第四章 基因工程

10/18/20231GEHBGULAM第四章

基因工程載體vectors10/18/20232GEHBGULAM10/18/20233GEHBGULAM在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進入受體細(xì)胞的DNA分子叫載體。1.載體

（Vectors）10/18/20234GEHBGULAM

（1）在宿主細(xì)胞內(nèi)能獨立復(fù)制。

（2）有選擇性標(biāo)記。（3）有一段多克隆位點。2.基因工程對載體

的要求外源DNA插入其中不影響載體的復(fù)制。（4）分子量小，拷貝數(shù)多。（5）容易從宿主細(xì)胞中分離純化。10/18/20235GEHBGULAM

基因工程中常用的載體(來源)有5類：

3.載體的種類質(zhì)粒（plasmid）單鏈DNA噬菌體M13

噬菌體的衍生物柯斯質(zhì)粒（cosmid）

動物病毒（virus）

10/18/20236GEHBGULAM功能克隆載體:

克隆一個基因或DNA片斷表達(dá)載體:

用于一個基因的蛋白表達(dá)整合載體:

把一個基因插入到染色體組中10/18/20237GEHBGULAM質(zhì)粒*受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例E.coli環(huán)狀〈8*pUC18/19,T-載體pGEM-3z等λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，Λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀〈10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli環(huán)狀100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母細(xì)胞線性染色體100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類細(xì)胞線性染色體〉1000kb病毒載體動物細(xì)胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動物細(xì)胞和細(xì)菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒載體的種類和特征10/18/20238GEHBGULAM第一節(jié)

質(zhì)粒載體

一、質(zhì)粒（plasmid）

是獨立于染色體以外的能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。存在于細(xì)菌、霉菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中。10/18/20239GEHBGULAM大腸桿菌的質(zhì)粒10/18/202310GEHBGULAM克隆的質(zhì)粒載體允許外源的DNA插入，儲存。主要是DNA水平上的操作?；虮磉_(dá)的質(zhì)粒載體允許外源DNA的插入、儲存和表達(dá)。10/18/202311GEHBGULAM（1）分子小1.質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性1—200kb（2）編碼基因少2—3個中等大小的蛋白質(zhì)。（3）環(huán)形狀雙鏈環(huán)狀DNA。（酵母的“殺傷質(zhì)?！笔荝NA）。如抗菌素抗性、代謝特征等，賦予細(xì)菌一些額外的特性（非必須）。10/18/202312GEHBGULAM（4）質(zhì)粒的空間構(gòu)型①共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA)呈超螺旋（SC）（supercoil）CovalentclosecircularDNA10/18/202313GEHBGULAM③線形DNA（

linear，lDNA）一條鏈上有一至數(shù)個缺口。②開環(huán)DNA（

opencircular，ocDNA）10/18/202314GEHBGULAM（5）質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同：scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。SCOCL10/18/202315GEHBGULAMLOCSC10/18/202316GEHBGULAM二、質(zhì)粒的類型在大腸桿菌中的質(zhì)粒，可以分為：接合型質(zhì)粒:非接合型質(zhì)粒能自我轉(zhuǎn)移不能自我轉(zhuǎn)移10/18/202317GEHBGULAM除了帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細(xì)菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。如：F質(zhì)粒（性質(zhì)粒、或F因子）：甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體菌中。又叫自我轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒。1.接合型質(zhì)粒：不符合基因工程的安全要求。10/18/202318GEHBGULAM大腸桿菌接合（conjunction）10/18/202319GEHBGULAM2.非接合型質(zhì)粒雖然帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息，但失去了控制細(xì)菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因，因此不能從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞。（1）R質(zhì)粒（抗性質(zhì)粒）帶有一種或數(shù)種抗生素抗性基因，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀（resistance）。符合基因工程的安全要求。10/18/202320GEHBGULAM10/18/202321GEHBGULAM帶有控制大腸桿菌素（colicin）合成的基因。（2）Col質(zhì)粒大腸桿菌素對不帶Col質(zhì)粒的大腸桿菌有毒。Col質(zhì)?；騌質(zhì)粒如果帶有轉(zhuǎn)移基因，也可以成為接合型質(zhì)粒。10/18/202322GEHBGULAM三、質(zhì)粒的復(fù)制類型1.嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringentplasmid）拷貝數(shù)少，只有1—3份拷貝。2.松弛型質(zhì)粒（relaxedplasmid）拷貝數(shù)多，有10—60份拷貝。（接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬嚴(yán)緊型）。（非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型）。10/18/202323GEHBGULAM（1）分子量大，拷貝數(shù)低四、質(zhì)粒載體的構(gòu)建1.天然質(zhì)粒的局限性第一個用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，分子長

9.1kb。但只有一個EcoRI切點充當(dāng)克隆位點，Tetr作為篩選標(biāo)志。10/18/202324GEHBGULAM10/18/202325GEHBGULAMColE1質(zhì)粒的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素E1（colicinE1）。（2）篩選標(biāo)志不理想可以通過插入失活篩選。但細(xì)菌群體容易自發(fā)突變出抗colicinE1的細(xì)胞…….colicinE1能殺死不含ColE1質(zhì)粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位點EcoRI正好位于這個基因的內(nèi)部。10/18/202326GEHBGULAMColE110/18/202327GEHBGULAM（1）

具有復(fù)制起點（ORI）2.質(zhì)粒載體必須具備的基本條件（2）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點是篩選的標(biāo)志。理想的載體應(yīng)該有兩種抗菌素抗性基因。用來插入外源DNA片斷。且插入后不影響復(fù)制功能。10/18/202328GEHBGULAM（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。10/18/202329GEHBGULAMAtypicalplasmidvector.

Itcontainsapolylinkerwhichcanrecognizeseveraldifferentrestrictionenzymes,anampicillin-resistancegene(ampr)forselectiveamplification,andareplicationorigin(ORI)forproliferationinthehostcell.

10/18/202330GEHBGULAM氨芐青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性

（Kanr）四環(huán)素抗性

（Tetr）鏈霉素抗性

（Strr）氯霉素抗性

（Cmlr）3.質(zhì)粒的選擇標(biāo)記及其工作原理（1）選擇標(biāo)記①抗菌素抗性絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗菌素抗性標(biāo)記：10/18/202331GEHBGULAM

常用抗菌素的抗性工作原理i）氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）青霉素的衍生物。通過干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成的末端反應(yīng)，殺死生長的細(xì)菌。a）抑菌原理b）細(xì)菌抗性原理Ampr基因編碼

-內(nèi)酰胺酶，特異地切割氨芐青霉素的

-內(nèi)酰胺環(huán)。10/18/202332GEHBGULAMii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）通過與50S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長的細(xì)菌。b）細(xì)菌抗性原理Cmlr

編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶，特異地使氯霉素乙?；Щ?。a）抑菌原理10/18/202333GEHBGULAMa）殺菌原理iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）通過與70S核糖體結(jié)合，導(dǎo)致mRNA發(fā)生錯讀。殺死細(xì)菌。b）細(xì)菌抗性原理Kanr

編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，對卡那霉素進行修飾，阻斷其與核糖體結(jié)合作用。10/18/202334GEHBGULAMiv）鏈霉素（Streptomycin，Str）a）殺菌原理通過與30S核糖體亞基結(jié)合，導(dǎo)致mRNA錯譯。殺死細(xì)菌。b）細(xì)菌抗性原理Strr

編碼一種氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶對鏈霉素進行修飾，阻斷其與核糖體30S亞基結(jié)合作用。10/18/202335GEHBGULAMv）四環(huán)素（Tetracycline，Tet）b）細(xì)菌抗性原理a）抑菌原理通過與30S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長的細(xì)菌。Tetr編碼特異性蛋白質(zhì)，對細(xì)菌的膜結(jié)構(gòu)進行修飾，組止四環(huán)素通過細(xì)胞膜進入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。10/18/202336GEHBGULAM10/18/202337GEHBGULAM10/18/202338GEHBGULAM②

遺傳標(biāo)記使受體菌發(fā)生遺傳性狀的改變的基因。10/18/202339GEHBGULAM10/18/202340GEHBGULAM當(dāng)帶有抗菌素抗性基因的載體進入受體菌后，受體菌才能生長。不帶有抗菌素抗性基因的受體菌不能在含有抗菌素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中生長。（2）抗菌素選擇原理活死抗性基因抗菌素10/18/202341GEHBGULAM4.人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體的類型（1）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體ColE1、pMB1派生質(zhì)粒具有高拷貝數(shù)的特點。而且在沒有菌體蛋白質(zhì)合成的條件下（蛋白質(zhì)合成抑制劑，氯霉素等存在下）仍能復(fù)制，達(dá)到每個細(xì)胞的拷貝數(shù)1000—3000個！適合大量增殖克隆基因、或需要表達(dá)大量的基因產(chǎn)物。10/18/202342GEHBGULAM（2）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體

但有特殊用途:由pSC101派生來的載體特點是分子量小，拷貝數(shù)低。當(dāng)有些被克隆的基因的表達(dá)產(chǎn)物過多時會嚴(yán)重地影響寄主菌的正常代謝活動，導(dǎo)致寄主菌死亡時，就需要低拷貝的載體。pLG338、pLG339、pHSG415等不適合大量擴增DNA用。10/18/202343GEHBGULAM（3）失控的質(zhì)粒載體這是一類溫度敏感型復(fù)制控制質(zhì)粒。溫度低（低于37oC），拷貝數(shù)很少；溫度增加（>40oC）時，拷貝數(shù)會很快增加到1000個以上。如pBEU1、pBEU2。runawayplasmidvectors1979年B.E.Uhlin等構(gòu)建。10/18/202344GEHBGULAM（4）

插入失活型質(zhì)粒載體載體的克隆位點位于其某一個選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部。如pDF41、pDF42、pBR329?？咕乜剐酝庠碊NA無抗菌素抗性10/18/202345GEHBGULAM（5）正選擇的質(zhì)粒載體如pUR2、pTR262等。只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長。直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。目前通用的絕大部分質(zhì)粒載體都是正選擇載體。Directselectionvectors10/18/202346GEHBGULAM（6）

表達(dá)型質(zhì)粒載體主要用來使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。如果在大腸桿菌里表達(dá)，必須把所克隆的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄—翻譯信號控制之下。注意啟動子的性質(zhì)，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確。10/18/202347GEHBGULAM復(fù)制起始點ORI、選擇標(biāo)記、多克隆位點MCS2）大腸桿菌操縱子元件阻遏基因I操縱基因O啟動基因P核糖體結(jié)合位點序列（SD）轉(zhuǎn)錄終止信號區(qū)。1）普通載體元件①表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)10/18/202348GEHBGULAM10/18/202349GEHBGULAM五、經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體1.pSC101第一個成功地用于克隆實驗的大腸桿菌質(zhì)粒載體。（1）類型天然質(zhì)粒，屬低拷貝型。（2）長度9.09kb。（3）選擇標(biāo)記四環(huán)素抗性Tetr10/18/202350GEHBGULAM6個克隆位點：EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、BamHI、SalI主要使用EcoRI。（其中HindIII、BamHI、SalI3個位于選擇標(biāo)記Tetr的內(nèi)部）（4）克隆位點10/18/202351GEHBGULAM10/18/202352GEHBGULAM2.ColE1（1）類型天然質(zhì)粒，屬高拷貝型。（2）長度6.3kb。（3）選擇標(biāo)記大腸桿菌素（colicin）E1和對E1免疫的基因（immE1）特點是在培養(yǎng)基中加入氯霉素抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成后，質(zhì)粒仍然能復(fù)制達(dá)到每個細(xì)胞1000-3000拷貝之多！10/18/202353GEHBGULAM①colicinE1基因的結(jié)構(gòu)ceaimmkil結(jié)構(gòu)基因免疫基因溶菌基因②殺死不含有ColE1細(xì)菌的原因cea+kil基因產(chǎn)物③

不被其他細(xì)菌的colicinE1所殺死的原因imm基因10/18/202354GEHBGULAMEcoRI位于E1內(nèi)部，插入外源DNA會導(dǎo)致E1失活，使受體菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表現(xiàn)出對E1免疫型（ImmE1+）。EcoRI（4）克隆位點ColicinE1外源DNA無Colicin10/18/202355GEHBGULAM用對外源colicinE1的免疫性和自身不能合成colicinE1作選擇，操作非常繁雜。對colicinE1敏感的細(xì)菌群體中自發(fā)突變產(chǎn)生抗colicinE1的頻率很高?。?）ColE1的選擇缺陷ColE1抗colicinE1殺ColE1-仍抗colicinE1不殺ColE1-插入片斷ColE110/18/202356GEHBGULAM10/18/202357GEHBGULAMpSP2124質(zhì)粒的Ampr基因3.pBR322：（1）元件來源F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工構(gòu)建載體。①復(fù)制起點

oripMB1系列（來源于ColE1）的高拷貝型復(fù)制起點②

Ampr基因③Tetr基因pSC101的Tetr基因。10/18/202358GEHBGULAM（2）長度4363bp（3）選擇標(biāo)記氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。（4）克隆位點其中9個會導(dǎo)致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）；3個會導(dǎo)致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。24個克隆位點。10/18/202359GEHBGULAM10/18/202360GEHBGULAM（5）pBR322的優(yōu)點①雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記

插入失活，分兩次先后選擇：沒有獲得載體的寄主細(xì)胞

在Amp或Tet中都死亡。獲得載體的寄主細(xì)胞

在Amp或Tet其中之一中死亡。10/18/202361GEHBGULAM外源基因

BamHIAmp中存活但在Tet中死亡外源基因

PstITet中存活但在Amp中死亡10/18/202362GEHBGULAM氯霉素擴增之后，每個細(xì)胞可達(dá)1000~3000copy④安全失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過接合轉(zhuǎn)移。③

高拷貝數(shù)②分子小，克隆能力大載體越小越好。>10kb的DNA在純化過程中容易斷裂。10/18/202363GEHBGULAM保留了轉(zhuǎn)移蛋白（mob）的作用位點。（6）pBR322的缺點能夠被ColK質(zhì)粒編碼的mob蛋白識別，如果再有F質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移！10/18/202364GEHBGULAM①刪除mob識別位點（如質(zhì)粒pBR327、pAT153等）。pAT153：從pBR322上切去HaeII片斷，既除去了mob識別位點，又增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)。（7）PBR322的改進10/18/202365GEHBGULAMpBR325：在pBR322位點上接入一段來自噬菌體PICm的HaeII酶切片斷（帶有氯霉素抗性基因cmlr）。cmlr上也帶一個EcoRI位點。使EcoRI也成為插入失活型位點。②

改造EcoRI位點10/18/202366GEHBGULAM4.pUC系列UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基礎(chǔ)上改造而成。屬正選擇載體。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC1910/18/202367GEHBGULAM①

復(fù)制起點pBR322的

ori但其上失去了克隆位點。②

Ampr基因（1）元件來源③lacZ的啟動子大腸桿菌④lacZ’基因大腸桿菌lacZ的

-肽鏈序列，

是LacZ的氨基端片斷。pBR322的Ampr基因10/18/202368GEHBGULAM（2）長度約2.7kb（3）克隆位點10個連續(xù)的單一限制酶切位點，位于lacZ’基因的5’端。10/18/202369GEHBGULAMpUC18/1910/18/202370GEHBGULAM10/18/202371GEHBGULAMAmpicillin抗性和lacZ的

肽互補（藍(lán)白斑）相結(jié)合。（4）選擇標(biāo)記藍(lán)白斑選擇原理：①Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-

-D-galactoside）10/18/202372GEHBGULAM

-半乳糖苷酶能把無色的化合物X－gal分解成半乳糖和一個深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-氯靛藍(lán)。X－gal半乳糖5-溴-4-氯靛藍(lán)

-半乳糖苷酶②

-半乳糖苷酶X-gal顯色反應(yīng)：10/18/202373GEHBGULAM③lacZ的

肽互補1）

-肽（

lacZ’

）：

-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片斷（11-41氨基酸）。lacZ只有在4聚體的狀態(tài)下才有功能.C端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aa4聚體10/18/202374GEHBGULAM2）受體菌lacZ突變（lacZ?M15）受體菌基因組的

-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失

肽），不能形成4聚體的活性酶，不能分解X－gal受體菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a10/18/202375GEHBGULAMpUC質(zhì)粒載體上的lacZ’

編碼

肽與這個缺失突變的

-半乳糖苷酶“互補”，使它能形成4聚體。又能分解X－gal。產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。C端大部分N端的11-41aapUClacZ’

受體菌lacZ?3）載體lacZ’與

互補10/18/202376GEHBGULAM4）

互補的插入失活pUC載體上LacZ’的5’端有一段多克隆位點(MCS)區(qū)，本身雖不干擾LacZ’的合成，但插入外源基因就會阻止LacZ’的合成。不能互補。lacZ’

5’

3’

肽移碼突變lacZ’

5’

3’

肽不互補互補MCS外源DNA10/18/202377GEHBGULAM④IPTG的誘導(dǎo)作用IPTG(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside)是乳糖的類似物。能誘導(dǎo)lac操縱子的啟動轉(zhuǎn)錄，使受體菌基因組中的lacZ的C端部分和載體的lacZ’

肽都表達(dá)。從而互補。但載體MCS上插入外源DNA后，仍然不能產(chǎn)生

肽！IPTG10/18/202378GEHBGULAM通過看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有DNA插入。MCS無插入時，互補，藍(lán)菌斑。MCS有插入時，不互補，白菌斑。IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果：10/18/202379GEHBGULAM無質(zhì)粒的受體菌

-半乳糖苷酶部分缺失，不能分解Xgal；無抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)無菌斑生長質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌

-半乳糖苷酶的缺失被載體產(chǎn)物

互補，能分解Xgal。且有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)有藍(lán)色菌斑生長帶外源DNA插入的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌載體產(chǎn)物失活，不能互補

-半乳糖苷酶的缺失。不能分解Xgal，但有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)有白色菌斑生長10/18/202380GEHBGULAM10/18/202381GEHBGULAM（5）pUC系列載體的優(yōu)點①更小的分子量：如pUC18為2682bp，pUC8為2750bp。②選擇方便X-gal顯色、抗菌素雙重直接選擇。③克隆便利具有多克隆位點（MCS），使有兩個不同粘性末端的外源DNA方便地插入。④測序方便10/18/202382GEHBGULAMpUC的MCS與M13噬菌體載體的MCS完全相同，便于把外源DNA轉(zhuǎn)移到M13載體上測序。M13mp18的多克隆位點10/18/202383GEHBGULAM六、其它質(zhì)粒載體1.pGEM-3Z由pUC派生而來。與pUC的主要區(qū)別是在MCS的兩側(cè)分別加了一個噬菌體啟動子T7和SP6。T7啟動子SP6啟動子MCSlacZ’

Amprori可被T7和SP6的RNA聚合酶識別轉(zhuǎn)錄。10/18/202384GEHBGULAM①

如果加入純化的T7或SP6RNA聚合酶，在試管里就可以轉(zhuǎn)錄mRNA②外源基因正接反接都可以轉(zhuǎn)錄。③MCS與pUC18的完全一樣。2.pGEM-4Z：與pGEM-3Z相同，只是T7啟動子和SP6啟動子的位置互換。（1）pGEM-3Z的特點：10/18/202385GEHBGULAM3.穿梭質(zhì)粒載體（1）穿梭質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點和選擇標(biāo)記、可以在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。（shuttleplasmidvectors）10/18/202386GEHBGULAMYeast復(fù)制起點E.coli復(fù)制起點E.coli選擇標(biāo)記Yeast選擇標(biāo)記MCS大腸桿菌

枯草桿菌穿梭載體大腸桿菌

釀酒酵母穿梭載體

大腸桿菌

動物細(xì)胞穿梭載體（2）常用的穿梭質(zhì)粒載體10/18/202387GEHBGULAM（3）穿梭載體的優(yōu)點②也能利用其它細(xì)胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿菌、哺乳動物細(xì)胞等）進行基因表達(dá)。③可以自如地在兩種不同寄主細(xì)胞之間來回轉(zhuǎn)移基因?？寺?、構(gòu)建表達(dá)E.coliAnimalcell①

利用大腸桿菌進行基因克隆、表達(dá)10/18/202388GEHBGULAM10/18/202389GEHBGULAM10/18/202390GEHBGULAM七、質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性1.質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳必須的兩個條件：（1）每個世代、每個質(zhì)粒至少要復(fù)制一次（2）在細(xì)胞分裂時，復(fù)制過的質(zhì)粒必須分

配到兩個子細(xì)胞中。10/18/202391GEHBGULAM有主動分配和隨機分配兩種假說。（1）主動分配天然質(zhì)粒。2.質(zhì)粒分配方式具有一個控制質(zhì)?？截惙峙涞墓δ軈^(qū)（Par），能以主動分配的方式確保質(zhì)粒能正確分配到兩個子細(xì)胞中。10/18/202392GEHBGULAM人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體缺失了par區(qū)，只能以隨機分配方式分到子細(xì)胞中。人工質(zhì)粒。（一般情況下也能保證質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳）（2）隨機分配但在一定條件下會出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象。10/18/202393GEHBGULAM在寄主菌細(xì)胞分裂的過程中，有一個細(xì)胞沒有獲得質(zhì)?？截?，并最終繁殖成無質(zhì)粒的優(yōu)勢群體。3.分離的不穩(wěn)定性（segregationinstability）10/18/202394GEHBGULAM4.結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性（structuralinstability）寄主基因組的IS序列插入質(zhì)粒、質(zhì)粒間的同源重組等都會使質(zhì)粒發(fā)生插入或缺失。ISdimer重組10/18/202395GEHBGULAM（1）新陳代謝負(fù)荷：5.影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素使寄主細(xì)胞生長減緩：質(zhì)粒載體使寄主的世代時間延長約15%。①復(fù)制負(fù)荷減緩的程度與質(zhì)粒的分子量成正比。②轉(zhuǎn)錄和翻譯負(fù)荷丟失質(zhì)粒的細(xì)胞反而會成為優(yōu)勢群體！10/18/202396GEHBGULAM每個菌體中所擁有的質(zhì)粒拷貝數(shù)不完全相同，稱差度。（2）質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的差度小，遺傳穩(wěn)定。差度（variance）：是產(chǎn)生無質(zhì)粒細(xì)胞的重要原因。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體差度大，擁有少量拷貝數(shù)的菌體多，發(fā)生丟失的可能性大。10/18/202397GEHBGULAM野生型E.coli中，質(zhì)粒在寄主的重組酶作用下會發(fā)生重組形成二聚體質(zhì)粒。（3）寄主菌的重組體系二聚體災(zāi)難（dimercatastrophe）：含有大分子量插入片斷的質(zhì)粒載體普遍能形成質(zhì)粒寡聚體。二聚體質(zhì)粒的復(fù)制速度是單體的二倍！導(dǎo)致質(zhì)粒失控。10/18/202398GEHBGULAM第二節(jié)

噬菌體載體

噬菌體是一類細(xì)菌病毒（Bacteriophage）。一、噬菌體的一般特性結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)外殼內(nèi)包裹著DNA（雙鏈、單鏈、線性、環(huán)狀等）。10/18/202399GEHBGULAM10/18/2023100GEHBGULAMsinglelinearDNA(about182,000bp)T2GenomicDNA10/18/2023101GEHBGULAMT4Bacteriophage10/18/2023102GEHBGULAM分為兩種：1.溶菌周期二、噬菌體的生活周期感染細(xì)菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬菌體。烈性噬菌體（virulentphage)10/18/2023103GEHBGULAM10/18/2023104GEHBGULAM10/18/2023105GEHBGULAM2.溶原周期感染細(xì)菌后，將自己的DNA整合到細(xì)菌的染色體DNA中。形成這一過程稱為溶源化（lysogenization)。整合到細(xì)菌染色體的噬菌體DNA稱為原噬菌體，隨細(xì)菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。溫和噬菌體（temperatephage)原噬菌體（prophage)：10/18/2023106GEHBGULAM10/18/2023107GEHBGULAM三、單鏈?zhǔn)删w載體

M13、f1、fd噬菌體單鏈環(huán)狀DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體：M13噬菌體10/18/2023108GEHBGULAM（2）復(fù)制型（RF）是雙鏈環(huán)狀DNA。1.單鏈DNA噬菌體的特點（3）RFDNA和ssDNA都能轉(zhuǎn)染感受態(tài)

大腸桿菌。并產(chǎn)生噬菌斑。（5）可產(chǎn)生大量的含有外源DNA插入片

斷的單鏈分子，便于作探針或測序。（1）+DNA。（ssDNA）（4）不存在包裝限制。10/18/2023109GEHBGULAM2.M13噬菌體RFdsDNA在寄主細(xì)胞內(nèi)以高拷貝形式存在。成熟的噬菌體里只包裝有+DNA，也容易提取。M13噬菌體只感染雄性大腸桿菌。但M13DNA可以轉(zhuǎn)染雌性大腸桿菌。6407bp。（2）DNA長度（3）DNA提純（1）寄主10/18/2023110GEHBGULAMM13序列10/18/2023111GEHBGULAM（4）M13的生活周期雖然不導(dǎo)致溶菌，但使菌斑混濁（細(xì)菌生長變慢，約為正常的1/2—3/4）M13通過雄性細(xì)菌的F性須注入其+DNA+DNA合成－DNA，形成RFdsDNA－DNA轉(zhuǎn)錄mRNA、合成+DNA、翻譯形成噬菌體蛋白組裝成新的噬菌體M13，擠出寄主細(xì)胞10/18/2023112GEHBGULAM+DNA-DNAmRNAM13外殼蛋白組裝成子代M13+DNA注入大腸桿菌復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯+DNA指導(dǎo)合成+DNA200個RFDNA每個細(xì)胞可以放出約1000個M13顆粒！10/18/2023113GEHBGULAMM13的包裝過程：RFdsDNA指導(dǎo)合成的+DNAM13基因V編碼單鏈DNA結(jié)合蛋白DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物轉(zhuǎn)移到寄主的細(xì)胞膜M13外殼蛋白基因V蛋白脫落+DNA溢出細(xì)胞膜包裝（5）沒有包裝限制10/18/2023114GEHBGULAM3.M13載體的構(gòu)建：M13基因組中只有基因II與基因IV之間存在一段507bp的基因間隔區(qū)。（1）克隆區(qū)域的選定①基因間隔區(qū)（intergenicregion,IG區(qū)）IG區(qū)內(nèi)只有一個

BsuI切點。其余9個BsuI限制性位點分布在其它部位。②酶切位點10/18/2023115GEHBGULAMM13J.Messing證明，IG區(qū)存在M13的復(fù)制起點，但可以插入外源DNA而不影響M13噬菌體的活力。10/18/2023116GEHBGULAM在IG區(qū)內(nèi)插入一個大腸桿菌的LacZ’（

-肽序列)。利用

-肽序列中的三個單一酶切位點（BglII、AvaII和

PvuI）。（2）加入酶切位點①

在IG區(qū)內(nèi)加入單一內(nèi)切酶位點第一個M13載體：M13mp1：10/18/2023117GEHBGULAMM13RFBsuI不完全消化各種長度的線性片斷（其中應(yīng)有只在IG上切開的線性全長M13）E.coli

lac基因的HindII片斷(lacI、lacP、lacO、lacZ’）連接M13mp1JM101宿主只有在IG區(qū)插入lacZ’才能存活并在Xgal上出現(xiàn)互補的藍(lán)噬菌斑10/18/2023118GEHBGULAM（3）M13載體系列加上常用的酶切位點。①M13載體系列的命名M13mpn

n代表系列數(shù)字②

對M13mp1的改進B.Gronenborn和J.Messing1978年把LacZ’5’端的第13個核苷酸G突變成A，產(chǎn)生了一個EcoRI切點。M13mp2：10/18/2023119GEHBGULAM5’ATGACCATGATTACGGATTCA-Me用N-甲基-N-亞硝基脲

把G甲基化

5’ATGACCATGATTACGGATTCA-轉(zhuǎn)染E.coli。mG與T配對，復(fù)制兩次后5’ATGACCATGATTACGAATTCA-EcoRI切點用EcoRI切M13mp1M13mp2選擇能切開的

線性分子再環(huán)化M13mp110/18/2023120GEHBGULAM③

對M13mp2的進一步改進在M13mp2的LacZ’的5’端加上一段人工合成的多克隆位點（MCS）。M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19對應(yīng)有相同MCS的pUC系列載體：pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19成為M13mp系列載體：10/18/2023121GEHBGULAM10/18/2023122GEHBGULAM10/18/2023123GEHBGULAM與pUC18相同M13mp18的多克隆位點10/18/2023124GEHBGULAM4.M13系列載體的優(yōu)點（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段（2）Xgal顯色反應(yīng)，可供直接選擇（3）無包裝限制，克隆能力大（4）可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈子代M13噬菌體中包含的是單連+DNA。10/18/2023125GEHBGULAMMCS+-+-+-編碼鏈非編碼鏈外源DNA不同的酶切不同的酶切插入M13vector10/18/2023126GEHBGULAMM13RF+-+-+-外源DNA轉(zhuǎn)染E.coli成熟的子代M13中++10/18/2023127GEHBGULAMPhageM13replicationinthehostcell:+RNApolDNApolIII±RFNickedbygene2protein+ss-Rollingcirclereplication,thencutandligateCoatedwithgene5proteinGene5proteinisreplacedbygene8proteinect.LinearM13phagereleasedfromthecell.10/18/2023128GEHBGULAM①

插入外源DNA后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降②實際克隆能力小于1500bp。雖無包裝限制，并非無限包裝！5.M13載體的缺點10/18/2023129GEHBGULAM6.噬菌粒載體（phagemidvectors）由質(zhì)粒載體與單鏈?zhǔn)删w載體的復(fù)制起點結(jié)合而成的新型載體系列。MCS噬菌體ori質(zhì)粒oriAmprlacZ’

lacI10/18/2023130GEHBGULAM約3000bp（比M13?。诳寺∧芰Υ竽懿迦?0kb的外源DNA。③兩種復(fù)制形式①分子量?。?）噬菌粒載體的特點既具有質(zhì)粒的復(fù)制起點，又具有噬菌體的復(fù)制起點。既能在大腸桿菌中以質(zhì)粒的形式雙鏈復(fù)制，又能在噬菌體內(nèi)進行單鏈復(fù)制。10/18/2023131GEHBGULAM（2）常見的噬菌粒載體噬菌粒載體質(zhì)粒部分單鏈?zhǔn)删w部分輔助噬菌體大腸桿菌寄主pEMBL8pUC8f1IR171/18pRSA101

VXM13M13變異株XS127，XS101pUC118/pUC119pUC18/pUC19M13M13K07MV1184pBSpUCf1M13K07XL1-Blue輔助噬菌體用來復(fù)制和包裝噬菌粒載體。10/18/2023132GEHBGULAM（3）pUC118/pUC119①構(gòu)成1）M13的基因間隔區(qū)（IG）2）pUC18/pUC19質(zhì)粒載體：帶有M13復(fù)制起點。質(zhì)粒復(fù)制起點Ampr

lacZ’

MCS10/18/2023133GEHBGULAMMCSpUC18/pUC19oriAmprlacZ’

lacIM13ori3.2kbpUC118/11910/18/2023134GEHBGULAM②pUC118/119的復(fù)制模式兩種不同的復(fù)制模式1）雙鏈質(zhì)粒復(fù)制模式受pUC本身的復(fù)制起點（來源于ColE1）的控制。每個細(xì)胞能達(dá)到500個拷貝。10/18/2023135GEHBGULAM來源于M13的復(fù)制起點被輔助噬菌體的基因II產(chǎn)物控制。2）單鏈滾環(huán)噬菌體復(fù)制模式外殼蛋白復(fù)制蛋白輔助M13包裝當(dāng)寄主細(xì)胞被輔助噬菌體M13感染后。10/18/2023136GEHBGULAM③噬菌粒載體的包裝1）輔助噬菌體：自身的復(fù)制起點發(fā)生了突變，復(fù)制效率低下，但感染細(xì)菌后能表達(dá)出外殼蛋白和復(fù)制蛋白，幫助噬菌粒載體復(fù)制。如M13K07等。2）包裝：輔助噬菌體外殼蛋白和復(fù)制蛋白噬菌粒載體ssDNA噬菌體10/18/2023137GEHBGULAM（4）pBluescript噬菌粒載體（pBS）Stratagene公司發(fā)展的一類噬菌粒載體。由pUC質(zhì)粒載體、f1噬菌體的復(fù)制起點和T3、T7噬菌體的啟動子組成。②特點①組成MCS兩側(cè)分別加上T3和T7噬菌體的啟動子。加入適當(dāng)?shù)氖删wRNA聚合酶，就可以定向體外轉(zhuǎn)錄。1）定向體外轉(zhuǎn)錄10/18/2023138GEHBGULAM2）兩種復(fù)制模式既能以質(zhì)粒的形式復(fù)制，又能以噬菌體的形式復(fù)制包裝。3）選擇方便有Ampr和lacZ’，可以進行Amp抗性選擇和Xgal-IPTG藍(lán)白斑選擇。4）插入方便18個單一酶切位點的MCS10/18/2023139GEHBGULAMSK：表示lacZ’的轉(zhuǎn)錄方向是沿MCS上的

SacI

KpnI

+（f1+）：單鏈復(fù)制起始方向背離

lacZ’，能回收lacZ’的編碼鏈（+）pBluescriptSK（+/-）/pBluescriptKS（+/-）KS：反向（

KpnI

SacI，MCS相反）-（f1-）：能回收lacZ’的非編碼鏈（-）1）pBluescriptSK/KS（+/-）區(qū)分：③

常用的pBluescript載體10/18/2023140GEHBGULAMpBSSK+10/18/2023141GEHBGULAMpBSKS-10/18/2023142GEHBGULAM10/18/2023143GEHBGULAM10/18/2023144GEHBGULAM（5）PCR產(chǎn)物克隆載體T載體pCR系列載體Invitrogen公司開發(fā)的線性噬菌粒載體。①結(jié)構(gòu)pUC的質(zhì)粒部分、fi噬菌體ori、Kanr和Ampr抗性。MCS的中部已經(jīng)切開，各有一個3’端突出的T。②特點PCR產(chǎn)物往往在3’端突出一個A，所以能與這個載體直接連接。10/18/2023145GEHBGULAMpCR2.110/18/2023146GEHBGULAMpCR2.1的MCS克隆的PCR產(chǎn)物能被兩側(cè)的EcoRI切下來回收。10/18/2023147GEHBGULAMpCR2.1-topo10/18/2023148GEHBGULAMpCR100010/18/2023149GEHBGULAMPromega公司的T載體系列pGEM-Tvector10/18/2023150GEHBGULAMpTargetvectorG418抗性可在真核生物表達(dá)外顯子捕捉10/18/2023151GEHBGULAMTvector的克隆過程——簡便！AATTTvectorPCRproductT4DNAligaseAA10/18/2023152GEHBGULAM7.噬菌體展示載體（

Phagedisplayvector）（1）噬菌體展示（Phagedisplay）將外源蛋白（多肽、酶、抗體、DNA結(jié)合蛋白）結(jié)合到噬菌體的外殼蛋白上形成融合蛋白，表達(dá)于噬菌體的外表面。G.P.Smith1985年發(fā)明。絲狀噬菌體（M13、f1等）外殼顆粒的一端，有3-5個基因Ⅲ編碼的蛋白質(zhì)（g3p），在識別和吸附大腸桿菌的過程中起作用。10/18/2023153GEHBGULAMM1310/18/2023154GEHBGULAM（2）噬菌體展示載體的構(gòu)建把外源DNA片斷插入基因Ⅲ的序列前端，并保持兩者的閱讀框正確，表達(dá)出融合蛋白。啟動子外源DNAM13基因ⅢoriM13displayvector外源多肽10/18/2023155GEHBGULAM四、雙鏈?zhǔn)删w載體—

載體（1）長度為48502bp；（2）雙鏈線性DNA；（3）但在兩端有cos位點，可以環(huán)化。

DNA兩端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點。1.

DNA分子的特點

cos位點（cohensive-endsite）10/18/2023156GEHBGULAM

DNA進入細(xì)菌體內(nèi)后，可形成雙鏈環(huán)狀DNA復(fù)制型（RFDNA）。10/18/2023157GEHBGULAM

噬菌體和其DNA10/18/2023158GEHBGULAMDNA上有至少61個基因，有一半是必須的與自身的活動有關(guān)，成簇排列。其他約1/3是非必須基因（位于尾部合成至阻遏之間的區(qū)段）。2.

噬菌體的基因組特點

10/18/2023159GEHBGULAM

genome(48502bp)10/18/2023160GEHBGULAM10/18/2023161GEHBGULAM

噬菌體感染細(xì)菌的早期：雙鏈進行

型復(fù)制。3.

DNA的復(fù)制

模型（1）

型復(fù)制10/18/2023162GEHBGULAM（2）滾環(huán)復(fù)制

感染的晚期：啟動滾環(huán)復(fù)制機制。形成多聯(lián)體

DAN分子。10/18/2023163GEHBGULAM這種多聯(lián)體分子必須在cos位點被切斷成單體分子才能被包裝起來。10/18/2023164GEHBGULAM（1）構(gòu)建原理4.

噬菌體載體的構(gòu)建（2）構(gòu)建過程①在這個非必須區(qū)內(nèi)制造限制酶切點②引進某些突變表型，作為選擇標(biāo)記③突變某些基因，使它成為安全載體④刪除

DNA必須區(qū)段上常用的限制酶切點

噬菌體DNA上本身有5個EcoRI和7個HindIII切點！刪除

噬菌體的非必需區(qū)，留出插入空間。10/18/2023165GEHBGULAM（3）人工構(gòu)建的

噬菌體載體有兩種類型①插入型載體（insertionvectors)如

gt10、

gt11、

BV2、

NM540、

NM1590、

NM6071）免疫功能失活型：插入位點位于載體合成活性阻遏物區(qū)域（cI基因）內(nèi)。EcoRIcI

gt1010/18/2023166GEHBGULAM插入導(dǎo)致載體不能合成阻遏物，

載體DNA不能進入溶源期，受體菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。沒有外源DNA插入的

載體感染受體菌形成混濁噬菌斑。選擇標(biāo)記:如

NM1149載體的兩個克隆位點（EcoRI和HindIII）都是位于cI基因內(nèi)部。10/18/2023167GEHBGULAM2）

-半乳糖苷酶失活型載體在

基因組中引入了LacZ’序列。（其上含有一個EcoRI克隆位點）。感染LacZ突變的大腸桿菌，經(jīng)IPTG的誘導(dǎo)，利用Xgal的顯色反應(yīng)作選擇標(biāo)記。LacZ’

EcoRICharon16A選擇標(biāo)記:10/18/2023168GEHBGULAM②

替換型載體（substitutionvectors)

兩個多克隆位點區(qū)以反向重復(fù)形式分別位于

DNA的非必須區(qū)兩端。用酶切后，可以將中間的區(qū)段切下來，與用同樣酶切成的外源DNA片斷置換?？芍脫Q區(qū)MCSMCS如：

EMBL4、Charon40等。10/18/2023169GEHBGULAM1）

EMBL4

EMBL4的可置換片斷內(nèi)部還有SalI酶切位點。以便于進一步消化中間片斷，防止自我連接。左臂可置換區(qū)右臂EcoRIBamHISalISalIBamHIEcoRISalISalI

EMBL410/18/2023170GEHBGULAM2）Charon40Charon40的可置換片斷是由DNA短片重復(fù)構(gòu)成，片斷之間有HaeI切點。在克隆的時候，可以用HaeI酶進一步將可置換片斷切成小片斷，以防止重新與載體連接。左臂可置換區(qū)右臂MCSMCSCharon40HaeI10/18/2023171GEHBGULAM可取代片斷中如果包含LacZ’，可用Xgal顯色作篩選標(biāo)記。（4）

載體的篩選標(biāo)記②插入型載體根據(jù)插入所引起的表型突變。①置換型載體10/18/2023172GEHBGULAM

Virusesthatcaninfectbacteria.48.5kbinlengthLinearorcirculargenome(cosends)λphageLyticphase

(Replicateandrelease)Lysogenicphase(integrateintohostgenome)10/18/2023173GEHBGULAM

載體克隆策略置換型載體10/18/2023174GEHBGULAM

DNA象質(zhì)粒載體那樣直接轉(zhuǎn)化細(xì)菌時效率遠(yuǎn)比質(zhì)粒低。5.

載體的體外包裝

在試管中與

噬菌體的頭部和尾部蛋白人工裝配成噬菌體顆粒，才能高效地感染細(xì)菌，把重組DNA注入受體菌中。必須利用噬菌體外殼的作用?。?）體外包裝10/18/2023175GEHBGULAM

10/18/2023176GEHBGULAM

的D基因的產(chǎn)物也是頭部蛋白，但主要與

DNA進入頭部和頭部的成熟有關(guān)（只占20%）。（2）體外包裝過程①

噬菌體外殼蛋白的合成E基因的E基因編碼頭部蛋白的主要成分（占頭部總蛋白的70%）。D基因10/18/2023177GEHBGULAME基因突變只合成尾部蛋白和包裝識別蛋白D基因突變合成頭部蛋白和尾部蛋白，但不能聚合和包裝DNA提取尾部蛋白提取頭部和尾部蛋白重組的

載體DNA體外包裝成活性噬菌體10/18/2023178GEHBGULAM外源的重組

DNA載體被誘發(fā)與內(nèi)源性原

DNA發(fā)生重組。（3）體外包裝存在的問題①包裝錯誤既能包裝用于生產(chǎn)頭部蛋白的內(nèi)源性原

DNA，也能包裝重組的

DNA載體。②重組10/18/2023179GEHBGULAM③體外包裝的容量限制必須在正常野生型容量的75%—105%（36—51kb）之間。既不能超過正常野生型容量的105%；又不能低于正常野生型容量的75%野生型

DNA的必須區(qū)是28kb，所以

載體的最大克隆容量是23kb。（實際上為15kb）。10/18/2023180GEHBGULAM比一般的質(zhì)粒載體的容量大的多（4）

DNA載體的優(yōu)點用在真核生物基因組文庫的建立。Sau3ABamHI10/18/2023181GEHBGULAM10/18/2023182GEHBGULAM噬菌體感染細(xì)菌形成的噬菌斑10/18/2023183GEHBGULAM1978年J.Collins和B.Hohn等人發(fā)展出cosmidvector（cossite-carryingplasmid)

DNA：4—6kb（1）大小

（2）組成

6.cosmid載體（粘粒）cos序列和控制包裝的的序列。pBR322：質(zhì)粒的復(fù)制子抗藥性基因幾個限制性酶的單一位點10/18/2023184GEHBGULAM柯斯質(zhì)粒pHC79系由質(zhì)粒pBR322和噬菌體λ的cos位點的一段DNA構(gòu)成全長4.3kb10/18/2023185GEHBGULAMCloningbyusingcosmidvectors.

(a)Inadditiontoampr,ORI,andpolylinkerasintheplasmidvector,thecosmidvectoralsocontains

aCOSsite.

(b)Aftercosmidvectorsarecleavedwithrestrictionenzyme,theyareligatedwithDNAfragments.

Thesubsequentassemblyandtransformationstepsarethesameascloningwithlphages10/18/2023186GEHBGULAM①具有

噬菌體的特性（3）cosmidvector的特點

克隆外源DNA后可以體外包裝成噬菌體顆粒。在寄主細(xì)胞內(nèi)形成環(huán)化DNA（但不能形成新的噬菌體顆粒而溶菌

）。②具有質(zhì)粒載體的特性大多帶有pMB1或ColE1的復(fù)制子，能象質(zhì)粒一樣復(fù)制。10/18/2023187GEHBGULAM有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位點。③方便的選擇④高容量的克隆能力45kb

（最少不能低于30kb）。51kb-5kb=45kb10/18/2023188GEHBGULAM（4）部分cosmidvectorCosmid載體復(fù)制子大?。╧b)選擇標(biāo)記克隆位點克隆能力（kb)c2XBpMB16.8Ampr,Kanr

BamHI,ClaI,EcoRI,HindIII,PstI,SmaI32~45pHC79pMB16.4Ampr,Tetr

EcoRI,HindIII,SalI,BamHI,PstI,CalI29~46pHS262ColE12.8Kanr

BamHI,EcoRI,HincII34~50pJC74ColE115.8Ampr

EcoRI,BamHI,BglII,SalI21~37pJC75-58ColE111.4AmprEcoRI,BamHI,BglII16~42pJC74mColE121Ampr,KanrBamHI16~32pJC720ColE17.1Elimm,Rifr

HindIII,XmaI11~2810/18/2023189GEHBGULAMCosmid載體復(fù)制子大?。╧b)選擇標(biāo)記克隆位點克隆能力（kb)pJC81pMB17.1Ampr,TetrKpnI,BamHI,HindIII,SalI30~46pJB8ColE15.4Ampr

BamHI,HindIII,SalI31~47MuA-3pMB14.8TetrPstI,EcoRI,BalI,PvuI,PvuII32~48MuA-10pMB14.8TetrEcoRI,BalI,PvuI,PvuI32~48pTL5pMB15.6TetrBglII,BalI,HpaI31~47pMF7pMB15.4Ampr

EcoRI,SalI32~4810/18/2023190GEHBGULAM應(yīng)用cosmid載體在大腸桿菌中克隆大片端的真核基因組DNA技術(shù)，叫“柯斯克隆”（cosmidcloning）。（5）cosmidcloning①理論依據(jù)cos位點:

噬菌體的生命周期中，會產(chǎn)生數(shù)百個

DNA通過cos位點連接的“多聯(lián)體”分子?！岸嗦?lián)體”復(fù)制：包裝識別。10/18/2023191GEHBGULAM在包裝的時候，

噬菌體具有位點特異的末端酶（terminase）體系（Ter體系），識別cos位點，把多聯(lián)體切成單個

DNA長度。兩個cos位點之間，必須保持38—45kb的DNA，Ter體系才能識別。Ter體系包裝限制10/18/2023192GEHBGULAM①用特定的核酸內(nèi)切酶消化真核生物DNA（6）cosmid克隆的一般過程②用同樣的內(nèi)切酶消化cosmid載體產(chǎn)物中將有一定比例的分子是兩端各有一個cos位點、長度40kb左右的真核DNA與載體的連接物。③連接10/18/2023193GEHBGULAM切割合適長度的雜種DNA連接物，并包裝入噬菌體頭部。注入到細(xì)菌體內(nèi)的雜種DNA分子環(huán)化，并按質(zhì)粒的方式復(fù)制。⑤感染大腸桿菌④Ter體系識別并切割10/18/2023194GEHBGULAM10/18/2023195GEHBGULAM10/18/2023196GEHBGULAM大質(zhì)粒！10/18/2023197GEHBGULAM①載體片斷自我連接②外源DNA片斷自我連接③多個本來不在一起的外源DNA片斷連接起來同時插入載體（7）cosmid載體克隆的缺點用堿性磷酸酶除去線性質(zhì)粒片斷5’端的磷酸，可防止載體自體連接?？朔d體自體連接的改良方案：10/18/2023198GEHBGULAM①Ish-Horowice—Burke改良方案1981年，D.Ish-Horowice和J.F.Burke。（8）cosmid載體的改良在BamHI位點兩側(cè)各有一個EcoRI切點。1）突出的特點：pJB8cosmid載體使克隆在BamHI上的外源DNA可被EcoRI切下來。10/18/2023199GEHBGULAM包裝識別10/18/2023200GEHBGULAM2）Ish-Horowice—Burke方案克隆過程HindIIISalISalIHindIIIBamHI10/18/2023201GEHBGULAMa.需要脫磷酸化處理。b.電泳純化載體兩臂。c.載體兩臂的最終得率少的可憐！2）Ish-Horowice—Burke方案的缺點防止載體自我連接第二次酶切后。10/18/2023202GEHBGULAM1983年P(guān).F.Bates和R.A.Swift②Bates---Swift改良方案a.具有兩個cos位點。SmaI平端的連接效率低，阻止了載體臂的自我連接，增加了外源DNA的連接效率。1）特點：b.一個SmaI切點把兩個cos位點分開。c.BamHI克隆位點。c2XBcosmid載體10/18/2023203GEHBGULAM10/18/2023204GEHBGULAMBates---Swift克隆過程：10/18/2023205GEHBGULAM第三節(jié)

大分子DNA克隆載體A.W.Murray1983年形成基礎(chǔ)理論,D.T.Burke等1987年變?yōu)楝F(xiàn)實。一、酵母人工染色體1.YAC的特點（1）只能在酵母細(xì)胞中擴增（yeastartificialchromosome,YAC)（2）克隆容量大，為230kb-1700kb（3）構(gòu)建原理，按染色體結(jié)構(gòu)構(gòu)建10/18/2023206GEHBGULAM（1）DNA復(fù)制起始點（ori）2.染色體復(fù)制和遺傳的三個基本組件TELTELCENORI（2）著絲粒（centromere，cen）（3）兩個端粒（telomeres，tel）10/18/2023207GEHBGULAMLeuARSCENLeu-Yeast后代死Leu-Yeast80%后代死Leu-Yeast后代活Leu-Yeast后代死Leu-Yeast后代活TelTel10/18/2023208GEHBGULAM（1）著絲粒區(qū)（CEN）A

AGTCACGTGTTGTTTCTGNTTTCCGAAA3.YAC的組成結(jié)構(gòu)酵母染色體著絲粒區(qū)的保守序列:78-86bpIIIIII由三個區(qū)組成10/18/2023209GEHBGULAM酵母第3、4、6、11號染色體的著絲粒區(qū)序列：10/18/2023210GEHBGULAM酵母端粒保守序列是(G4T2)n

重復(fù)序列。（3）復(fù)制起點（ORI）約100bp的自主復(fù)制序列（ARS）。（2）端粒（TEL）人是TTAGGG重復(fù)序列;四膜蟲是GGGTTG重復(fù)序列。（真核生物中只有酵母菌有ARS）兩個端粒序列Tel。10/18/2023211GEHBGULAM位于

SUP4

基因內(nèi)部。（4）克隆位點插入失活選擇SUP4酶失活的酵母菌落呈紅色；不失活的菌落是白色。10/18/2023212GEH