工業(yè)微生物培養(yǎng)與檢測技術

項目三工業(yè)微生物培養(yǎng)與檢測技術

細胞總數(shù)測量（直接計數(shù)法）

活菌數(shù)測量（間接計數(shù)法）

細胞生物量測量一、微生物生長的測定1.顯微鏡直接計數(shù)

是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上，于顯微鏡下直接計數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。血球計數(shù)板：菌體較大的酵母菌或霉菌孢子細菌計數(shù)板：一般細菌用途：適用于各種含單細胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液的計數(shù)缺點：不易區(qū)分顆粒、死菌體和雜菌。細胞總數(shù)測量常用計數(shù)器有血球計數(shù)板(血細胞計數(shù)板)、Petroff-Hauser計菌器以及Hawksley計菌器等。各種計數(shù)板的計數(shù)原理相同，只是血球計數(shù)板較厚，不能使用油鏡觀察，只能計數(shù)較大的霉菌孢子和酵母菌；后兩種細菌計數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察，可以直接計數(shù)細菌。常用計菌器

血球計數(shù)板Petroff-Hauser計菌器Hawksley計菌器（1）血球計數(shù)板法

原理：特制的厚玻片，有四條槽和兩條嵴，中央有一短橫槽和兩個平臺，兩嵴的表面比兩個平臺的表面高0.1mm。每個平臺有不同規(guī)格的網(wǎng)格，每個方格網(wǎng)分為9個大方格，中央大方格1mm2面積上面積上可有400個小格，即為計數(shù)室。計數(shù)在計數(shù)室中進行。計數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格：一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格分成16個小方格；另一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格。無論是哪一種規(guī)格的計數(shù)板，每一個大方格中的小方格都是400個。每一個大方格邊長為lmm，則蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.lmm，所以計數(shù)室的容積為0.lmm3(1/10000毫升)。使用血球計數(shù)板計數(shù)時，通常數(shù)5個中方格的總菌數(shù)A，然后求每個中方格的平均值，再乘上大方格（計數(shù)室）中方格的數(shù)量，就得出一個大方格中的總菌數(shù)。再換算成每毫升菌液中微生物細胞的數(shù)量。計算：1mL菌液中總菌數(shù)=A/5*25*104*B=50000*A*B1mL菌液中總菌數(shù)=A/5*16*104*B=32000*A*B其中B為稀釋倍數(shù)。計數(shù)方法

適用范圍：細胞個體形態(tài)較大的單細胞（酵母、血細胞等）特點：快速，準確，對酵母菌可同時測定出芽率，或在菌懸液中加入少量美藍可以區(qū)分死活細胞。

Petroff-Hauser計菌器Hawksley計菌器細菌計數(shù)板（2）涂片染色法（適于細菌計數(shù)）應用：可同時計數(shù)不同微生物的菌數(shù)，適于土壤、牛奶中細菌計數(shù)。方法：用鏡臺測微尺計算出視野面積；取0.01mL菌液涂于1cm2面積上，計數(shù)后代入公式：

視野中平均菌數(shù)每mL原菌液含菌數(shù)=×涂布面積×100×稀釋倍數(shù)

視野面積2.電子計數(shù)器計數(shù)法工作原理是測定小孔中液體的電阻變化，小孔僅能通過一個細胞，當一個細胞通過這個小孔時，電阻明顯增加，形成一個脈沖，自動記錄在電子記錄裝置上。

該法測定結果較準確，但它只識別顆粒大小，而不能區(qū)分是否為細菌。因此，要求菌懸液中不含任何碎片。不適于微生物肥料產(chǎn)品的檢測。原理：在一定范圍內(nèi)，菌懸液中的細胞濃度與混濁度成正比，即與光密度（OD值）成正比，菌數(shù)越多，光密度越大，但與透光度成反比。優(yōu)缺點：簡便菌懸液顏色不宜太深，不能混雜其他雜質(zhì)。3.比濁法在一定波長下，測定菌懸液的光密度，以光密度(opticaldensity,即O.D.)表示菌量。實驗測量時應控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準確：合適波長；適宜菌液濃度；分光光度計法1、平板計數(shù)法活細胞在培養(yǎng)基中能形成菌落，菌落數(shù)就是活菌數(shù)。以菌落形成單位——CFU(colonyformingunits)表示?；罹鷶?shù)測量制作培養(yǎng)基并對培養(yǎng)基滅菌配制樣品稀釋液接種（兩種方法）

涂布平板法：倒平板接種0.1mL涂布

混合平板法：接種1mL混勻

培養(yǎng)：室溫下培養(yǎng)形成單菌落查菌落數(shù)并計算菌落數(shù)菌體數(shù)/mL=×菌液稀釋倍數(shù)接種量倒平板培養(yǎng)基溫度45℃25g/mL樣品225mL無菌生理鹽水每管9mL無菌生理鹽水瓊脂培養(yǎng)基每皿15mL-2-3-4-5-6-6-6-61mL1mL1mL1mL1mL1mL-5-5-51mL-4-4-41mL混合平板培養(yǎng)法-1★技術要求：樣品充分混勻，操作熟練快速（15-20min完成操作），嚴格無菌操作；★注意事項：每一支吸管只能用于一個稀釋度，樣品混勻處理，傾注平板時的培養(yǎng)基溫度；★適用范圍：中溫、好氧和兼性厭氧、能在營養(yǎng)瓊脂上生長的微生物，★誤差：多次稀釋造成的誤差是主要來源，其次還有由于樣品內(nèi)菌體分布不均勻、以及不當操作。平板菌落計數(shù)法X5X5X5X52、最大或然數(shù)法測數(shù)（MPN）如某一細菌在稀釋法中的生長情況如下；

稀釋度

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

重復數(shù)

5

5

5

5

5

5

出現(xiàn)生長的管數(shù)

5

5

5

4

1

0

根據(jù)以上結果，在接種10-3—10-5稀釋液的試管中5個重復都有生長，在接種10-6稀釋液的試管中有4個重復生長，在接種10-7稀釋液的試管中只有1個生長，而接種10-8稀釋液的試管全無生長。由此可得出其數(shù)量指標為“541”，查最大或然數(shù)表得近似值17，然后乘以第一位數(shù)的稀釋倍數(shù)（10-5的稀釋倍數(shù)為100000）。那么，1ml原菌液中的活菌數(shù)＝17×100000=17×105。即每毫升原菌液含活菌數(shù)為l700000個。本法特別適合于測定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纖維素分解、固氮、硫化和反硫化細菌等）的數(shù)量和檢測污水、牛奶及其他食品中特殊微生物類群（如大腸菌群）的數(shù)量。缺點是只適于進行特殊生理類群的測定，結果也較粗放，只有在因某種原因不能使用平板計數(shù)時才采用。測定在一個混雜的微生物群落中雖不占優(yōu)勢，但具有某種特殊生理功能的類群。硝酸纖維素膜測定空氣、水等含菌量低的樣品當中的活菌數(shù)3、濃縮法（濾膜法）1、稱重法適用于絲狀微生物生長量的測定

適用于含菌量高，不含或少含顆粒性雜質(zhì)的樣品

將微生物培養(yǎng)液過濾或離心，收集菌體，洗凈后稱重，即為濕重，若在100-105℃烘干至恒重，稱重即為干重。細胞生物量測量2、DNA含量測定法每個細菌細胞約含DNA8.4X10-5ng3、ATP含量測定法微生物細胞中的ATP含量恒定4、代謝活性法

物質(zhì)的消耗產(chǎn)生量對氧的吸收發(fā)酵糖產(chǎn)酸量二氧化碳的釋放量等細胞生物量測量顯微鏡直接計數(shù)法（不辨死活）平板菌落計數(shù)法（形成菌落的微生物）光電比濁法（不用于顏色太深的樣品）測定細胞重量法（測定絲狀真菌生長量）測定細胞生物量（適于濃度較高的樣品）。。。。。。

微生物的生長通常以群體的生長作為指標。群體生長表現(xiàn)為細胞數(shù)目的增加或者細胞物質(zhì)的增加。測定微生物數(shù)量的主要方法：同步培養(yǎng)：能使培養(yǎng)物中所有微生物細胞都處于相同的生長階段的培養(yǎng)方法。二、微生物的同步生長同步培養(yǎng)物用途：來研究在單個細胞上難以研究的生理與遺傳特性；作為工業(yè)發(fā)酵的種子。

細胞同步生長細胞非同步生長同步生長：在培養(yǎng)物中所有的微生物細胞都處于同一生長階段。同步培養(yǎng)方法

誘導法溫度培養(yǎng)基成份控制光照和黑暗交替培養(yǎng)獲得同步生長的方法主要有兩類：環(huán)境條件誘導法：變換溫度、光線、培養(yǎng)基等，造成與正常細胞周期不同的周期變化。選擇法：選擇性過濾、梯度離心。物理方法，隨機選擇，不影響細胞代謝。選擇法離心方法過濾分離法硝酸纖維素濾膜法原理：一些細菌細胞會緊緊吸附于硝酸纖維微孔濾膜上。步驟：菌懸液通過微孔濾膜，細胞吸附其上；反置濾膜，以新鮮培養(yǎng)液通過濾膜，洗掉浮游細胞；除去起始洗脫液后就可以得到剛剛分裂下來的新生細胞，即為同步培養(yǎng)。同步生長的時間，因菌種和條件而變化，由于同步群體的個體差異，同步生長不能無限地維持，往往會逐漸破壞，最多能維持2-3個世代，又逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殡S機生長，即非同步化三、單細胞微生物的生長曲線生長曲線：

細菌接種到定量的液體培養(yǎng)基中，定時取樣測定細胞數(shù)量，以培養(yǎng)時間為橫座標，以細菌數(shù)目為縱座標作圖，得到的反映細菌在整個培養(yǎng)期間菌數(shù)變化規(guī)律的曲線。在微生物學中提到的“生長”，指群體生長。細菌的生長曲線一般用菌數(shù)的對數(shù)為縱坐標作圖一條典型的生長曲線可以分為四個時期：

遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期（一）遲緩期將少量菌種接入新鮮培養(yǎng)基后，在開始一段時間內(nèi)菌數(shù)不立即增加或增加很少，生長速度接近于零，也稱延遲期、適應期。遲緩期的特點：生長速度接近于零；細胞形態(tài)變大或增長，例如巨大芽孢桿菌，在遲緩期末，細胞的平均長度比剛接種時長6倍。一般來說處于遲緩期的細菌細胞體積最大；細胞內(nèi)RNA（尤其是rRNA）含量增高，合成代謝活躍，核糖體、酶類和ATP的合成加快，易產(chǎn)生誘導酶；對外界不良條件反應敏感。分裂遲緩、代謝活躍遲緩期出現(xiàn)的原因：微生物接種到一個新的環(huán)境，短時間內(nèi)缺乏分解和催化有關底物的酶，或是缺乏充足的中間代謝產(chǎn)物等。為產(chǎn)生誘導酶或合成中間代謝產(chǎn)物，就需要一段適應期。調(diào)整代謝在發(fā)酵工業(yè)上需設法盡量縮短延遲期；在食品工業(yè)上，盡量在此期進行消毒或滅菌３.對實踐的指導意義：４.縮短延遲期的措施：①選用繁殖快的菌種②菌齡：采用對數(shù)生長期的健壯菌種；③增加接種量；（群體優(yōu)勢----適應性增強）④接種前后的培養(yǎng)基組分相差不要太大，在種子基中加入發(fā)酵培養(yǎng)基的某些成分。（二）對數(shù)期又稱指數(shù)生長期(Exponentialphase)，緊接著延滯期的一段細胞數(shù)以幾何級數(shù)增長的時期。三個重要參數(shù)：繁殖代數(shù)（n）代時（G）生長速率常數(shù)（R）１.特點:生長速度常數(shù)R最大細胞進行平衡生長，細胞大小、形態(tài)、生理特征一致酶系活躍，代謝旺盛活菌數(shù)和總菌數(shù)接近。

t–t0————=Gn細菌細胞分裂繁殖一代所需的時間為代時(Generationtime)，用G表示。生長速率常數(shù)（R）=1/G影響微生物代時長短的因素：菌種：不同的微生物及微生物的不同菌株代時不同；營養(yǎng)成分：在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中生長代時短；營養(yǎng)物濃度：一定范圍內(nèi)，生長速率與營養(yǎng)物濃度呈正比；溫度：在一定范圍，生長速率與培養(yǎng)溫度呈正相關。2.應用意義：①由于此時期的菌種比較健壯，增殖噬菌體的最適菌齡；②發(fā)酵工業(yè)上盡量延長該期，以達到較高的菌體密度③生產(chǎn)上用作接種的最佳菌齡；④是生理代謝及遺傳研究或進行染色、形態(tài)觀察等的良好材料。（三）穩(wěn)定期又稱恒定期或最高生長期，此時培養(yǎng)液中活細菌數(shù)最高并維持穩(wěn)定。1.穩(wěn)定期的特點：總菌數(shù)達到最大值，菌體含量最高；代謝活力鈍化，細胞生長變得不平衡。積累貯存物質(zhì)，如糖原、異染粒等；也是積累代謝產(chǎn)物的重要階段，某些抗生素的大量形成也在此時期；芽孢桿菌在此階段形成芽孢。穩(wěn)定期到來的原因：

營養(yǎng)物質(zhì)消耗；營養(yǎng)物的比例失調(diào)（如C/N比值不合適）；

pH、氧化還原電勢等環(huán)境變化；有害代謝產(chǎn)物積累（如酸、醇、毒素、H2O2等）。2.應用意義：1）發(fā)酵生產(chǎn)形成的重要時期（抗生素等），生產(chǎn)上應盡量延長此期，提高產(chǎn)量，措施如下：補充營養(yǎng)物質(zhì)（補料）調(diào)pH

調(diào)整溫度2）穩(wěn)定期細胞數(shù)目及產(chǎn)物積累達到最高。（四）衰亡期營養(yǎng)物質(zhì)耗盡，有毒代謝產(chǎn)物的大量積累，細菌死亡速率超過新生速率，整個群體呈現(xiàn)出負增長。1.衰亡期的特點：細菌衰老并出現(xiàn)自溶；產(chǎn)生或釋放出一些產(chǎn)物，如氨基酸、轉(zhuǎn)化酶、外肽酶或抗生素等。菌體形態(tài)出現(xiàn)改變，有時產(chǎn)生畸形，細胞大小懸殊，有些革蘭氏染色反應陽性菌此時會變成陰性反應。芽孢桿菌開始釋放芽孢。２.產(chǎn)生原因：生長條件的進一步惡化，使細胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導致菌體的死亡。３.意義：微生物在衰亡期活力下降，積累的代謝毒物會影響某些代謝物的提純，所以應該掌握時間，及時收取產(chǎn)物。1.微生物在對數(shù)生長期生長速率最快；2.營養(yǎng)物的消耗，代謝產(chǎn)物的積累，以及因此引起培養(yǎng)條件的變化，是限制培養(yǎng)液中微生物快速增殖的主要原因；3.用生活力旺盛的對數(shù)生長期細胞接種，可以縮短延遲期，加速進入對數(shù)期；4.補充營養(yǎng)物，調(diào)節(jié)因生長而改變了的pH、氧化還原電勢，排除培養(yǎng)環(huán)境中的有害代謝產(chǎn)物，可以延長對數(shù)生長期，提高菌體濃度與有用代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量；5.對數(shù)期以菌體生長為主，穩(wěn)定期以代謝產(chǎn)物合成與積累為主。生長曲線用于指導發(fā)酵工程中工藝條件的優(yōu)化溫度對微生物的影響具體表現(xiàn)在：影響酶活性，溫度變化影響酶促反應速率，最終影響細胞合成。影響細胞膜的流動性，進而，溫度變化影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝產(chǎn)物的分泌。影響物質(zhì)的溶解度，對生長有影響。一、溫度對微生物生長的影響（一）微生物生長的三個溫度基點最低生長溫度：微生物生長的最低溫度下限；超過最低生長溫度時，微生物不生長，溫度過低，甚至會死亡。最適生長溫度：微生物生長最快時的溫度，處于最適生長溫度時，生長速度最快，代時最短。最高生長溫度：微生物生長的最高溫度；超過最高生長溫度時，微生物不生長，溫度過高，甚至會死亡。生長速度溫度停此生長致死最低最高最適根據(jù)微生物的最適生長溫度的不同，可將微生物劃為三個類型：（二）微生物生長溫度類型低溫型微生物（嗜冷微生物）中溫型微生物（嗜溫微生物）高溫型微生物（嗜熱微生物）1.低溫型微生物:最適生長溫度在5~20℃,主要分布在地球的兩極、冷泉、深海、冷凍場所及冷藏食品中。例：假單孢菌中的某些嗜冷菌在低溫下生長，常引起冷藏食品的腐敗。嗜冷微生物在低溫下生長的機理，據(jù)推測有兩種原因：①它們體內(nèi)的酶能在低溫下有效地催化，在高溫下酶活喪失②細胞膜中的不飽和脂肪酸含量高，低溫下也能保持半流動狀態(tài)，可以進行物質(zhì)的傳遞。

2.中溫型微生物：最適生長溫度為20℃~40℃，大多數(shù)微生物屬于此類。室溫型主要：為腐生或植物寄生，在植物或土壤中。體溫型主要：為寄生，在人和動物體內(nèi)。中溫型微生物不能在低溫條件下生長是由于：

1、中溫型微生物在低溫下蛋白質(zhì)的合成過程不能啟動；2、低溫下，受代謝產(chǎn)物的反饋抑制。3.高溫型微生物：最適生長溫度為50℃~60℃,主要分布在溫泉、堆肥和土壤中。在高溫下能生長的原因：①酶蛋以及核糖體有較強的抗熱性②核酸具有較高的熱穩(wěn)定性（核酸中G+C含量高（tRNA），可提供形成氫鍵，增加熱穩(wěn)定性）。③細胞膜中飽和脂肪酸含量高，較高溫度下能維持正常的液晶狀態(tài)。高溫微生物的特點:生長速度快，合成大分子迅速，可及時修復高溫對其造成的分子損傷。耐高溫菌具應用優(yōu)勢：在減少能源消耗、減少染菌、縮短發(fā)酵周期等方面具重要意義。乳酸鏈球菌：34℃：繁殖速度最快，最適宜生長溫度40℃：發(fā)酵速度最快30℃：產(chǎn)乳酸量最多，積累產(chǎn)物最適宜溫度25~30℃：細胞產(chǎn)量最高，得率最高的溫度．★不同生理生化過程的最適溫度微生物不同生理活動要求不同溫度，所以，最適生長溫度≠發(fā)酵速度快、積累代謝產(chǎn)物多。又如：青霉素產(chǎn)生菌菌體的最適生長溫度為30℃，而產(chǎn)生青霉素的最適溫度為23℃。1、高溫對微生物的影響高溫下蛋白質(zhì)不可逆變性，膜受熱出現(xiàn)小孔，破壞細胞結構（溶菌）?！镂⑸飳岬哪褪芰εc以下因素有關:(1)微生物種類及發(fā)育階段嗜熱菌比其它類型的菌體抗熱有芽孢的細菌比無芽孢的菌抗熱微生物的繁殖結構比營養(yǎng)結構抗熱性強老齡菌比幼齡菌抗熱（三）高溫與低溫對微生物的影響(2)微生物對熱的耐受力還受環(huán)境條件的影響：與培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分有關——培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量高時比較耐熱.與pH有關——pH適宜時不易死亡，pH不適宜時，容易死亡.與水分有關——含水量大時容易死亡，含水量小時不容易死亡.與含菌量有關——含菌量高，抗熱性增強，含菌量低，抗熱性差。與熱處理時間有關——熱處理時間長，微生物易死亡。

2、低溫對微生物的影響造成死亡的原因：①凍結時細胞水分變成冰晶，冰晶對細胞膜產(chǎn)生機械損傷，膜內(nèi)物質(zhì)外漏。②凍結過程造成細胞脫水。因此，利用快速凍結可以對一些菌種進行凍結保藏，一般情況下在菌懸液中再加一些甘油、糖、牛奶、保護劑等可對菌種進行長期保藏。二、pH值對微生物生長的影響

微生物在pH4~9之間都可以生長。

①引起細胞膜電荷的變化，從而影響了微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收；②影響代謝過程中酶的活性；③改變營養(yǎng)物質(zhì)的可給性以及有害物質(zhì)的毒性。（一）環(huán)境pH值對微生物生長的影響微生物生長的pH值三基點：各種微生物都有其生長的最低、最適和最高pH值。低于最低、或超過最高生長pH值時，微生物生長受抑制或?qū)е滤劳觥８鶕?jù)微生物生長的最適pH值，將微生物分為：

嗜堿微生物：硝化細菌