嵌入式混合植皮后排異反應(yīng)受抑的免疫學(xué)機(jī)制

嵌入式混合植皮后排異反應(yīng)受抑的免疫學(xué)機(jī)制

混合皮膚移植的主要特點(diǎn)是沒有明顯的臨床異質(zhì)性現(xiàn)象。Hufnagel等通過大鼠嵌入式混合植皮實(shí)驗(yàn)推測,自體皮島可能對異體皮塊有局部保護(hù)作用,與燒傷后全身免疫狀況低下無關(guān)。本研究采用燒傷患者外周血淋巴細(xì)胞與異體表皮細(xì)胞混合培養(yǎng)模型,添加自體表皮細(xì)胞共同培養(yǎng),體外模擬混合植皮時自體皮島的局部免疫微環(huán)境,探討其免疫反應(yīng)機(jī)制。數(shù)據(jù)和方法一、人標(biāo)本的來源1.1999年7月～2000年10月入院的燒傷患者共34例,燒傷總面積36.7%～88%,Ⅲ度3%～78%TBSA。每名患者術(shù)中取無菌皮塊15cm×15cm,外周抗凝血8～10ml;正常人標(biāo)本來自東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院門診手術(shù)室包皮切除者的包皮和外周血。2.RPMI1640培養(yǎng)基和嗜熱菌蛋白酶(Sigma公司,美國),3H-TdR(中科院北京原子核研究所),胰蛋白酶(Difco公司進(jìn)口分裝,美國),抗人HLA-DR單抗(上海免疫研究所),鼠抗人HLA-DQ單抗、熒光二抗(中科院邦定公司),抗人CD3、CD4、CD8單抗(武漢病毒研究所),Beckbeta1290型β-液閃儀(Pharmacia公司,瑞典),FACSColibur型流式細(xì)胞儀(B-D公司,美國),UFX-2A型熒光顯微鏡(Nikon公司,日本)。二、方法1.d-引物吸持劑溶液過皮層采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離淋巴細(xì)胞;采用TH-Tr法分離人表皮細(xì)胞:將無菌皮塊剪至0.2cm×0.4cm大小,置0.05%嗜熱菌蛋白酶溶液中37℃2h,置0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液中37℃30min。剝離表皮層與真皮層,置D-Hank′s液中吹打。尼龍濾網(wǎng)過濾,離心洗滌后用含20%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液保存。所得懸液富含表皮基底層細(xì)胞和朗漢斯細(xì)胞。2.細(xì)胞水平檢測(1)表皮細(xì)胞與淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)模型的建立,參照文獻(xiàn)進(jìn)行。(2)燒傷患者細(xì)胞混合培養(yǎng)模型中,實(shí)驗(yàn)組為自體淋巴細(xì)胞+異體表皮細(xì)胞+自體表皮細(xì)胞,異、自體表皮細(xì)胞比例分別為1∶1,1∶0.5,1∶0.25,1∶0.1(96孔板,1=105個細(xì)胞/孔),淋巴細(xì)胞為1×105個/孔。對照組以相同比例的異體表皮細(xì)胞替代自體表皮細(xì)胞,其余情況同實(shí)驗(yàn)組,另設(shè)單純淋巴細(xì)胞組。每組3～6個復(fù)孔,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)5d,加入3H-TdR,18h后以半自動細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞,β-液閃儀測cpm值。(3)正常人細(xì)胞混合培養(yǎng)模型中淋巴細(xì)胞抑制率的檢測參照步驟(2)進(jìn)行,以正常人自體表皮細(xì)胞和自體淋巴細(xì)胞替代燒傷患者相應(yīng)細(xì)胞。(4)抑制率的計算:抑制率=(對照組cpm值-實(shí)驗(yàn)組cpm值)×100%/對照組cpm值3.自體表皮細(xì)胞的檢測取燒傷患者和異體表皮細(xì)胞,分別加入HLA-DQ單抗(按1∶20稀釋,每1×106個細(xì)胞加入20μl),置于4℃30min。用1640培養(yǎng)基洗滌后,按異、自體表皮細(xì)胞1∶0.5的比例加入患者自體淋巴細(xì)胞(1×105個/孔)中共培養(yǎng),并設(shè)對照組(同2)和不加HLA-DQ單抗封閉的陰性對照,每組3～6個復(fù)孔。6d后測cpm值。4.hla-dr表達(dá)陽性率(1)在燒傷患者(5例)與正常人(5例)表皮細(xì)胞懸液中,分別加入鼠抗人HLA-DR單抗和熒光二抗(間接免疫熒光法),用流式細(xì)胞儀檢測該懸液,比較HLA-DR分子表達(dá)的陽性率。(2)燒傷患者和正常人淋巴細(xì)胞中HLA-DR分子表達(dá)的比較方法同上。5.tba的取血分離細(xì)胞CD3、CD4、CD8分子表達(dá)的比較:燒傷患者18例,燒傷面積36.7%～65%TBSA,于術(shù)前(傷后2～3周)取血分離淋巴細(xì)胞;健康志愿獻(xiàn)血者15例,取血分離淋巴細(xì)胞。在兩者的淋巴細(xì)胞中分別加入CD3、CD4、CD8單抗和熒光二抗,采用間接免疫熒光法,在熒光顯微鏡下檢測表達(dá)陽性的細(xì)胞比例。hla-dr的表達(dá)1.燒傷患者自、異體表皮細(xì)胞與淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)中,各實(shí)驗(yàn)組cpm值與對照組相比明顯降低(P<0.01);淋巴細(xì)胞增殖抑制率達(dá)56.6%～83.1%,隨自體表皮細(xì)胞添加比例的降低呈下降趨勢(表1)。2.正常人自、異體表皮細(xì)胞與淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)中,實(shí)驗(yàn)組cpm值與對照組相比差異無顯著性意義(P>0.05,表2);但各cpm值與表1相應(yīng)值比較,差異有非常顯著性意義(P<0.01)。3.HLA-DQ單抗封閉試驗(yàn)中,封閉組和未封閉組淋巴細(xì)胞增殖都明顯受抑。兩組之間抑制率比較差異無顯著性意義(P>0.05,表3)。4.(1)表皮細(xì)胞中HLA-DR分子表達(dá)的比較:5份正常人標(biāo)本中,僅2份HLA-DR分子表達(dá)陽性,陽性細(xì)胞率分別是0.35%、0.51%。燒傷患者標(biāo)本中,HLA-DR表達(dá)陽性細(xì)胞率為(1.25±0.13)%,兩組比較差異有顯著性意義(P<0.05);(2)淋巴細(xì)胞中HLA-DR分子表達(dá)的比較:燒傷患者與正常人淋巴細(xì)胞標(biāo)本中,HLA-DR表達(dá)陽性細(xì)胞率差異無顯著性意義(P>0.05)。5.燒傷患者與正常人淋巴細(xì)胞中CD3、CD4、CD8表達(dá)的比較:燒傷患者淋巴細(xì)胞中CD8表達(dá)陽性率為(30.76±1.85)%,正常人為(23.74±2.56)%,兩者比較差異有非常顯著性意義(P<0.01);燒傷患者CD4表達(dá)陽性率為(29.57±2.32)%,正常人為(37.60±2.89)%,兩者比較差異有非常顯著性意義(P<0.01);燒傷患者CD4/CD8比值為0.97±0.10,正常人為1.58±0.13,兩者比較差異有非常顯著性意義(P<0.01);燒傷患者CD3表達(dá)陽性率為(59.83±2.56)%,正常人為(62.34±3.41)%,兩者比較差異無顯著性意義(P>0.05)。自體皮島的細(xì)胞增殖受抑本研究利用自、異體表皮細(xì)胞與淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)模型,體外模擬大面積燒傷患者自、異體皮混合移植時,自體皮島的局部免疫微環(huán)境,并對混合移植時的免疫低反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了初步探討。結(jié)果表明,大面積燒傷患者的淋巴細(xì)胞與異體表皮細(xì)胞共培養(yǎng)時,補(bǔ)加一定比例患者自體表皮細(xì)胞,其淋巴細(xì)胞的同種異體增殖反應(yīng)明顯受抑,提示燒傷后混合皮膚移植時,自體皮島的局部免疫微環(huán)境中同種異體反應(yīng)不明顯。進(jìn)一步的研究顯示,正常人的表皮細(xì)胞并不能抑制自身淋巴細(xì)胞對異體表皮細(xì)胞的同種異體增殖反應(yīng)。淋巴細(xì)胞的增殖受抑現(xiàn)象可能與以下因素有關(guān):(1)燒傷患者淋巴細(xì)胞的特殊免疫狀況。本實(shí)驗(yàn)顯示,大面積燒傷患者淋巴細(xì)胞的同種增殖能力遠(yuǎn)低于正常人。淋巴細(xì)胞中HLA-DR分子的表達(dá)與正常人比較無明顯差異,但CD8表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)明顯高于正常人,CD4陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于正常人。提示增殖受抑現(xiàn)象與燒傷患者淋巴細(xì)胞中參與免疫應(yīng)答的DR分子無明顯相關(guān),而與淋巴細(xì)胞的增殖能力和淋巴細(xì)胞中抑制性細(xì)胞亞群增高有關(guān)。(2)燒傷患者表皮細(xì)胞的特殊免疫狀況。用HLA-DQ單抗封閉燒傷患者自體表皮細(xì)胞上的