膠原模擬多肽三螺旋結(jié)構(gòu)的研究

膠原模擬多肽三螺旋結(jié)構(gòu)的研究

特定序列設(shè)計天然膠的原因具有良好的生物適應(yīng)性和可分解性，因此在生物材料領(lǐng)域進行了廣泛的研究和應(yīng)用，如組織結(jié)構(gòu)、可吸收調(diào)整等。膠原具有獨特的三螺旋結(jié)構(gòu),這與膠原的穩(wěn)定性及與細胞識別等多種生物學(xué)活性密切相關(guān)。但膠原結(jié)構(gòu)復(fù)雜、功能域眾多、分子量大且較難制成溶液,這一定程度上限制了對膠原的進一步研究。膠原模擬多肽(collagenmimeticpeptide,CMP)是指一類依據(jù)膠原一級結(jié)構(gòu)的特定序列設(shè)計,可模擬天然膠原部分特征結(jié)構(gòu)、生物學(xué)活性的多肽,也可作為一種分子模型,用于研究膠原特征結(jié)構(gòu)及膠原特定序列的功能。研究較多的一類是Pro-Hyp-Gly(POG)重復(fù)片段,這類多肽可形成類似天然膠原的三螺旋結(jié)構(gòu),另一類是膠原與整合素的作用片段Gly-PheHyp-Gly-Glu-Arg(GFOGER),相關(guān)研究顯示整合素能夠識別膠原肽鏈的某一片段,但這種識別作用依賴于膠原三螺旋構(gòu)象的存在。圓二色譜(circulardichroism,CD)是用于測定具有手性結(jié)構(gòu)、能產(chǎn)生左右旋光差異性吸收的化合物結(jié)構(gòu),主要用于測定分子結(jié)構(gòu)不對稱性的光譜學(xué)方法。一般生物大分子中均含有手性的基團和結(jié)構(gòu),因而CD常用來測量和觀察生物大分子的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的變化。膠原和CMP三螺旋結(jié)構(gòu)的CD特征一般是在225nm附近有一個正吸收峰,在197nm附近有一個負吸收峰,吸收峰的位置隨著氨基酸序列和長度的變化會發(fā)生偏移。因此,CD譜可用來研究膠原和CMP三螺旋結(jié)構(gòu)及其熱變性過程。根據(jù)膠原特征重復(fù)序列(POG)n及膠原上α2β1整合素識別位點GFOGER設(shè)計不同序列或長度的CMP,通過CD譜研究其三螺旋結(jié)構(gòu)、熱穩(wěn)定性等隨序列或長度的改變所發(fā)生的規(guī)律性變化,為進一步研究膠原與CMP分子特征性的三螺旋結(jié)構(gòu)形成規(guī)律及其用作生物材料奠定基礎(chǔ)。1實驗部分1.1多肽的合成及hplc擴增圓二色譜儀:J-815(日本JASCO公司)。膠原模擬多肽長度與序列見表1,其中GFOGER為Ⅰ型膠原的整合素識別序列(bindingsequence,BS)。所有多肽均為作者設(shè)計,上海吉爾公司代為合成,HPLC檢測純度>90%。所有水溶液均用MilliQ-biocel系統(tǒng)過濾后配制。1.2cmp的初始穩(wěn)定性配制0.3mg·mL-1的五種CMP水溶液,于4℃靜置平衡48h;分別將其注入厚度為1mm的石英樣品池,用圓二色譜儀常溫下進行樣品的CD測試。各參數(shù)設(shè)置如下:掃描波長范圍190～260nm,帶寬1nm,分辨率0.1nm,掃描速度100nm·min-1,累計掃描3次。將CD值換算成氨基酸殘基平均摩爾橢圓度(meanresidueellipticity,MRE,[θ])來表示CMP的圓二光譜吸收值。其中,θ為橢圓率(mdeg),1為石英池厚度(mm),c為CMP溶液濃度(mg·mL-1),M為CMP分子摩爾質(zhì)量(g·mol-1),nr為CMP中氨基酸個數(shù)。1.3變性溫度測試配制0.3mg·mL-1的五種CMP水溶液,于4℃靜置平衡48h;分別將其注入厚度為1mm的石英樣品池,用CD儀進行變溫掃描。溫度范圍10～70℃,升溫速度20℃·h-1,每5℃掃描一次共測試13個溫度點,掃描波長范圍190～260nm,掃描前每個溫度點平衡15min,其他參數(shù)參考室溫CD測試。由CD值計算[θ]值,并根據(jù)λ=225nm處的[θ]值作圖,可確定CMP的變性溫度(Tm)。五種CMP溶液測試完變性圖譜后,在70℃平衡30min使其充分變性。參照升溫過程的CD測試方法,進行降溫復(fù)性測試。同樣計算λ=225nm處的[θ]值作圖,得復(fù)性圓二色譜圖。2結(jié)果與討論2.1最大吸收峰的確定五種CMP溶液室溫CD譜圖及相關(guān)信息如圖1、表2所示。每種CMP在波長190～260nm范圍內(nèi)均有正負吸收峰,最大正、負吸收峰(MRE極值點)分別處在222～225nm和197～200nm范圍內(nèi),吸收值與X軸的交叉點(MRE≈0處)均在在218nm附近。表明設(shè)計合成的五種CMP室溫下均可自組裝形成有類似于膠原的特征性三螺旋結(jié)構(gòu)。2.2溫度突變時cmp的熱變性CMP的熱穩(wěn)定性一般用解鏈溫度TM來衡量。Tm值越大,三螺旋結(jié)構(gòu)越難解旋成α單鏈,說明CMP的熱穩(wěn)定性越好;相反,Tm仇越小,三螺旋結(jié)構(gòu)越易解旋為α單鏈,則CMP熱穩(wěn)定性越差。Tm值一般可由CD熱變性曲線突變區(qū)間計算獲得,其值與樣品濃度和加熱時間有關(guān),所以在相同條件下測試比較才有意義,但許多研究者往往忽略了濃度的影響,本實驗每個樣品的濃度和實驗條件均一致。圖2為五種不同CMP圓二色譜曲線隨溫度升高的變化趨勢圖(10～70℃,每隔5℃作一條曲線)?？梢钥闯?隨著溫度的升高其正、負吸收峰均逐漸變小,正負吸收峰絕對值之差逐漸變小,且每種CMP在特定的溫度附近都有一個吸收峰仇的突變。圖3為五種CMP在λ=225nm處的熱變性、復(fù)性曲線圖,由圖3(a)可以看出:隨溫度的升高CMP的圓二色吸收值逐漸減小,在特定溫度范圍內(nèi)有明顯一個的突變,之后吸收值變化趨于平穩(wěn)。由溫度突變區(qū)間可計算得每種CMP的解鏈溫度Tm(見表1),在微觀上,溫度到達Tm值之前,CMP一直以三螺旋結(jié)構(gòu)形式存在,所以吸收值在此溫度范圍內(nèi)基本保持不變。當溫度快到達Tm值時,三螺旋的α單鏈間開始解旋,吸收值迅速變小。當溫度溫度大于Tm值之后,CMP徹底解旋,α鏈以無序卷曲單體的形式存在存在。其吸收值變化趨于平穩(wěn)。從表1中三種CMP的Tm可看出隨特征序列(POG)個數(shù)的增加解鏈溫度明顯升高。含識別序列的(CMP30-BS解鏈溫度遠低于只由重復(fù)序列組成的CMP30,可見其同一個分子內(nèi)的三條α鏈間結(jié)合力較弱,這是因其中間的GFOGER序列不能參與三螺旋結(jié)構(gòu)的形成所致,使得CMP30-BS的α鏈不同于CMP30等只含特征序列(POG)的α鏈,所氨基酸都參與螺旋結(jié)構(gòu)的形成。由復(fù)性CD圖3(b)可見,其降溫過程中吸收值逐漸增加,CMP又由無規(guī)則的卷曲單體逐漸結(jié)合重新形成三螺旋結(jié)構(gòu),但無明顯溫度突變過程,這可能與其動力學(xué)過程相關(guān)。由之前實驗可知:當T處于室溫或是Tm值以下時,CMP均以三螺旋結(jié)構(gòu)形式存在,T>Tm時CMP解聚為無規(guī)則的卷曲單體(即變性),當溫度再次降到Tm以下時CMP恢復(fù)其三螺旋結(jié)構(gòu)(即復(fù)性),所以CMP的熱變性過程是可逆的。這與天然膠原加熱變性后三螺旋結(jié)構(gòu)被徹底破壞的不可逆過程是不同的。膠原圓二色譜圖中的正負吸收峰強度比的絕對值(theratioofpositivetonegative,RPN),一般用來表示膠原溶液中三螺旋結(jié)構(gòu)的螺旋程度,認為RPN值可以值可以反映CMP三條α鏈間螺旋程度的高低。圖4為CMP的RPN值隨溫度變化曲線,隨溫度升高CMP的RPN值變化趨勢與其吸收值相同,RPN值變化曲線上也有一個與吸收值的突變區(qū)間基本一致的溫度突變區(qū)間。說明CMP溶液中α鏈間的螺旋程度在Tm值前基本保持穩(wěn)定,到達Tm值時螺旋程度急劇下降;形成螺旋結(jié)構(gòu)的α鏈間逐漸解體開始變?yōu)闊o規(guī)則的卷曲單體,當T>Tm之后RPN值基本不再發(fā)生改變,說明螺旋程度不再變化,α鏈以單體形式存在。這與CD熱變性曲線的趨勢一致。2.3復(fù)性過程的mre值比選前面提到,變性過程和復(fù)性過程是不同的,將一種CMP的變性與復(fù)性曲線圖對比線圖對比可見明顯的“磁滯”現(xiàn)象。有文獻中指出這是由于復(fù)性過程中產(chǎn)生了不穩(wěn)定的中間體或是由無數(shù)平衡常數(shù)有少許差異的微復(fù)性過程組成,從而導(dǎo)致相同溫度下復(fù)性過程的MRE值要小于變性過程。就實驗結(jié)果觀察我們認為此現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是:變性之前CMP是經(jīng)過很長時間(>24h)的平衡過程,溶液體系達到了最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。即使平衡開始時不是最穩(wěn)定結(jié)合的α鏈也會慢慢全部轉(zhuǎn)化為最穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)存在?？梢娮冃赃^程是體系中最穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)解旋變?yōu)闊o序卷曲單體的過程,此過程中MRE值較大。但是復(fù)性過程時間較短,α單鏈間相互形成的三螺旋結(jié)構(gòu)不是溶液體系中最穩(wěn)定的,而是能發(fā)生反應(yīng)的基團間快速的化學(xué)鍵形成過程。所以其螺旋程度不及相同溫度時的熱變性過程,MRE值也就偏低。這在CD曲線上就表現(xiàn)為“磁滯”現(xiàn)象(圖5)。我們的后續(xù)研究中將進一步探討此現(xiàn)象產(chǎn)生的機制。3不同溫度對三維螺旋結(jié)構(gòu)的影響通過圓二色譜研究了設(shè)計合成的五種CMP的三螺旋結(jié)構(gòu)及其熱穩(wěn)定性:室溫下,CMP在溶液中均以三螺旋結(jié)構(gòu)的形式存在;CMP三螺旋結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性(Tm值)隨著特征序列(POG)三聯(lián)體個數(shù)的增加而增強。天然膠原的熱變性過程是不可逆的,溫度高于其變性溫