁路途徑糖代謝增強,葡萄糖酵解中間產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖在這個途徑氧化脫氫加強,所脫的氫被細胞吞噬的NBT染料接受,從而還原NBT的能力增強;環(huán)丙沙星加強己糖旁路途徑糖代謝已為文獻證實。感染后,鏈球菌產(chǎn)生某些毒力因子使淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力下降,但環(huán)丙沙星具有促進淋巴細胞DNA復制的能力,因此,陽性組在第14、28天淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力增強,試驗組第28天在環(huán)丙沙星作用下,鏈球菌毒力因子的產(chǎn)生和作用降低,環(huán)丙沙星促進淋巴細胞DNA復制的能力得以表現(xiàn),故淋巴細胞轉(zhuǎn)化增強。陰性組于接種第21天,DTH降低,可能與鏈球菌膜蛋白和溶血素有關,因這兩者均能抑制白細胞移行,而白細胞移行抑制試驗是體外檢測DTH的試驗;陽性組接種后第14天,事實這一天還在用藥,在藥物刺激下,淋巴細胞增殖大大加強,此時藥物促進淋巴細胞增殖作用比抑制其生長更強,所以DTH反應比較強,但因環(huán)丙沙星在促進細胞DNA復制的同時,還能導致細胞DNA鏈斷裂,且在低濃度時,這種作用更為敏感,所以在第21、28天DTH反應降低;在試驗組,環(huán)丙沙星殺滅鏈球菌,阻止其釋放毒力因子的同時,自身也喪失了生物活性,因此,淋巴細胞在受到藥物刺激后,增殖能力增強,因體內(nèi)細菌及其毒力因子少,環(huán)丙沙星本身也不使其DNA斷裂,所以有活力的淋巴細胞數(shù)增多,DTH反應增強,即在第21天極顯著增高。鏈球菌侵襲機體,機體產(chǎn)生相應抗體,最初主要是IgM,因此,陰性組和試驗組接種后第7天,IgG含量低,但第2周時達到抗體高峰,此時為IgG,所以陰性組第14天IgG含量極顯著升高。陽性組于第14、21天,IgG水平低,試驗組于第14天,IgG也很低,且低于陰性組,這與環(huán)丙沙星對IgG的合成具有抑制作用的報道一致。鏈球菌感染,體內(nèi)產(chǎn)生抗原抗體復合物,可固定補體,使陰性組和試驗組接種后第7天,補體活性下降,當然,也可能是鏈球菌莢膜抑制了補體激活途徑所致。陽性組接種后第14天,因環(huán)丙沙星作用血清中IgG水平較低,而補體活化需要IgG參與,因此此時陽性組補體活性極顯著降低;試驗組IgG水平相對較高,補體活性與空白組無差異;第21天,雖然陽性組IgG仍然很低,但因環(huán)丙沙星使淋巴細胞DNA斷裂形成DNA片段,而雙鏈DNA片段是補體經(jīng)典途徑激活劑,故此時陽性組補體活性顯著升高;正因如此,試驗組第28天顯著高于陰性組?？傊?環(huán)丙沙星在作用于病原的同時,也增強機體的細胞免疫功能和補體總活性,卻對IgG合成有抑制作用。從而進一步揭示了鏈球菌、機體和環(huán)丙沙星三者之間的關系提供試驗依據(jù),并為制訂環(huán)丙沙星的用藥方案提供參考。陰性組和試驗組豬出現(xiàn)了典型亞急性鏈球菌病癥狀。接種后1d,體溫平均升高1℃,3d后,體溫升高一直維持在0.5℃左右,發(fā)病動物精神萎糜,食欲不振,接種后第5天,大多數(shù)豬大便偏干,個別嚴重便秘或后期嚴重腹瀉,咳嗽,喘息,有膿性或漿液性分泌物,角膜潮紅,后期個別豬眼角有膿性分泌物,病豬關節(jié)腫脹、跛行,甚至站立不穩(wěn),后肢拖地。病原檢查為鏈球菌。試驗組給藥后好轉(zhuǎn),陰性組于接種后第28天1頭豬死亡。陽性組和空白組臨床表現(xiàn)健康。接種后,陰性組白細胞總數(shù)于第7天顯著高于空白組(P<0.05),其后極顯著升高(P<0.01),試驗組豬于接種后第7、14天,白細胞總數(shù)顯著高于空白組(P<0.01),第21天恢復正常(P>0.05),雖然第28天仍高于空白組(P<0.01),但顯著低于陰性組(P<0.05),此時,給藥和感染兩因素的交互作用顯著(P<0.05)。陽性組的白細胞數(shù)與空白組無顯著差異(P>0.05)。感染和給藥兩因素均使嗜中性白細胞還原NBT的能力增強(表1),接種后第14、21、28天兩因素交互作用極顯著(P<0.01)。鏈球菌感染導致淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力降低,注射環(huán)丙沙星卻增強淋巴細胞轉(zhuǎn)化(表2),陽性組第21天PHA刺激的SI極顯著增加(P<0.01),試驗組的SI第28天卻恢復正常(P>0.05),接種后第14天兩因素的交互作