三聚氰胺酸對腎臟的毒理學(xué)研究

三聚氰胺酸對腎臟的毒理學(xué)研究

2007年，三聚氰胺和三聚氰胺污染了動(dòng)物飼料。許多動(dòng)物的心臟都經(jīng)歷了結(jié)晶和腎衰竭。2008年，三聚氰胺引起的大規(guī)模公共衛(wèi)生事件，如嬰兒尿結(jié)石、腎衰竭甚至死亡，引起了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。至今,有關(guān)三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰胺-三聚氰酸混合物對不同日齡大鼠的腎臟毒性損害尚無深入研究。1材料和方法1.1a新生鼠、成年鼠、小鼠、花鼠21窩179只7日齡SD新生大鼠及84只成年健康SD大鼠(購于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),新生鼠10~12g,成年鼠200~250g,常規(guī)喂養(yǎng)于塑料籠內(nèi),自由進(jìn)食飲水,室溫23℃±1℃,相對濕度50%±10%,光照周期為12h/d。三聚氰胺(純度>99%),三聚氰酸(純度>98%)從Sigma-Aldrich(China)公司購得。1.2大鼠體重,腎細(xì)胞小體,dna,d21窩179只新生鼠隨機(jī)分為7組,每組3窩;成年鼠分為與新生鼠給藥劑量相對應(yīng)的7組,每組12只。即三聚氰胺高劑量組,400mg/(kg·d),NM,M;三聚氰胺低劑量組,40mg/(kg·d),Nm,m;三聚氰酸高劑量組,400mg/(kg·d),NA,A;三聚氰酸低劑量組,40mg(kg·d)/,Na,a;三聚氰胺-三聚氰酸高劑量組,400/400mg/(kg·d),NMA,MA;三聚氰胺-三聚氰酸低劑量組,40/40mg/(kg·d),Nma,ma;和正常對照組,0mg/(kg·d),NN,N;NN組及N組給予自來水1ml/(kg·d)灌胃。每天給予相應(yīng)劑量的三聚氰胺(酸)灌胃,持續(xù)兩個(gè)月,每日定時(shí)稱取記錄大鼠體重并觀察一般表現(xiàn)。分別于灌胃3、15、60d麻醉后,經(jīng)下腔靜脈取血后處死,切取雙側(cè)腎臟并稱重,在解剖顯微鏡下觀察腎臟縱切面晶體分布情況,4%中性甲醛固定腎臟后常規(guī)石蠟包埋切片,HE染色后光鏡觀察。應(yīng)用電鏡觀測腎臟超顯微結(jié)構(gòu)。日立717自動(dòng)分析儀測量血液尿素氮、肌酐及尿酸值。1.3統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,對體重、腎體重比、尿素氮值、肌酐值、尿酸值進(jìn)行方差分析,P<0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1灌胃前后大鼠體重的變化灌胃前各新生鼠組食欲、活動(dòng)度及平均體重沒有明顯差異(P>0.05);NMA及Nma組體重先增加,NMA組4d時(shí)體重開始下降,其中一窩在35d出現(xiàn)體重下降,Nma組在近60d時(shí)體重開始下降;其余新生鼠組體重持續(xù)增加。成年鼠各組食欲、活動(dòng)度及平均體重在灌胃前也無明顯差異(P>0.05);MA組、ma組體重持續(xù)呈下降趨勢,其余各成年組體重顯示緩慢增加,然后維持上下波動(dòng),其中M組在近60d時(shí)體重開始下降。NMA組在3d時(shí)開始死亡,存活時(shí)間小于15d;MA組全部在10d內(nèi)死亡,ma組2只存活時(shí)間超過15d,并表現(xiàn)毛發(fā)凌亂,可見鼻部出血;M組灌胃50d之后出現(xiàn)毛發(fā)凌亂,未見鼻部出血;其余成年鼠組未見明顯異常表現(xiàn)。2.2肝腎組織病理學(xué)檢測各實(shí)驗(yàn)組隨著觀測時(shí)間的延長,腎臟逐漸變大變白,腎皮質(zhì)分布著黃白色的小點(diǎn),以混合組更為明顯,在解剖顯微鏡下,晶體數(shù)量從陰性到以腎盂為中心呈扇形分部逐漸增加;HE染色后顯示各組腎小球形態(tài)基本正常,腎小管內(nèi)出現(xiàn)不同程度棕褐色的結(jié)晶,腎小管及腎小球的鮑曼氏囊明顯擴(kuò)張,腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞明顯水腫,炎癥細(xì)胞浸潤(見圖1)。電鏡下顯示各給藥組腎小管微絨毛減少或消失、粒細(xì)胞浸潤等炎癥反應(yīng)(見圖2),與光鏡觀測相似,對照組腎小管正常。2.3實(shí)行不同時(shí)點(diǎn),5各組隨著三聚氰胺(酸)給藥時(shí)間延長腎體重比增加,3d時(shí)各新生組腎體重比:NMA組>NA組>NN組>NM組>Nma組>Nm組>Na組,P﹤0.05;各成年組:MA組>ma組>M組≈m組≈A組≈a組≈N組,P﹤0.05。15d時(shí)各新生組腎體重比:NMA組>Nma組>NM組>NA組>Na組=NN組>Nm組,P<0.05;各成年組:ma組>MA組>m組>M組>A組>a組>N組,P﹤0.05;60d時(shí)各新生組腎體重比:NMA組>Nma組>NM組=Na組>NA組>Nm組>NN組,P<0.05;各成年組:M組>m組>A組>a組>N組(見表1),P﹤0.05。2.4各新生鼠組中尿酸值的比較新生鼠染毒3d及15d時(shí)采血較少,檢測不準(zhǔn)確,本實(shí)驗(yàn)未予納入結(jié)果分析。新生鼠染毒60d時(shí),Nma組尿素氮、肌酐值明顯高于其余新生鼠組(見表2),P<0.05;尿酸值在各新生鼠組中無明顯差異,P>0.05。各成年組中:M組、ma組尿素氮、肌酐、尿酸值隨著三聚氰胺(酸)灌胃時(shí)間的延長而增加,m組、A組及a組隨著時(shí)間延長,無明顯變化;N組在各時(shí)間點(diǎn)尿素氮、肌酐、尿酸相似;從組間可以看出MA組尿素氮、肌酐、尿酸值大于ma組,并且這兩組尿素氮、肌酐、尿酸值明顯大于其余成年組,P<0.05。3聚氰胺酸對大鼠肝腎的毒性三聚氰胺是一種用途廣泛的三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物,常用于制造日用器皿、裝飾貼面板等;三聚氰酸是在三聚氰胺生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的與之結(jié)構(gòu)相似的衍生物,常用作除草劑、染料、樹脂、水池消毒劑等。早期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明三聚氰胺毒性輕微,大劑量口服有利尿作用但無腎毒性;慢性和亞慢性毒理實(shí)驗(yàn)也證明其沒有腎毒性,但能致泌尿系結(jié)石;另有證據(jù)顯示三聚氰胺在哺乳動(dòng)物體內(nèi)不能被轉(zhuǎn)化代謝并通過尿液直接排出。三聚氰酸大劑量口服也有利尿作用;慢性和亞慢性毒理實(shí)驗(yàn)證明高濃度能致膀胱結(jié)石,但腎臟中無沉積物,無腎毒性。實(shí)驗(yàn)顯示:三聚氰胺低劑量在新生組及成年組不同染毒時(shí)間均無明顯晶體形成;不同染毒時(shí)間的腎體重比、尿素氮、肌酐、尿酸值也與對照組無明顯差異。三聚氰胺高劑量在新生組60d時(shí)有少量晶體形成;在成年組15d時(shí)有少量晶體形成,60d時(shí)有大量晶體形成。成年組腎體重比、尿素氮、肌酐、尿酸值與對照組比較有顯著性差異。三聚氰酸低劑量新生組及成年組均無明顯晶體形成,與對照組比較腎體重比、尿素氮、肌酐、尿酸值無顯著差異。三聚氰酸高劑量在新生組60d時(shí)有少量晶體形成,腎體重比約高于對照組,尿素氮、肌酐、尿酸值與對照組無明顯差異;成年組60d時(shí)有較多晶體形成,腎體重比明顯高于對照組,尿素氮、肌酐、尿酸值與對照組無顯著差異。以上結(jié)果提示三聚氰胺(酸)毒性輕微,但易致泌尿系結(jié)石,最終引起腎功能損害,其致結(jié)石程度與染毒時(shí)間、劑量等因素存在相關(guān)性,染毒劑量越大、時(shí)間越長,結(jié)石形成越多,腎功能損害越重。并與早期三聚氰酸研究在腎臟無晶體形成存在差異。實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)三聚氰胺或三聚氰酸在相同劑量相同染毒時(shí)間時(shí)成年組形成的晶體比新生組明顯增加,提示三聚氰胺或三聚氰酸對成年鼠的毒性大于新生鼠。實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)在同組內(nèi)相同染毒時(shí)間每只大鼠形成的晶體數(shù)量、腎體重比、尿素氮、肌酐及尿酸值等并不完全一致,其中三聚氰胺-三聚氰酸高劑量新生鼠組中,一窩老鼠在灌胃32d后出現(xiàn)死亡,而同組中另外兩窩大鼠存活時(shí)間均未超過15d;另三聚氰胺低劑量成年組一只大鼠在染毒52d后死亡,解剖發(fā)現(xiàn)腎臟出現(xiàn)大量晶體。推測三聚氰胺(酸)毒性反應(yīng)存在窩別差異和個(gè)體差異。2008年的研究報(bào)道進(jìn)食污染奶粉的尿液中檢出含有三聚氰胺和三聚氰酸,并發(fā)現(xiàn)患兒出現(xiàn)結(jié)石。早期研究表明三聚氰胺-三聚氰酸混合物致鼠的半數(shù)致死量(LD50)為4.1g/kg,三聚氰胺(LD50)為6.0g/kg,三聚氰酸(LD50)為7.7g/kg。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)當(dāng)兩者單獨(dú)投放時(shí)顯示較低的毒性,而投放混合物時(shí)在腎小管中產(chǎn)生晶體,進(jìn)一步引起類似于人的急性尿酸性腎病而導(dǎo)致腎衰。我們的研究結(jié)果與其一致,單獨(dú)三聚氰胺或三聚氰酸大劑量染毒15d以上才緩慢形成結(jié)石,染毒3d和15d的腎體重比、尿素氮、肌酐、尿酸值與對照組比較無顯著性差異;但小劑量的