第22章-免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

第二十二章免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

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主講：運(yùn)晨霞第一節(jié)體外抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的特點(diǎn)及影響因素一.體外抗原抗體反應(yīng)的特征

高度特異性：抗原的表位與抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)結(jié)構(gòu)互補(bǔ)。

表面化學(xué)基團(tuán)之間的可逆性結(jié)合適宜的抗原抗體濃度和比例抗原抗體反應(yīng)的兩個(gè)階段高度專一性的結(jié)合可逆性結(jié)合Equivalence–Latticeformation抗原抗體比例對(duì)反應(yīng)現(xiàn)象的影響抗原抗體反應(yīng)的影響因素電解質(zhì)：可促進(jìn)抗原與抗體的結(jié)合。常用生理鹽水。溫度：最適溫度為37℃。酸堿度：最適pH=6-8。第二節(jié)檢測(cè)抗原或抗體的體外試驗(yàn)（一）凝集反應(yīng)顆粒性抗原（RBC、細(xì)菌等）與相應(yīng)抗體結(jié)合形成肉眼可見(jiàn)凝集物的現(xiàn)象或反應(yīng)。1．直接凝集試驗(yàn)玻片凝集試驗(yàn)：用于定性測(cè)抗原。如ABO血型鑒定，細(xì)菌的鑒定、分型等。試管凝集試驗(yàn)：用于定量測(cè)抗體，如肥達(dá)氏反應(yīng)。

2．間接凝集試驗(yàn)如類風(fēng)濕因子的測(cè)定等。（二）沉淀反應(yīng)

可溶性抗原（血清蛋白、組織浸液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合而形成可見(jiàn)沉淀物的反應(yīng)。因該類反應(yīng)多在半固體瓊脂凝膠中進(jìn)行，故又稱為瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)或免疫擴(kuò)散。

瓊脂凝膠1．單向免疫擴(kuò)散用于定量測(cè)抗原。如檢測(cè)血清免疫球蛋白、C3等含量。

2．雙向免疫擴(kuò)散主要用于定性檢測(cè)抗原或抗體，抗原組成及兩種抗原相關(guān)性分析3．免疫電泳

其方法是先電泳、后擴(kuò)散。主要用于抗原成分的分析，亦可用于診斷如骨髓瘤、性聯(lián)低丙種球蛋白血癥等的診斷

（三）免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記靈敏性特異性標(biāo)記免疫技術(shù)的主要特點(diǎn)：高特異性、高靈敏性免疫技術(shù)+標(biāo)記技術(shù)常用的標(biāo)記物酶、熒光素、放射性核素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)及膠體金優(yōu)點(diǎn)：極大的提高了反應(yīng)的靈敏度，可以對(duì)微量物質(zhì)進(jìn)行定量、定性或定位檢測(cè)。免疫標(biāo)記技術(shù)主要類型：免疫酶技術(shù)免疫熒光技術(shù)放射免疫測(cè)定法發(fā)光免疫分析免疫膠體金技術(shù)1)免疫酶測(cè)定法（EnzymeImmunoassay,EIA）利用酶標(biāo)記一抗或二抗檢測(cè)特異性抗原或抗體的方法特點(diǎn)：利用抗原-抗體反應(yīng)的高度特異性，以及酶催化底物反應(yīng)的生物放大作用,最后用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值（OD），評(píng)定抗原-抗體的含量。常用酶及其底物辣根過(guò)氧化物酶（HRP）堿性磷酸酶（AP）

分類雙抗體夾心法在臨床檢驗(yàn)中，此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、HCG等特點(diǎn)：非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)常用于抗原的檢測(cè)適用于分子中具有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測(cè)所用兩種抗體分別針對(duì)同一個(gè)抗原分子的不同抗原決定簇

間接法ELISA乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測(cè)常采用本法2)免疫熒光技術(shù)

(ImmunofluorescenceTechnique)

用熒光素標(biāo)記一抗或二抗，檢測(cè)特異性抗原或抗體的方法

常用熒光素異硫氰酸熒光素（FITC），顯黃綠色。藻紅蛋白（PE），顯紅色。用途：細(xì)胞表面CD分子抗核抗體

3)放射免疫測(cè)定法（RIA）用放射性核素標(biāo)記一抗或二抗，檢測(cè)特異性抗原或抗體的方法敏感度可達(dá)pg水平，其標(biāo)記物為125I、131I等。常用于微量物質(zhì)的檢測(cè)，如激素、IgE等。

4)發(fā)光免疫分析(luminescenceimmunoassay

LIA)將發(fā)光分析系統(tǒng)和免疫測(cè)定相結(jié)合而建立的一種新的超微量免疫分析技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：該方法既具有免疫反應(yīng)的高度特異性又有發(fā)光分析的高靈敏度。化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定吖啶酯、魯米諾生物發(fā)光免疫測(cè)定螢火蟲(chóng)、發(fā)光水母化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定辣根過(guò)氧化物酶（HRP）堿性磷酸酶（AP）電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定5)免疫膠體金技術(shù)用膠體金標(biāo)記一抗或二抗，檢測(cè)特異性抗原或抗體的方法6)免疫印跡法（Westernblotting）該法是將凝膠電泳與固相免疫相接合的檢測(cè)技術(shù)，即將電泳分區(qū)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體，再用酶免疫、放射免疫技術(shù)測(cè)定。常用于檢測(cè)多種蛋白質(zhì)免疫印跡法示意圖4.蛋白質(zhì)芯片技術(shù)：又稱蛋白質(zhì)微陣列是一種高通量的蛋白功能分析技術(shù)，可用于蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析，研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，甚至DNA－蛋白質(zhì)、RNA－蛋白質(zhì)的相互作用，篩選藥物作用的蛋白靶點(diǎn)等。原理：是將各種蛋白質(zhì)有序地固定于載玻片等各種介質(zhì)載體上成為檢測(cè)的芯片，然后，用標(biāo)記了有特定熒光物質(zhì)的抗體與芯片作用，與芯片上的蛋白質(zhì)相匹配的抗體將與其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)結(jié)合，抗體上的熒光將指示對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)及其表達(dá)數(shù)量。第三節(jié)免疫細(xì)胞功能的檢測(cè)免疫細(xì)胞的分離外周血單個(gè)核細(xì)胞分離淋巴細(xì)胞的分離T細(xì)胞和B細(xì)胞的分離T細(xì)胞亞群的分離(一)外周血單個(gè)核細(xì)胞分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs）包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞（monocyte）。

Ficoll分離液法主要用于分離外周血中的單個(gè)核細(xì)胞，是一種單次差速密度梯度離心的分離法。細(xì)胞分離基本原理不同細(xì)胞密度不同不同細(xì)胞表面生物學(xué)特性不同不同細(xì)胞表面分化抗原不同不同細(xì)胞密度不同人的紅細(xì)胞密度為1.093

粒細(xì)胞密度為1.092

單個(gè)核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）的密度為1.075-1.090

用1.077±0.001的分層液可將細(xì)胞分離密度梯度離心(Ficoll)離心（二）淋巴細(xì)胞及其亞群的分離和分析免疫吸附分離法免疫磁珠法熒光激活細(xì)胞分離儀分離法（

(FluorescenceActivatedCellSorting)，

FACS

）抗原肽-MHC分子四聚體技術(shù)分析CTL

2.免疫磁珠細(xì)胞分離免疫磁珠法細(xì)胞分選過(guò)程3.熒光激活細(xì)胞分離儀分離法流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)

全自動(dòng)細(xì)胞分選系統(tǒng)流式細(xì)胞分析儀流式細(xì)胞儀的工作原理和基本結(jié)構(gòu)待測(cè)細(xì)胞以單個(gè)細(xì)胞的懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色，放入樣品管，吸入流動(dòng)室。流動(dòng)室充滿IsoFlow

，作用：約束樣品在噴嘴中心，防止樣品靠近噴孔壁堵塞噴孔。細(xì)胞排成單列由噴嘴中心噴出，形成細(xì)胞液柱。液柱與激光束相交，細(xì)胞上的熒光染料被激發(fā)產(chǎn)生熒光。熒光信號(hào)變成電信號(hào)輸出到計(jì)算機(jī)，軟件分析。4.抗原肽-MHC分子四聚體是一種藥品的名字，可應(yīng)用于免疫學(xué)研究和檢測(cè)、特異性免疫治療以及疫苗療效監(jiān)測(cè)等多個(gè)方面抗原肽-MHC分子四聚體技術(shù)分析CTL二細(xì)胞免疫功能檢測(cè)T細(xì)胞功能測(cè)定B細(xì)胞功能測(cè)定（1）T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)原理：淋巴細(xì)胞DNA合成分化母細(xì)胞刺激物細(xì)胞變大細(xì)胞漿擴(kuò)大空泡核仁明顯核染色質(zhì)疏松1）形態(tài)學(xué)檢查法2）3H-TdR摻入法優(yōu)點(diǎn)：3H-TdR摻入法敏感性高，客觀性強(qiáng)，重復(fù)性好。缺點(diǎn)：但需一定設(shè)備條件，同時(shí)還存在放射性核素污染問(wèn)題。3H-TdR或125I-UdR摻入法3）MTT比色法(2)遲發(fā)型超敏反應(yīng)檢測(cè)2.B細(xì)胞功能測(cè)定單擴(kuò)ELISA速率比濁法測(cè)定各類免疫球蛋白含量抗體形成細(xì)胞測(cè)定（2）溶血空斑試驗(yàn)原理：臨床應(yīng)用與評(píng)價(jià)溶血空斑試驗(yàn)主要用于測(cè)定藥物和手術(shù)等因素對(duì)體液免疫功能的影響評(píng)價(jià)免疫治療或免疫重建后機(jī)體產(chǎn)生抗體的能力。

B細(xì)胞抗體形成功能的檢測(cè)

——酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法原理：應(yīng)用與方法學(xué)評(píng)價(jià)：該方法既可檢測(cè)抗體分泌細(xì)胞，又可檢測(cè)抗體分泌量。優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定、特異、抗原用量少；可同時(shí)檢測(cè)不同抗原誘導(dǎo)的不同抗體分泌，并可定量；可檢測(cè)組織切片中分泌抗體的單個(gè)細(xì)胞。ELISPOT技術(shù)簡(jiǎn)介

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(Enzymelinkedimmunospotassay)

80年代，國(guó)外的科研工作者根據(jù)ELISA技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測(cè)特異性抗體分泌細(xì)胞和CK分泌細(xì)胞的固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）。因其具有較高的特異性和敏感性，目前正被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用，對(duì)探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制具有重要意義。ELISPOT的基本原理

細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后，被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與酶標(biāo)記（例如堿性磷酸酶）的親和素結(jié)合。底物（BCIP/NBT，產(chǎn)物為藍(lán)紫色）孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過(guò)酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)分析后得出結(jié)果。穩(wěn)定、特異，且抗原用量少可同時(shí)檢測(cè)不同抗原誘導(dǎo)的抗體分泌，并可定量