度人教版多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段（29張）

DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片斷課題2一、知識(shí)回顧1.DNA的基本單位－①②③④⑤脫氧核苷酸（脫氧核糖核酸）五碳糖磷酸基團(tuán)羥基3，端5，端ATGCATGC5，端（含磷酸基團(tuán)）3，端（含羥基）3，端5，端2.脫氧核苷酸鏈的形成3.DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)⑴DNA分子是由

的脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤(pán)旋而成的規(guī)則

結(jié)構(gòu)。⑵

與

交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；

排列在鏈的內(nèi)側(cè)。⑶兩條鏈上的堿基通過(guò)

連結(jié)起來(lái)，形成堿基對(duì)。堿基對(duì)的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與

配對(duì)，

一定同胞嘧啶配對(duì)。雙螺旋兩條反向平行脫氧核糖磷酸堿基氫鍵胸腺嘧啶鳥(niǎo)嘌呤4.復(fù)制過(guò)程生物體內(nèi)DNA分子復(fù)制的條件參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶打開(kāi)DNA雙鏈DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板4種脫氧核苷酸合成子鏈的原料DNA聚合酶引物使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開(kāi)始連接脫氧核苷酸催化合成DNA子鏈DNA聚合酶的特性DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，而只能從3’端延伸DNA鏈。因此，DNA復(fù)制需要引物。小資料：引物是一小段DNA或RNA，它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)。用于PCR的引物長(zhǎng)度通常為20~30個(gè)核苷酸。DNA的復(fù)制方向3’5’5’3’因此，DNA的合成方向總是從子鏈的5，端向3，端延伸。4.復(fù)制過(guò)程（一）PCR技術(shù)的概念

是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝。（二）PCR技術(shù)的應(yīng)用

遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測(cè)定。三、基礎(chǔ)知識(shí)解旋酶（打開(kāi)DNA雙鏈）DNA母鏈（模板）4種脫氧核苷酸（合成子鏈原料）DNA聚合酶（催化子鏈合成）引物（RNA）（使DNA聚合酶能從引物3′端開(kāi)始連接脫氧核苷酸）自主閱讀P59，并思考：體外擴(kuò)增DNA，需要怎樣環(huán)境？變性（80-100℃

）Taq聚合酶（耐高溫）20—30個(gè)核苷酸構(gòu)成DNADNA母鏈4種脫氧核苷酸緩沖溶液，控制溫度體內(nèi)復(fù)制DNA體外擴(kuò)增DNA1.DNA

分子的熱變性原理DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃）復(fù)性（緩慢冷卻）變性的目的：復(fù)性的目的：解開(kāi)雙鏈有利于引物與兩條單鏈結(jié)合

在80~100℃的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開(kāi)，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為變性(三）PCR原理PCR技術(shù)總結(jié)利用DNA分子的熱變性原理，通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解旋與結(jié)合，從而完成體外DNA分子的擴(kuò)增。

四種脫氧核苷酸、耐熱的DNA聚合酶、引物、DNA模板、緩沖溶液和控制溫度的溫控設(shè)備。子鏈的5’端向3’端延伸

具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出。原理?xiàng)l件方向特點(diǎn)5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ變性95oC復(fù)性55oC延伸72oC5/3/3/5/（四）PCR的反應(yīng)過(guò)程5

引物15

引物2第二次復(fù)制第一次復(fù)制5

5

5

5

5

5

模板DNA5

5

5

5

5

5

5

5

經(jīng)n次循環(huán)（復(fù)制）后，DNA的含量理論上可以擴(kuò)大到

倍。2n每次循環(huán)分為：PCR的反應(yīng)過(guò)程總結(jié)變性——復(fù)性——延伸②DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。①?gòu)牡诙喲h(huán)開(kāi)始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸PCR的反應(yīng)結(jié)果模擬PCR擴(kuò)增DNA二、PCR反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作1、PCR儀（一）設(shè)備及用具2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次。能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器（二）PCR的操作步驟（1）按配方將所需試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上（準(zhǔn)備）（2）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（移液）（3）蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（混合）（4）將微量離心管放在離心機(jī)上離心約10s

（離心）（5）將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序（反應(yīng)）循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸第一次94°C,10min－－30次９4℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1min（一）理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算1.一條DNA，復(fù)制n次，DNA為

。2.a條DNA，復(fù)制n次，DNA為

。三、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)2nax2n（二）實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測(cè)定可以通過(guò)測(cè)量DNA含量來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)

具體方法如下：(1)稀釋?zhuān)喝?μLPCR反應(yīng)液，加入98μL蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋。(2)對(duì)照調(diào)零：以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。(3)測(cè)定：取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測(cè)定260nm處的光吸收值。(4)計(jì)算：檢測(cè)DNA片段的擴(kuò)增情況，可以通過(guò)計(jì)算DNA含量來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，計(jì)算公式為：DNA含量(μg/mL)＝50×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)。[特別提醒]

公式中的50代表在波長(zhǎng)260nm紫外波段照射下，吸收峰為1時(shí)，DNA含量為50μg/mL。練習(xí)鞏固1、關(guān)于PCR技術(shù)的應(yīng)用，錯(cuò)誤的一項(xiàng)是A古生物學(xué)、刑偵破案、DNA序列測(cè)定B診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學(xué)CDNA序列測(cè)定、基因克隆、刑偵破案D診斷遺傳疾病、合成核苷酸、DNA序列測(cè)定2、DNA的合成方向總是從子鏈的哪一端向哪一端延伸？3、PCR技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是A原理簡(jiǎn)單B原料易找CTaqDNA聚合酶有耐熱性D快速、高效、靈活、易于操作從子鏈的5’端向3’端延伸體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR的技術(shù)區(qū)別：體內(nèi)復(fù)制PCR技術(shù)解旋在解旋酶作用下，細(xì)胞提供ATP，部分解開(kāi)加熱到94oC,雙鏈全部解開(kāi)，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DNA片段DNA聚合酶細(xì)胞自身的DNA聚合酶（不耐高溫）TaqDNA聚合酶復(fù)制特點(diǎn)半保留復(fù)制，邊解旋邊復(fù)制，多起點(diǎn)復(fù)制。半保留復(fù)制，完全解旋后復(fù)制，從模板鏈的一端開(kāi)始復(fù)制。復(fù)制的方向子鏈的5’端向3’端延伸